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方法文章

Xenopus laevis 胚胎中的面部移植

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DOI：

10.3791/50697

⸱

2014年3月26日

 ,  , 
1Biological Sciences in Dental Medicine, Harvard University, 2Biology Department, Massachusetts Institute of Technology, 3Whitehead Institute, Massachusetts Institute of Technology, 4Biology Department, Virginia Commonwealth University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

已建立一种在Xenopus laevis胚胎之间移植“极端前部区域”面部组织的技术。该技术可将组织从一种基因表达背景转移至另一种基因表达背景，从而研究颅面发育的局部需求以及面部不同区域之间的信号相互作用。

摘要

颅面出生缺陷的发生率为每700例活产婴儿中就有1例，但由于对颅面发育过程了解有限，其病因很少明确。为了确定信号通路和组织在面部发育模式形成过程中所起作用的位置，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中开发了一种“面部移植”技术。在尾芽期，从供体胚胎中取出一片预定面部组织区域（即“极端前部区域”（EAD）），并将其移植到同期宿主胚胎中，而该宿主胚胎中相应区域已被切除。该方法可用于构建嵌合面部，使宿主或供体组织中某个基因的功能出现缺失或获得，和/或包含谱系标记。在移植组织愈合后，持续观察后续发育结果，从而揭示信号通路在供体或周围宿主组织中的作用。Xenopus 是研究面部发育的有价值模型，因其面部区域较大且易于进行显微操作。由于发育进程迅速，可在较短时间内对大量胚胎进行分析。在爪蟾中获得的研究发现与人类发育相关，因为颅面发育过程在 Xenopus 与哺乳动物之间具有保守性。

引言

为了理解颅面出生缺陷的潜在机制1-2，必须明确颅面发育过程中关键的组织及其信号贡献。在非洲爪蟾（Xen游戏副本）中，面部的一部分，包括口和鼻孔，来源于“最前域”（Extreme Anterior Domain, EAD），该区域的外胚层与内胚层直接相邻3-4。EAD 还作为一个信号中心，影响周围组织的发育，包括形成颌部和其他面部区域的颅神经嵴5。为了鉴定参与 EAD 功能的基因，研究人员开发了一种“面部移植”技术，即将供体组织移植到受体胚胎中，前提是先移除受体中相应的区域。移植后，评估由此产生的面部发育情况。因此，可以在局部分析特定基因在 EAD 中的功能缺失（LOF）或功能获得（GOF）效应 ，而头部和身体其余部分则由野生型组织构成。也可进行反向移植实验，即将野生型组织移植到全身性 LOF 或 GOF 基因突变的胚胎中。移植技术已在 Xenopus 和鸡胚研究中广泛应用6。例如，Xenopus 的移植实验曾用于研究同源性神经诱导、晶状体和神经发育潜能以及神经嵴迁移7-10。鹌鹑-鸡嵌合移植则被用于分析前部神经板、前部神经嵴、神经嵴以及颅骨的发育11-14。这是首次用于研究 Xenopus 颅面发育的移植技术。该技术已揭示 Wnt 抑制剂 Frzb1 和 Crescent 在调控预定口区基底膜形成中的新功能5。Xenopus laevis 是研究颅面发育的理想模型，因其胚胎较大、体外发育，且面部清晰可见，便于进行显微操作和发育过程的成像观察。颅面发育的潜在机制在进化上保守，表明在爪蟾中获得的研究发现可为人类发育提供重要启示4,15-16。

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方案

1. 试剂的准备

  1. 10x MBS：配制1 L的10倍改良巴氏生理盐水（Modified Barth's Saline, MBS）溶液17。参见表1中的试剂、成分及配制说明。所有溶液均使用蒸馏水配制。在烧杯中使用磁力搅拌器搅拌，直至完全溶解。所有溶液均应在室温下配制。
  2. 1x MBS：取100 ml 10x MBS溶液，加入900 ml蒸馏水中，配制成1 L的1x MBS溶液。再加入0.7 ml 1 M CaCl2溶液。
  3. 0.1x MBS：用1x MBS溶液稀释，配制1 L的0.5x MBS溶液和2 L的0.1x MBS溶液。向1 L的0.1x MBS溶液中加入1 ml浓度为10 mg/ml的庆大霉素溶液。含庆大霉素的0.1x MBS溶液将用于胚胎的长期培养。
  4. Ficoll/MBS：将15克Ficoll 400加入500 ml 0.5x MBS溶液中，剧烈混合。放入磁力搅拌子，持续搅拌直至Ficoll完全溶解（需数小时）。
  5. 70%乙醇：用蒸馏水将100%乙醇稀释至70%乙醇。

2. 准备玻璃手术工具

  1. 针头制备：将毛细玻璃管装入拉针仪。
    1. 根据表2所示参数设置拉针仪进行拉制：拉针仪参数设置。该参数适用于Sutter Instrument Co.公司生产的P-80/PC型微电极拉针仪及相应的毛细玻璃管，具体信息见“特定试剂与设备表”。但这些参数仅适用于Sutter拉针仪，若使用其他型号仪器需相应调整。可通过仪器制造商推荐的梯度测试法确定最佳参数。
    2. 预先拉制4–6根针头。需将针头折断，使玻璃尖端柔韧如毛发的部分完全去除，通常去除长度为2–3 mm。最终尖端应具有一定的刚性，但仍足够细窄，可作为切割工具使用。理想针头形态参见图1A。
    3. 将制备好的针头存放于培养皿中，皿中央放置一条黏土条。将每根针的杆部插入黏土中固定，使易损的尖端远离皿底和侧壁，避免损坏。
  2. 其他工具准备：准备玻璃盖玻片、一对长柄标准型镊子、本生灯以及3–4根玻璃巴斯德吸管（规格为5¾英寸）。
  3. 吸管工具制备：点燃本生灯，用镊子夹住玻璃巴斯德吸管的尖端，将其置于火焰的蓝色区域，同时缓慢旋转，使尖端熔化并完全封闭，形成光滑圆钝的封闭端。此圆钝密封端后续用于在盛放胚胎的黏土培养皿中压出凹槽。参见图1B。
  4. 玻璃桥制备：使用长柄标准型镊子小心地从盖玻片上掰下约3 mm × 3 mm的小片。用镊子夹住该玻璃碎片，将其置于火焰中加热，直至四个边缘软化并向下方弯曲，形成微小的玻璃穹顶结构，边缘应不再锋利。参见图1C。
  5. 将玻璃桥存放于铺有黏土的培养皿底部，插入时使边缘朝下、顶部露出黏土表面。插入时力度不宜过大，以防玻璃桥断裂；也不应将玻璃桥完全埋入黏土中，以免难以取出。经火焰灼烧或70%乙醇消毒后，玻璃桥可在不同实验间重复使用。

3. 胚胎手术的准备工作

  1. 用塑形黏土衬里一个小型 60 mm 塑料培养皿。每次使用后，需用蒸馏水彻底清洗培养皿和黏土表面，再用 70% 乙醇清洗。
    注意：使用红色、白色或黄色 Van Aken Plastalina 塑形黏土，可在当地玩具店或美术用品店购买。不推荐使用黑色黏土，因其会释放残留物。
  2. 向培养皿中加入 3% Ficoll 0.5x MBS 溶液。较高的盐浓度可防止组织解离，而多糖 Ficoll 有助于增加溶液黏度，从而帮助固定胚胎面部位置。
  3. 使用火焰灼烧过的巴斯德移液管工具（见图 1），在黏土上压出浅凹陷，深度约 2–3 mm，相当于 20 期胚胎体部的深度。在培养皿两侧各制作 20–30 个凹陷，间距 1–2 mm，共 40–60 个凹陷。用镊子在黏土上刻写字母标记，一侧标记为 LOF/GOF，另一侧标记为野生型。

4. 胚胎移植前的准备

  1. 获取与培养 非洲爪蟾 使用标准方法处理胚胎17有关青蛙饲养管理的详细描述，请参见 Sive 等17
    1. 实验前48小时，从雌性青蛙中获取卵子并进行操作 体外 受精
    2. 注射0.5–1 ng带帽的膜GFP mRNA，以及任何所需的mRNA或反义吗啉代修饰的反义寡核苷酸（"吗啉寡核苷酸"在单细胞期或双细胞期的两个细胞中进行显微注射。单细胞期持续约70–90分钟。每次注射总体积为1–3 nl。除编码荧光蛋白的RNA（如GFP或RFP RNA）外，也可注射FITC标记的吗啉代寡核苷酸（morpholino）或荧光标记的葡聚糖。荧光信号对于判断移植组织是否愈合以及是否保留在头部至关重要。
    3. 可通过线性化的质粒使用 mMessage mMachine SP6 或 T7 试剂盒制备加帽的 mRNA。吗啉代寡核苷酸（Morpholinos）可由 Gene Tools LLC 公司设计并订购。每种基因所需吗啉代寡核苷酸的用量必须根据预期效应 individually 确定。18.
    4. 将注射后的胚胎置于15 °C下保存48小时，直至发育至19–20期。（所有后续步骤中，胚胎分期均依据《正常发育时期表》进行） 非洲爪蟾 由 Nieuwkoop 和 Faber19.)
      注意：手术当天，受体与供体胚胎的发育阶段必须相差不超过一个时期，以确保移植效果最佳。然而，注射了吗啉寡核苷酸（morpholinos）的胚胎"吗啉寡聚核苷酸干扰个体"）有时比野生型或对照形态发生胚胎发育更慢，因此有必要协调实验，使形态发生胚胎与野生型胚胎处于相同发育阶段。可在操作前将形态发生胚胎在较高温度下培养12-24小时。为了提高找到发育阶段匹配胚胎的可能性，可将胚胎置于不同温度下培养。实验前24小时，应将胚胎分至多个培养皿中，形态发生胚胎置于18-20 °C，野生型胚胎置于15-18 °C。
  2. 在移植实验当天，将胚胎从15 °C培养箱中取出，并根据Nieuwkoop和Faber分期法进行分期19如果它们的发育阶段早于晚期神经胚期（19期），则在室温下放置1-2小时，直至达到19期。
  3. 在荧光显微镜下观察注射后的胚胎，选择荧光均匀且明亮的胚胎用于实验。
  4. 清除操作区域附近的杂物和可能的污染物。用70%乙醇擦拭操作台面、体视显微镜及所有工具。
  5. 当胚胎发育至19期时，在体视显微镜下使用#5/45杜蒙特镊子去除卵黄膜。
    1. 去除20-30个供体和受体胚胎的卵黄膜。
    2. 在进行最初的数次面部移植实验时，每种条件下应先用若干胚胎进行练习。该方法具有挑战性，需经过仔细练习，方能在更大规模的实验中快速且成功地应用。熟练后可逐步达到每次实验完成20例移植。
  6. 使用剪去尖端的塑料刻度移液管（使开口远大于胚胎，至少几毫米）将宿主胚胎转移至操作皿中。注意避免胚胎接触气泡或液面，否则胚胎会因表面张力而破裂。
  7. 使用 #5/45 镊子将胚胎插入黏土凹槽中，使胚胎的后部埋入黏土。用镊子轻轻闭合胚胎基部周围的黏土，使胚胎顶部四分之一部分（即头部）露出凹槽。
  8. 将所有宿主胚胎固定在凹槽中后，移至培养板的另一侧，开始将供体胚胎插入其对应的凹槽中。重复操作，将胚胎逐一固定在孔内。

5. 面部移植手术的实施

  1. 切割刀：用于切除供体EAD组织的切割刀，可使用适当折断的玻璃毛细管针（见步骤2.3及图1）。
    注意：可直接用手指夹持毛细管（手较小者操作较为方便），也可将针固定于昆虫针 holder 中。亦可用装入针 holder 的电磨钨针17替代毛细管针。具体推荐的针 holder 和钨针请参见试剂与设备表。
  2. 在体视显微镜下，将针插入胚胎头部，位于胶腺左侧。针应插入较深，使其从胚胎外部穿过头部进入前肠。若需移植完整的EAD组织，切割应从胚胎外部延伸至前肠。若仅进行外胚层移植，则切割应较浅，仅穿过外胚层即可。
    1. 将针从头部左侧快速 flick 至右侧，横跨整个胶腺宽度。flick 动作至关重要，因其可实现干净利落的切割。切割技术概要见图2A，切割示例见图2B。胶腺和眼睛是切割过程中的重要解剖标志。切割顺序不影响结果，可根据操作者习惯或利手性自行调整。
  3. 将针置于前一切口起点，即胶腺左边界处，向上 flick 针直至到达左眼底部，从而形成一条从胶腺左边界至左眼底部的垂直切口。
  4. 将针置于胶腺右边界处，向上 flick 针直至到达右眼底部，从而形成一条从胶腺右边界至右眼底部的垂直切口。
  5. 为完全切除组织，将针从左眼底部 flick 至右眼底部，形成一条水平切口，使组织完全游离。切口可从胚胎外部延伸至前肠，从而在EAD外植体中包含外胚层和内胚层。或者，也可采用较浅切口以获得仅含外胚层的EAD移植组织。EAD组织移除后，应在胚胎表面形成一个从外部通向前肠的矩形缺损区，纵向范围自胶腺至眼睛稍下方，横向范围自左眼内侧边界至右眼内侧边界。见图2Bb。
  6. 轻轻将切除的组织推至针尖，并通过缓冲液将其提起，转移至培养皿中含受体胚胎的区域。切勿使组织暴露于空气中，以免造成损伤。
  7. 在受体胚胎上以相同方式切除对应组织，操作同供体。可丢弃受体EAD外植体，或保存用于反向移植至供体面部。
  8. 使用#5/45镊子将供体外植体插入受体胚胎的缺损区域。
  9. 当供体组织正确就位并完全插入后，小心地将玻璃桥（见图1和图2Bc）置于胚胎面部上方，以固定移植组织。玻璃桥两端应插入琼脂中以固定位置。桥应轻柔施加压力，使移植组织与受体头部表面齐平，既不突出于头部之外，也不陷入头部深处。盖玻片可使头部轻微压平，但需注意避免因压力过大而损伤胚胎。移植操作应在5分钟内完成。
    注意：经验丰富的研究人员可在2–3小时内完成约二十次移植实验。在此期间，胚胎将由20–22期发育。在21或22期完成面部移植不影响实验结果。后期移植（22–26期）亦可进行，但难度增加，因随着颅神经嵴细胞迁移至面部，无神经嵴的EAD中线区域变窄。各次移植之间的一致性至关重要。

6. 面部移植术后恢复

  1. 愈合通常需要 2-3 小时。将胚胎置于室温下静置，在黏土凹槽中保持不动，用玻璃桥固定供体组织的位置。
  2. 移植组织愈合后，小心移除玻璃桥，用镊子清除胚胎基部周围的黏土，并使用带刻度的塑料移液管轻轻将胚胎从凹槽中吸出。
  3. 将胚胎放入适当标记的培养皿中，培养皿中加入一半体积的含庆大霉素的洁净 0.1x MBS 溶液。
  4. 在 15 °C 或 18 °C 下培养胚胎数天，直至其发育至摄食期蝌蚪阶段（阶段 40），此时可对面部表型进行评分。
    1. 含庆大霉素的 0.1x MBS 溶液应每天更换，及时移除死亡胚胎，以防止污染并避免其他胚胎死亡。
    2. 阶段 40 时口部开始打开。在阶段 40-41 期间，需通过观察荧光确认移植组织仍保持愈合并处于原位。移植组织偶尔会脱落，因此必须确保所有用于评分的胚胎均保有位于原位的供体组织。

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结果

移植组织在移植后应完全插入宿主头部，如图3A所示，并在胚胎面部适当放置玻璃桥，如图2Bc所示。移植的供体组织必须与宿主切口大小匹配，以确保移植成功。移植的EAD组织不应以任何方式从头部突出，如图3B和图3C所示。此外，面部移植组织相对于其在供体体内的原始位置不应发生旋转，如图3D所示。数小时后，移植组织及其周围面部应开始愈合，至次日，胚胎应呈现如图4A和图4A'所示的示例形态。在荧光下可观察到，移植组织仍保持在原位，如图4B所示。在发育至41期时，移植的对照组织将参与口部结构的形成，并保持荧光绿色，如图4B'所示。将野生型EAD组织移植至野生型宿主中，应产生与未受干扰的野生型胚胎相比正常的面部结构。然而，当使用功能缺失（LOF）或功能获得（GOF）的供体组织时，面部虽可愈合并保留在头部，但可能产生也可能不产生正常的颅面结构，如Dicki...

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讨论

关键步骤与局限性： 面部移植的EAD手术程序耗时且劳动密集。需要反复练习、稳定的手部操作和熟练的技巧才能掌握。面部移植方案依赖于研究人员高效地切除并移植组织的能力。若将移植物植入受体面部所用时间过长，受体面部组织将开始收缩并愈合。可使用镊子轻柔地扩张面部区域。然而，若伤口已发生明显收缩，则移植物愈合效果会变差，可能需要缩小移植物尺寸以适配受体面部的缺损区域。移植物的大小和形状必须大致匹配受体面部腔隙的大小和形状，才能实现成功植入。

面部移植在19至22期之间进行时成功率最高，且应选择发育阶段相匹配的胚胎。在22至26期之间进行的较晚阶段面部移植虽然可行，但操作更具挑战性，可能会干扰神经嵴细胞向面部两侧的迁移，因为从22期到26期，无神经嵴的中线区域显著变窄。

为了使移植达到最佳效果，受体和供体必须处于相似的发育阶段。理想情况下，它们应处于完全相同的阶段，最低限度也应彼此相差不超过几个小时。注射了反义RNA吗啉代寡核苷酸（"morphants"）的胚胎有时比野生型或对照吗啉代胚胎发育更慢，因此需要将...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

感谢 Radek Sindelka 提供的帮助，以及 Cas Bresilla 在蛙类饲养和胚胎制备方面的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）通过资助号 R01DE021109 支持 H.L.S.。Laura Jacox 的研究得到了哈佛大学赫歇尔·史密斯研究生奖学金以及美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）F30 个人奖学金项目 F30DE022989-01 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
巴斯德移液管VWR14672-400青绿色玻璃 
5 3/4 英寸规格带棉塞
刻度移液管VWR16001-180一次性 
#5/45 镊子Dupont 医疗公司旗下 Fine Science Tools11251-3545° 弯角
标准型镊子Fine Science Tools11000-20直头；锯齿状尖端；不锈钢材质
毛细管（用于制针）FHC30-30-1硼硅酸盐玻璃，外径 1.0 mm × 内径 0.5 mm / 纤维芯
盖玻片 VWR48393 25224 × 60 mm 显微盖玻片；
Ficoll 400Sigma-AldrichF9378
拉针仪 Sutter Instrument Co拉针仪：已停产；灯丝型号：FB300B最相似且当前可购得的 拉针仪为 P-97 型；灯丝使用 Sutter 3.00 mm 方形盒装灯丝，宽度 3.0 mm。
Model P-80Flaming / Brown 微量移液管拉针仪
体视显微镜Zeiss
Fostec 体视显微镜照明系统Fostec使用带有两个光纤臂的光源箱。  
镀镍持针器Fine Science Tools26018-17夹口直径：0–1 mm
Moria 镀镍持针器Fine Science Tools26016-12夹口直径：0–1 mm
钨针Fine Science Tools10130-05杆径 0.125 mm
Van Aken PlastalinaBlick#33268-2981
白、红或黄色油泥
mMessage mMashine SP6 或 T7 体外转录试剂盒AmbionAM1340

参考文献

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