已建立一种在Xenopus laevis胚胎之间移植“极端前部区域”面部组织的技术。该技术可将组织从一种基因表达背景转移至另一种基因表达背景，从而研究颅面发育的局部需求以及面部不同区域之间的信号相互作用。
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方法文章
Xenopus laevis 胚胎中的面部移植
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
颅面出生缺陷的发生率为每700例活产婴儿中就有1例，但由于对颅面发育过程了解有限，其病因很少明确。为了确定信号通路和组织在面部发育模式形成过程中所起作用的位置，在非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎中开发了一种“面部移植”技术。在尾芽期，从供体胚胎中取出一片预定面部组织区域（即“极端前部区域”（EAD）），并将其移植到同期宿主胚胎中，而该宿主胚胎中相应区域已被切除。该方法可用于构建嵌合面部，使宿主或供体组织中某个基因的功能出现缺失或获得，和/或包含谱系标记。在移植组织愈合后，持续观察后续发育结果，从而揭示信号通路在供体或周围宿主组织中的作用。Xenopus 是研究面部发育的有价值模型，因其面部区域较大且易于进行显微操作。由于发育进程迅速，可在较短时间内对大量胚胎进行分析。在爪蟾中获得的研究发现与人类发育相关，因为颅面发育过程在 Xenopus 与哺乳动物之间具有保守性。
引言
为了理解颅面出生缺陷的潜在机制1-2，必须明确颅面发育过程中关键的组织及其信号贡献。在非洲爪蟾（Xen游戏副本）中，面部的一部分，包括口和鼻孔，来源于“最前域”（Extreme Anterior Domain, EAD），该区域的外胚层与内胚层直接相邻3-4。EAD 还作为一个信号中心，影响周围组织的发育，包括形成颌部和其他面部区域的颅神经嵴5。为了鉴定参与 EAD 功能的基因，研究人员开发了一种“面部移植”技术，即将供体组织移植到受体胚胎中，前提是先移除受体中相应的区域。移植后，评估由此产生的面部发育情况。因此，可以在局部分析特定基因在 EAD 中的功能缺失（LOF）或功能获得（GOF）效应 ，而头部和身体其余部分则由野生型组织构成。也可进行反向移植实验，即将野生型组织移植到全身性 LOF 或 GOF 基因突变的胚胎中。移植技术已在 Xenopus 和鸡胚研究中广泛应用6。例如，Xenopus 的移植实验曾用于研究同源性神经诱导、晶状体和神经发育潜能以及神经嵴迁移7-10。鹌鹑-鸡嵌合移植则被用于分析前部神经板、前部神经嵴、神经嵴以及颅骨的发育11-14。这是首次用于研究 Xenopus 颅面发育的移植技术。该技术已揭示 Wnt 抑制剂 Frzb1 和 Crescent 在调控预定口....
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方案
1. 试剂的准备
- 10x MBS：配制1 L的10倍改良巴氏生理盐水（Modified Barth's Saline, MBS）溶液17。参见表1中的试剂、成分及配制说明。所有溶液均使用蒸馏水配制。在烧杯中使用磁力搅拌器搅拌，直至完全溶解。所有溶液均应在室温下配制。
- 1x MBS：取100 ml 10x MBS溶液，加入900 ml蒸馏水中，配制成1 L的1x MBS溶液。再加入0.7 ml 1 M CaCl2溶液。
- 0.1x MBS：用1x MBS溶液稀释，配制1 L的0.5x MBS溶液和2 L的0.1x MBS溶液。向1 L的0.1x MBS溶液中加入1 ml浓度为10 mg/ml的庆大霉素溶液。含庆大霉素的0.1x MBS溶液将用于胚胎的长期培养。
- Ficoll/MBS：将15克Ficoll 400加入500 ml 0.5x MBS溶液中，剧烈混合。放入磁力搅拌子，持续搅拌直至Ficoll完全溶解（需数小时）。
- 70%乙醇：用蒸馏水将100%乙醇稀释至70%乙醇。
2. 准备玻璃手术工具
- 针头制备：将毛细玻璃管装入拉针仪。
- 根据表2所示参数设置拉针仪进行拉制：拉针仪参数设置。该参数适用于Sutt....
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结果
移植组织在移植后应完全插入宿主头部，如图3A所示，并在胚胎面部适当放置玻璃桥，如图2Bc所示。移植的供体组织必须与宿主切口大小匹配，以确保移植成功。移植的EAD组织不应以任何方式从头部突出，如图3B和图3C所示。此外，面部移植组织相对于其在供体体内的原始位置不应发生旋转，如图3D所示。数小时后，移植组织及其周围面部应开始愈合，至次日，胚胎应呈现如图4A和图4A'所示的示例形态。在荧光下可观察到，移植组织仍保持在原位，如图4B所示。在发育至41期时，移植的对照组织将参与口部结构的形成，并保持荧光绿色，如图4B'所示。将野生型EAD组织移植至野生型宿主中，应产生与未受干扰的野生型胚胎相比正常的面部结构。然而，当使用功能缺失（LOF）或功能获得（GOF）的供体组织时，面部虽可愈合并保留在头部，但可能产生也可能不产生正常的颅面结构，如Dicki.......
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讨论
关键步骤与局限性： 面部移植的EAD手术程序耗时且劳动密集。需要反复练习、稳定的手部操作和熟练的技巧才能掌握。面部移植方案依赖于研究人员高效地切除并移植组织的能力。若将移植物植入受体面部所用时间过长，受体面部组织将开始收缩并愈合。可使用镊子轻柔地扩张面部区域。然而，若伤口已发生明显收缩，则移植物愈合效果会变差，可能需要缩小移植物尺寸以适配受体面部的缺损区域。移植物的大小和形状必须大致匹配受体面部腔隙的大小和形状，才能实现成功植入。
面部移植在19至22期之间进行时成功率最高，且应选择发育阶段相匹配的胚胎。在22至26期之间进行的较晚阶段面部移植虽然可行，但操作更具挑战性，可能会干扰神经嵴细胞向面部两侧的迁移，因为从22期到26期，无神经嵴的中线区域显著变窄。
为了使移植达到最佳效果，受体和供体必须处于相似的发育阶段。理想情况下，它们应处于完全相同的阶段，最低限度也应彼此相差不超过几个小时。注射了反义RNA吗啉代寡核苷酸（"morphants"）的胚胎有时比野生型或对照吗啉代胚胎发育更慢，因此需要将.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Radek Sindelka 提供的帮助，以及 Cas Bresilla 在蛙类饲养和胚胎制备方面的协助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）通过资助号 R01DE021109 支持 H.L.S.。Laura Jacox 的研究得到了哈佛大学赫歇尔·史密斯研究生奖学金以及美国国家牙科与颅面研究所（NIDCR）F30 个人奖学金项目 F30DE022989-01 的资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 巴斯德移液管 | VWR | 14672-400 | 青绿色玻璃 |
| 5 3/4 英寸规格 | 带棉塞 | ||
| 刻度移液管 | VWR | 16001-180 | 一次性 |
| #5/45 镊子 | Dupont 医疗公司旗下 Fine Science Tools | 11251-35 | 45° 弯角 |
| 标准型镊子 | Fine Science Tools | 11000-20 | 直头；锯齿状尖端；不锈钢材质 |
| 毛细管（用于制针） | FHC | 30-30-1 | 硼硅酸盐玻璃，外径 1.0 mm × 内径 0.5 mm / 纤维芯 |
| 盖玻片 | VWR | 48393 252 | 24 × 60 mm 显微盖玻片； |
| Ficoll 400 | Sigma-Aldrich | F9378 | |
| 拉针仪 | Sutter Instrument Co | 拉针仪：已停产；灯丝型号：FB300B | 最相似且当前可购得的 拉针仪为 P-97 型；灯丝使用 Sutter 3.00 mm 方形盒装灯丝，宽度 3.0 mm。 |
| Model P-80 | Flaming / Brown 微量移液管拉针仪 | ||
| 体视显微镜 | Zeiss | ||
| Fostec 体视显微镜照明系统 | Fostec | 使用带有两个光纤臂的光源箱。 | |
| 镀镍持针器 | Fine Science Tools | 26018-17 | 夹口直径：0–1 mm |
| Moria 镀镍持针器 | Fine Science Tools | 26016-12 | 夹口直径：0–1 mm |
| 钨针 | Fine Science Tools | 10130-05 | 杆径 0.125 mm |
| Van Aken Plastalina | Blick | #33268-2981 | |
| 白、红或黄色油泥 | |||
| mMessage mMashine SP6 或 T7 体外转录试剂盒 | Ambion | AM1340 |
参考文献
- Gorlin, R. J., Cohen, M., Levin, L. Syndromes of the head and neck. , Oxford University Press. UK. (1990).
- Trainor, P. Craniofacial birth defects: The role of neural crest cells in the etiology and pathogenesis of Treacher Collins syndrome and the potenti....
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重印与许可
