通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

摘要

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。

摘要

检测和研究关键致癌突变的努力已被证明有助于为癌症患者提供适当的治疗。高通量、大规模并行的“下一代”测序技术的发展促进了众多此类突变的发现。为了提高该技术在临床和转化研究中的实用性，测序平台必须具备高通量、低成本的特点，并能够兼容福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，这些样本可能仅能提取出少量降解或受损的DNA。本文描述了条形码标记和多重DNA文库的制备，随后通过杂交捕获靶向外显子，以在新鲜冷冻和FFPE肿瘤组织中利用大规模并行测序检测与癌症相关的突变。该方法可识别序列突变、拷贝数变异以及涉及所有靶向基因的选择性结构重排。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而对检测低频突变具有高灵敏度。

引言

在关键癌基因和肿瘤抑制基因中识别"驱动"性肿瘤遗传事件，在多种癌症的诊断与治疗中发挥着至关重要的作用¹。近年来，大规模研究利用大规模并行的"下一代"测序技术，已成功识别出许多与癌症相关的基因²。然而，这些测序平台通常需要从新鲜冷冻组织中提取大量DNA，从而在利用保存组织（如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本）进行DNA突变的表征与分析时构成了主要限制。改进对FFPE肿瘤样本中"可干预"基因组信息进行高效且可靠表征的技术，将有助于对以往存档的样本进行回顾性分析，并进一步推动癌症管理向个体化方向发展。

传统上，分子诊断实验室依赖耗时且通量较低的方法（如Sanger测序和实时PCR）进行DNA突变谱分析。近年来，已开发出更高通量的方法，利用多重PCR或质谱基因分型技术来研究关键癌症基因中的复发性体细胞突变^3-5。然而，这些方法存在局限性，仅能检测预先设定的"热点"突变，因此不适合检测肿瘤抑制基因中的失活突变。大规模并行测序相比这些策略具有多项优势，包括能够检测整个外显子区域中的常见和罕见突变，能够揭示其他类型的基因组改变（如拷贝数增加和缺失），以及在异质性样本中具有更高的检测灵敏度^{6, 7}。全基因组测序是突变发现最全面的方法，但其相对昂贵，且在数据分析和存储方面需要较大的计算资源。

方案

1. DNA 和试剂的准备

注意：本方案描述了24个样本的同时处理与分析（例如 12个肿瘤/正常组织配对），但也可根据需要调整用于更小或更大的样本批次。DNA样本可来源于FFPE组织、新鲜冷冻组织、细胞学标本或血液。通常，来自同一患者的肿瘤组织和正常组织将一并进行分析，以区分体细胞突变与遗传性多态性。本方案自DNA提取完成后即开始。

1. 将每个样本提取的 DNA 分装 50–250 ng（推荐使用 250 ng），用 1× Tris-EDTA（pH 8.0）缓冲液稀释至终体积为 50 µl，分装至独立的 Covaris 圆底管中。
2. 在 Covaris E220 仪器上对 DNA 进行剪切，设置参数如下：持续 360 秒，占空比为 10，峰值入射功率为 175 PIP，每周期微泡次数为 200。
3. 将 AMPure XP 磁珠（表 2）置于室温下解冻。所有缓冲液和酶在使用前需在冰上解冻。

2. 文库构建 - 末端修复模块

1. 在无菌微量离心管中，按每份样品配制末端修复主混合液：10 µl 10x NEBNext末端修复反应缓冲液（表2）、5 µl NEBNext末端修复酶混合液（表2）、35 µl 无菌无核酸酶水（....

结果

使用针对279个癌症基因全部蛋白编码外显子的探针，对一个包含24个带条形码的序列文库（12对肿瘤-正常样本）的样本池进行捕获，并在HiSeq 2000流动池的单个通道中以2 × 75 bp的双端读长进行测序。肿瘤与正常文库以2:1的比例混合。冷冻肿瘤DNA样本池的样本性能指标如图1所示，包括比对率、片段大小分布、靶向捕获特异性以及靶区域平均覆盖深度。示例性的体细胞突变、插入、缺失和拷贝数变异如图2-4所示。

图1. 测序性能指标的代表性图示。a.......

讨论

我们的IMPACT检测具有高比对率、高靶向率、高靶标覆盖度以及高灵敏度，可有效检测突变、插入缺失（indels）和拷贝数变异。我们已证实，即使在DNA输入量较低的情况下，IMPACT检测仍可对新鲜冷冻样本和存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行DNA测序。通过对关键癌症相关基因的外显子进行靶向测序，可实现这些最重要基因外显子的极深测序覆盖，从而最大限度地提高对低频突变的检出能力。条形码标记与多重测序技术的应用，可实现更高通量、更低的单样本成本以及更少的DNA输入量需求。

靶向测序方法的一个优势在于，可以优化捕获探针，使得所有外显子在突变检测中均被均匀且充分地覆盖。如表1所示，我们的设计涵盖了279个基因中的4,535个外显子。经过对设计方案的多次迭代优化，典型的测序实验中，覆盖深度低于整个样本中位覆盖深度20%的外显子比例不超过2%。因此，对于测序深度达到500x的肿瘤样本（如图1所示的保守估计），>98%的外显子将被>100x的深度覆盖，从而确保对低频突变具有高灵敏度。这种覆盖均匀性在很大.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NEBNext末端修复模块	New England Biolabs	E6050L
NEBNext dA加尾模块	New England Biolabs	E6053L
NEBNext快速连接模块	New England Biolabs	E6056L
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter Genomics
NEXTflex无PCR条形码 – 24	Bioo Scientific	514103
HiFi文库扩增试剂盒	KAPA Biosystems	KK2612
COT人源DNA，荧光级	Roche Diagnostics	05 480 647 001
NimbleGen SeqCap EZ杂交与洗涤试剂盒	Roche NimbleGen	05 634 261 001
SeqCap EZ文库捕获探针	Roche NimbleGen
QIAquick PCR纯化试剂盒	Qiagen	28104
Qubit dsDNA宽范围（BR）检测试剂盒	Life Technologies	Q32850
Qubit dsDNA高灵敏度（HS）检测试剂盒	Life Technologies	Q32851
Agilent DNA HS试剂盒	Agilent Technologies	5067-4626, 4627
Agilent 2100生物分析仪	Agilent Technologies
Covaris E220	Covaris
96孔磁力架	Ambion	AM10027
Illumina Hi-Seq 2000	Illumina