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通过外显子捕获与大规模并行测序检测肿瘤标本中的体细胞遗传改变

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DOI：

10.3791/50710

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2013年10月18日

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1Department of Pathology, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center, 2Human Oncology and Pathogenesis Program, Memorial Sloan-Kettering Cancer Center

本文内容

摘要

我们描述了条形码DNA文库的制备，以及随后基于杂交的外显子捕获方法，用于通过大规模并行的“下一代”测序技术在临床肿瘤样本中检测关键的癌症相关突变。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而能够高灵敏地检测低频突变。

摘要

检测和研究关键致癌突变的努力已被证明有助于为癌症患者提供适当的治疗。高通量、大规模并行的“下一代”测序技术的发展促进了众多此类突变的发现。为了提高该技术在临床和转化研究中的实用性，测序平台必须具备高通量、低成本的特点，并能够兼容福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织样本，这些样本可能仅能提取出少量降解或受损的DNA。本文描述了条形码标记和多重DNA文库的制备，随后通过杂交捕获靶向外显子，以在新鲜冷冻和FFPE肿瘤组织中利用大规模并行测序检测与癌症相关的突变。该方法可识别序列突变、拷贝数变异以及涉及所有靶向基因的选择性结构重排。靶向外显子测序具有高通量、低成本和深度测序覆盖的优势，因而对检测低频突变具有高灵敏度。

引言

在关键癌基因和肿瘤抑制基因中识别"驱动"性肿瘤遗传事件，在多种癌症的诊断与治疗中发挥着至关重要的作用1。近年来，大规模研究利用大规模并行的"下一代"测序技术，已成功识别出许多与癌症相关的基因2。然而，这些测序平台通常需要从新鲜冷冻组织中提取大量DNA，从而在利用保存组织（如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤样本）进行DNA突变的表征与分析时构成了主要限制。改进对FFPE肿瘤样本中"可干预"基因组信息进行高效且可靠表征的技术，将有助于对以往存档的样本进行回顾性分析，并进一步推动癌症管理向个体化方向发展。

传统上，分子诊断实验室依赖耗时且通量较低的方法（如Sanger测序和实时PCR）进行DNA突变谱分析。近年来，已开发出更高通量的方法，利用多重PCR或质谱基因分型技术来研究关键癌症基因中的复发性体细胞突变3-5。然而，这些方法存在局限性，仅能检测预先设定的"热点"突变，因此不适合检测肿瘤抑制基因中的失活突变。大规模并行测序相比这些策略具有多项优势，包括能够检测整个外显子区域中的常见和罕见突变，能够揭示其他类型的基因组改变（如拷贝数增加和缺失），以及在异质性样本中具有更高的检测灵敏度6, 7。全基因组测序是突变发现最全面的方法，但其相对昂贵，且在数据分析和存储方面需要较大的计算资源。

在临床应用中，由于只有基因组的一小部分可能具有临床意义，测序技术的两项特定创新已产生变革性影响。首先，通过基于杂交的外显子捕获技术，可以分离出与关键癌症相关基因对应的DNA，用于靶向突变谱分析8, 。其次，通过连接分子条形码（i.e. 长度为6-8个核苷酸的DNA序列），可在一次测序运行中混合数百个样本，从而充分利用大规模并行测序仪器持续增长的测序能力10。当这两项技术结合使用时，能够以更低的成本、更高的通量对肿瘤进行谱型分析，并减少计算资源需求11。此外，通过将测序覆盖度重新分配至特定应用中最关键的基因，可实现更高的测序深度，从而提高对低等位基因频率事件的检测灵敏度。

本文介绍了我们的IMPACT检测方法（可操作性癌症靶点综合突变谱分析），该方法利用条形码标记的文库池，通过定制寡核苷酸杂交介导的外显子捕获，富集279个关键癌症相关基因的所有蛋白编码外显子及部分内含子（表1）。该策略可检测这279个基因中的突变、插入缺失（indels）、拷贝数变异以及特定的结构重排。本方法适用于从新鲜冷冻组织、福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织、细针穿刺抽吸样本以及其他细胞学标本中提取的DNA。

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方案

1. DNA 和试剂的准备

注意：本方案描述了24个样本的同时处理与分析（例如 12个肿瘤/正常组织配对），但也可根据需要调整用于更小或更大的样本批次。DNA样本可来源于FFPE组织、新鲜冷冻组织、细胞学标本或血液。通常，来自同一患者的肿瘤组织和正常组织将一并进行分析，以区分体细胞突变与遗传性多态性。本方案自DNA提取完成后即开始。

  1. 将每个样本提取的 DNA 分装 50–250 ng（推荐使用 250 ng），用 1× Tris-EDTA（pH 8.0）缓冲液稀释至终体积为 50 µl，分装至独立的 Covaris 圆底管中。
  2. 在 Covaris E220 仪器上对 DNA 进行剪切，设置参数如下：持续 360 秒，占空比为 10，峰值入射功率为 175 PIP，每周期微泡次数为 200。
  3. 将 AMPure XP 磁珠（表 2）置于室温下解冻。所有缓冲液和酶在使用前需在冰上解冻。

2. 文库构建 - 末端修复模块

  1. 在无菌微量离心管中，按每份样品配制末端修复主混合液：10 µl 10x NEBNext末端修复反应缓冲液（表2）、5 µl NEBNext末端修复酶混合液（表2）、35 µl 无菌无核酸酶水（H2O）。
  2. 将每份剪切后的DNA各50 µl分装至96孔板的不同孔中。向每个反应孔中加入50 µl已配制的末端修复主混合液。在热循环仪中于20 °C孵育30分钟。

3. 末端修复后纯化

  1. 向每个样本中加入2倍体积（200 µl）的AMPure XP磁珠（表2），使用多通道移液器轻轻吹打混合10次。室温孵育15分钟。
  2. 将样本置于磁力架上（表2），室温静置15分钟，直至溶液变澄清。
  3. 小心移除并弃去上清液，注意不要扰动磁珠。孔中可能残留少量液体。
  4. 保持样本管置于磁力架上，向每个样本中轻轻加入200 µl新鲜配制的80%乙醇，并在室温下孵育30秒。小心用移液器吸除乙醇。
  5. 重复步骤5，共进行两次乙醇洗涤。确保完全去除所有乙醇。从磁力架上取下样本管，在室温下干燥5分钟。
  6. 用44.5 µl无菌H2O重悬干燥的磁珠。轻轻吹打整个液体10次，充分混匀。确保磁珠不再黏附在孔壁上。
  7. 将重悬的磁珠在室温下孵育2分钟。置于磁力架上5分钟，直至溶液变澄清。
  8. 小心转移42 µl含有样本的澄清上清液至新的孔中。
    此步骤可安全暂停，样本可在-20 °C保存最多7天。如需继续实验，将冷冻样本置于冰上解冻后再进行后续操作。

4. 文库构建 - dA加尾模块

  1. 使用无菌微量离心管，按每份样品配制 dA 加尾主混合液：5 µl 10x NEBNext dA 加尾反应缓冲液（表 2），3 µl (3'-5' 外切酶缺陷型) Klenow 片段（表 2）。
  2. 将 8 µl 配制好的 dA 加尾主混合液加入每个含有 42 µl 末端修复 DNA 的孔中。在热循环仪中于 37 °C 孵育 30 分钟。
  3. 进行 dA 加尾后纯化：重复步骤 3.1–3.8，使用 2 倍体积（100 µl）的磁珠，但用无菌 H2O 重悬，最终体积为 33.75 µl。
    本步骤可安全暂停，样品可在 -20 °C 保存最多 7 天。如需继续实验，将冻存样品置于冰上解冻后再进行后续操作。

5. 文库构建 - 接头连接模块

  1. 在无菌微量离心管中配制连接反应主混合液，每份样品使用以下体积：10 µl 5x NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer（New England Biolabs，表2），5 µl Quick T4 DNA连接酶（表2）。
  2. 向每孔含dA加尾DNA的样品中加入15 µl连接反应主混合液。
  3. 向每孔中加入1.25 µl适当的25 µM NEXTflex条形码接头（表2），每个样品应使用不同的条形码接头。在热循环仪中于20 °C孵育15分钟。
  4. 进行接头连接后的纯化：使用1倍体积（50 µl）磁珠重复步骤3.1–3.8，但用无菌H2O重悬至终体积50 µl。
  5. 再次重复步骤3.1–3.8进行第二次1倍体积（50 µl）纯化，但用无菌H2O重悬至终体积23 µl。
    本步骤可安全暂停，样品可在-20 °C保存最多7天。如需继续实验，将冻存样品置于冰上解冻后再进行后续操作。

6. 文库扩增

  1. 在无菌微量离心管中配制KAPA HiFi预混液，每份样品使用以下体积：25 µl 2x KAPA HiFi HS RM（表2），100 µM 引物1和引物2各1 µl（表3）。
  2. 将27 µl预混液加入含有连接产物的各孔中。将移液器设定为50 µl，轻柔地将全部液体上下吹打10次。
  3. 放入热循环仪中进行以下PCR扩增循环：98 °C预变性45秒，随后进行10个循环（98 °C变性15秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后72 °C延伸1分钟。
  4. 进行扩增后纯化：使用1倍体积（50 µl）的AMPure XP磁珠，重复步骤3.1–3.8的操作，并用无菌水重悬至终体积30 µl。
  5. 根据生产商说明书，使用Qubit Broad Range Assay（Life Technologies，表2）测定各文库的浓度。

7. Roche Nimblegen SeqCAP EZ 文库杂交、洗涤与扩增

  1. 解冻通用和指数寡核苷酸阻断剂（表3），SeqCap EZ文库，以及NimbleGen捕获组分（COT DNA、2倍杂交缓冲液和杂交组分A， 表 2置于冰上。所有寡核苷酸阻断剂均保存为1 mM的工作液。我们的SeqCap EZ文库是一种定制设计的捕获探针混合物，涵盖279个癌症相关基因的全部蛋白编码外显子，但也可使用其他定制或目录设计的产品。
  2. 制备1 mM的索引寡核苷酸阻断剂混合物，该混合物应与文库构建中使用的特定条形码接头序列相对应。取每种阻断剂各1 µl，混匀并涡旋振荡。
  3. 在新的无菌1.5 ml微量离心管中，加入5 µl 1 mg/ml COT DNA、2 µl 1 mM通用阻断剂和2 µl 1 mM索引寡核苷酸阻断剂混合物。
  4. 将24个带条形码的文库混合至一个反应体系中。向捕获混合物中加入总共1–3 µg的混合条形码测序文库（如上制备）。对于24个样本，建议每个样本加入100 ng。在混合肿瘤样本与配对正常样本时，建议增加肿瘤文库的加入量例如 每肿瘤100 ng，每正常组织50 ng，以实现更深度的测序覆盖。
  5. 盖上管盖，并用18-20号或更细的针头在管盖顶部刺出15-20个孔。将扩增后的样本文库/COT DNA/寡核苷酸置于DNA真空浓缩仪中，在高温（60 °C）下进行真空离心浓缩。
  6. 完全干燥后，加入7.5 µl 2x杂交缓冲液和3 µl杂交组分A进行重悬。此时，离心管中总体积为10.5 µl，包含以下组分：5 µg COT DNA、可变量的扩增后样本文库（µg）、1000 pmol通用引物和Index引物、7.5 µl 2x杂交缓冲液、3 µl杂交组分A。
  7. 用一小块实验室胶带封住盖子上的孔洞。将样品涡旋振荡10秒，然后以最大速度离心10秒。
  8. 将样品在 95 °C 下孵育 10 分钟以变性 DNA，随后在室温下以最大速度离心 10 秒。
  9. 在新的 0.2 ml PCR 条形管中，加入 2.25 µl SeqCap EZ Library 捕获探针和 2.25 µl 无菌无核酸酶水2O 并加入步骤 7.7 的全部内容。轻柔吹打混匀整个体积 10 次。
  10. 在47 °C下于热循环仪中孵育48–96小时。设置并维持热循环仪盖温为57 °C。
  11. 遵循 NimbleGen SeqCap EX Library SR 用户指南 v3.0 第 6 章中的步骤表 2用于洗涤和回收捕获的DNA。
  12. 遵循罗氏NimbleGen方案第7章中关于捕获DNA扩增的步骤，但作如下修改：
    • 使用 2x KAPA HiFi 聚合酶（表2）而非Phusion High-Fidelity PCR Master Mix
    • 使用所列的100 µM 引物1和引物2 表3.
    • 运行以下PCR程序：98 °C预变性30秒，随后进行11个循环（98 °C变性10秒，60 °C退火30秒，72 °C延伸30秒），最后72 °C终延伸5分钟，4 °C保存。
  13. 使用Qubit高灵敏度检测试剂盒定量扩增后捕获的DNA浓度表 2按照制造商的说明进行操作。
  14. 使用 Agilent Bioanalyzer DNA HS 芯片分析捕获的 DNA 质量（表 2按照制造商的说明进行操作。
    • PCR 产物得率应至少为 100 ng（范围 100–1,000 ng）。
    • 片段的平均长度应在150-400个碱基对之间。

8. Illumina Hi-Seq 测序

  1. 将扩增后的捕获DNA稀释至2 pM，并将样品加样到Illumina HiSeq 2000流动池的单个通道中。根据制造商的说明进行双端75个碱基对的测序。根据我们的经验，对于包含24个样品的样本池，在279个基因上，单个通道足以实现每个样品500–700倍的唯一序列覆盖度。
  2. Illumina软件（实时分析）会将高分辨率图像转换为簇强度，进而生成碱基识别和质量评分。使用CASAVA根据条形码信息对数据进行解复用，并为每个样品生成独立的FASTQ文件。

9. 数据分析

  1. 使用 Cutadapt 工具（http://code.google.com/p/cutadapt/）从 FASTQ 文件的测序读段 3' 端去除接头序列。最小重叠长度（-O）设为 3，错误率（-e）为 1%。去除接头后，成对读段保留的最小碱基长度为 25。
  2. 使用 Burrows-Wheeler Aligner 工具（BWA）12 将测序读段比对至参考人类基因组 hg19。根据 Genomes Analysis Toolkit（GATK）的标准最佳实践流程（http://www.broadinstitute.org/gatk/guide/topic?name=best-practices）13，进行后续处理步骤，包括重复序列标记、局部多序列重比对以及碱基质量评分重校准。当分析来自同一患者的多个样本（例如 配对的肿瘤与正常组织）时，应联合进行局部多序列重比对。这些后续处理步骤的输出结果为每个样本生成一个独立的 BAM 文件，其中包含所有序列、质量及比对信息，并可直接加载至 Integrative Genomics Viewer（IGV）中，用于读段和序列变异的可视化14。
  3. 使用 Picard 工具（http://picard.sourceforge.net/）计算测序性能指标。关键指标包括比对率、片段大小分布、与 GC 含量相关的覆盖度偏差、靶向捕获特异性、PCR 重复率、文库复杂度以及靶区域平均覆盖度。代表性数值见图 1。使用 GATK 中的 DepthOfCoverage 计算常见多态性位点的等位基因频率，以监测来自无关 DNA 的污染，并确保配对样本来源于同一患者。
    以下计算分析依赖于配对的肿瘤与正常样本，以检测体细胞遗传变异。对于无配对正常组织的肿瘤样本，也可使用独立的正常对照样本进行分析，但大多数体细胞突变难以与遗传性序列变异明确区分。
  4. 使用体细胞突变检测工具（如 muTect15、SomaticSniper16 或 Strelka17）对每对肿瘤-正常样本调用体细胞单核苷酸变异（SNVs）。我们采用 muTect 并修改过滤标准，允许正常样本中存在低（非零）等位基因计数的变异，只要其在肿瘤样本中的等位基因频率至少高出 5 倍 。在一组正常 DNA 面板中反复出现的变异将被剔除，因其可能为测序或比对过程中的系统性假象。每个通过过滤的 SNV 均需使用 IGV 进行仔细人工审查。
  5. 使用 SomaticIndelDetector13、Dindel18 或 SOAPindel19 等算法对每对肿瘤-正常样本调用体细胞插入缺失变异（indels）。我们采用 SomaticIndelDetector，设定如下标准：等位基因频率至少为 10% 且支持读段数不少于 3 条，或等位基因频率至少为 2% 且支持读段数不少于 10 条。允许正常样本中存在低（非零）等位基因计数的 indel，只要其在肿瘤样本中的等位基因频率至少高出 5 倍 。如同 SNV 分析，出现在正常 DNA 面板中的 indel 将被剔除。每个通过过滤的 indel 均需使用 IGV 进行仔细人工审查。
  6. 根据靶向外显子区域的测序覆盖度推断拷贝数状态。对每个样本，对所有靶向外显子的平均测序覆盖度进行 Loess 归一化处理，回归校正 GC 含量的影响。通过从原始覆盖度值中减去 Loess 拟合值并加上全样本中位覆盖度，获得校正后的覆盖度。计算肿瘤-正常样本对之间所有靶向外显子的归一化覆盖度比值。在缺乏配对正常样本的情况下，或为降低噪声，可使用其他性别匹配、二倍体且无胚系拷贝数变异的正常对照样本。基于覆盖度比值的升高或降低，判断体细胞拷贝数增加或缺失。
  7. 调用涉及癌症相关基因的体细胞重排事件，要求至少一个基因组断点位于靶向区间内或其附近。推荐使用的算法包括 GASV20、Breakdancer21、CREST22 和 dRanger23。可根据不一致读段对中支持读段的相对位置和方向，区分染色体内倒位、缺失和串联重复。所有候选重排事件均应使用 IGV 进行人工审查。我们建议通过 PCR 扩增和 Sanger 测序对预测的重排断点进行实验验证。

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结果

使用针对279个癌症基因全部蛋白编码外显子的探针，对一个包含24个带条形码的序列文库（12对肿瘤-正常样本）的样本池进行捕获，并在HiSeq 2000流动池的单个通道中以2 × 75 bp的双端读长进行测序。肿瘤与正常文库以2:1的比例混合。冷冻肿瘤DNA样本池的样本性能指标如图1所示，包括比对率、片段大小分布、靶向捕获特异性以及靶区域平均覆盖深度。示例性的体细胞突变、插入、缺失和拷贝数变异如图2-4所示。

DNA测序分析图表：簇密度、目标覆盖度、插入片段大小、捕获特异性。
图1. 测序性能指标的代表性图示。a...

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讨论

我们的IMPACT检测具有高比对率、高靶向率、高靶标覆盖度以及高灵敏度，可有效检测突变、插入缺失（indels）和拷贝数变异。我们已证实，即使在DNA输入量较低的情况下，IMPACT检测仍可对新鲜冷冻样本和存档的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行DNA测序。通过对关键癌症相关基因的外显子进行靶向测序，可实现这些最重要基因外显子的极深测序覆盖，从而最大限度地提高对低频突变的检出能力。条形码标记与多重测序技术的应用，可实现更高通量、更低的单样本成本以及更少的DNA输入量需求。

靶向测序方法的一个优势在于，可以优化捕获探针，使得所有外显子在突变检测中均被均匀且充分地覆盖。如表1所示，我们的设计涵盖了279个基因中的4,535个外显子。经过对设计方案的多次迭代优化，典型的测序实验中，覆盖深度低于整个样本中位覆盖深度20%的外显子比例不超过2%。因此，对于测序深度达到500x的肿瘤样本（如图1所示的保守估计），>98%的外显子将被>100x的深度覆盖，从而确保对低频突变具有高灵敏度。这种覆盖均匀性在很大...

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披露

Berger 博士已从癌症诊断公司 Foundation Medicine 获得咨询费和研究资助。

致谢

感谢阿格尼丝·维亚尔博士以及纪念斯隆-凯特琳癌症中心基因组核心实验室提供的技术支持。本实验方案的开发得到了杰弗里·比恩癌症研究中心和法默家族基金会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NEBNext末端修复模块New England BiolabsE6050L 
NEBNext dA加尾模块New England BiolabsE6053L 
NEBNext快速连接模块New England BiolabsE6056L 
Agencourt AMPure XPBeckman Coulter Genomics 
NEXTflex无PCR条形码 – 24Bioo Scientific514103 
HiFi文库扩增试剂盒KAPA BiosystemsKK2612 
COT人源DNA，荧光级Roche Diagnostics05 480 647 001 
NimbleGen SeqCap EZ杂交与洗涤试剂盒Roche NimbleGen05 634 261 001 
SeqCap EZ文库捕获探针Roche NimbleGen 
QIAquick PCR纯化试剂盒Qiagen28104 
Qubit dsDNA宽范围（BR）检测试剂盒Life TechnologiesQ32850 
Qubit dsDNA高灵敏度（HS）检测试剂盒Life TechnologiesQ32851 
Agilent DNA HS试剂盒Agilent Technologies5067-4626, 4627 
Agilent 2100生物分析仪Agilent Technologies 
Covaris E220Covaris 
96孔磁力架AmbionAM10027 
Illumina Hi-Seq 2000Illumina 

参考文献

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