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方法文章

功能性质疑成年下丘脑神经发生：基于局灶性放射学抑制的研究方法 下丘脑, 神经发生, 成年神经发生, 放射抑制, 神经干细胞, 神经前体细胞, 辐照, 焦点性照射, 脑功能成像, 功能分析

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DOI：

10.3791/50716

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2013年11月14日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Biology, California Institute of Technology, 2Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, Neurology, and Ophthalamology, Johns Hopkins University School of Medicine, 3Department of Radiation Oncology & Molecular Radiation Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 4Department of Radiation Oncology, University Of Washington Medical Center, 5Institute for Cell Engineering and High-Throughput Biology Center, Johns Hopkins University School of Medicine

本文内容

摘要

成年哺乳动物新生神经元的功能仍是当前研究的活跃领域。电离辐射可抑制新神经元的生成。利用计算机断层扫描引导的局部照射（CFIR），现可通过三维解剖定位特定的神经前体细胞群，来评估成年神经发生的生物学功能。

摘要

成年新生神经元的功能表征仍是一个重大挑战。通过侵入性病毒递送或转基因动物手段抑制成年神经发生的传统方法存在潜在的混杂因素，使得对这些研究结果的解释变得困难。然而，新兴的放射学工具使得研究者能够非侵入性地通过精确的解剖定位，探究特定成年新生神经元群体的功能。局部电离辐射可抑制新神经元的生成与分化，并可靶向特定的神经前体细胞区域。为了阐明下丘脑成年神经发生在调控生理过程中的潜在功能作用，我们开发了一种非侵入性局部照射技术，用于选择性抑制下丘脑正中隆起区域成年新生神经元的生成。本文描述了一种方法 C计算机断层扫描引导的 f局部 ir辐射（CFIR）递送，以实现对小型动物的精确定位和准确解剖靶向。CFIR采用三维容积成像引导技术进行辐射剂量的定位与靶向，可最大限度减少非靶向脑区的辐射暴露，并实现具有锐利束流边界的适形剂量分布。本方案不仅可用于探究成年新生神经元的功能，同时也为放射生物学、肿瘤生物学和免疫学领域的研究问题提供了新的途径。这些放射学工具将有助于推动从实验室基础研究到临床应用的转化。

引言

最近的研究发现表明，成年哺乳动物的大脑具有显著的可塑性。在整个成年期，成年新生神经元会在哺乳动物大脑的特定微环境中持续产生1。这些成年新生神经元的功能是什么？更重要的是，它们是否在生理和行为中发挥作用？传统上，针对这一主题的研究主要集中在侧脑室的室下区和海马体的颗粒下区；然而，最近的研究已揭示了其他脑区（如哺乳动物下丘脑）中也存在神经发生现象2。已有报道指出，在出生后及成年期的下丘脑中均存在神经发生2-10，而这些新生下丘脑神经元的功能仍是当前研究的热点领域。

成年出生神经元的功能表征对整个神经科学领域而言仍是一个重大挑战。由于目前缺乏仅特异性表达于单一神经前体细胞群体的分子标记物，针对特定神经前体细胞群体的选择性抑制仍然受限11。因此，通过基因靶向手段从这些神经前体细胞中选择性清除成年出生的神经元仍十分困难。同样，利用病毒递送方法靶向成年出生神经元也存在潜在的混杂因素，例如可能对局部环境造成损伤和引发炎症反应12。

然而，新的放射学工具正在出现，这些工具能够规避上述混杂因素，并通过在小型动物中进行准确而精确的解剖定位来研究这些问题。电离辐射能够抑制新神经元的生成与分化，从而提供一种非侵入性方法来靶向神经前体细胞群体13-15。最近，我们描述了哺乳动物下丘脑正中隆起（ME）中的一个生发区域，将其命名为下丘脑增殖区（HPZ）2。我们发现，当年轻的成年雌性小鼠摄入高脂饮食（HFD）时，与摄入普通饲料（NC）的对照组小鼠相比，HFD喂养小鼠在该ME区域的神经发生水平显著升高2。为了检验下丘脑ME区域内的成年神经发生是否调控代谢和体重，我们试图干扰这一过程。正中隆起是位于第三脑室底部的一个微小的单侧结构，调节性激素由此释放。为了在不改变该脑区其他生理功能的前提下抑制细胞增殖及随后的神经发生，我们开发了一种非侵入性的局部照射技术，可选择性地抑制下丘脑正中隆起中新生成的成年神经元的产生2。

许多研究团队已采用辐射手段抑制经典脑区中的神经发生14-28。然而，以往的放射学方法通常针对较大区域，或常常无意中同时影响了多个已报道存在神经发生的脑区，从而难以明确将所观察到的行为缺陷归因于特定神经前体细胞群的功能异常。目前，借助结合了computer tomography（计算机断层扫描）引导成像与focal beam irradiation（聚焦束辐射）（CFIR）递送技术的放射学平台，可实现更精准的靶向照射，从而实现精确的解剖定位29-36。该技术可提供直径低至0.5 mm的辐射束，用于靶向特定的神经前体细胞群35。该方法使我们能够精准靶向下丘脑正中隆起（ME），并在小型动物中阻断细胞增殖及神经发生过程。在对这些前体细胞群进行放射处理后，可开展生理学与行为学检测，以揭示成年新生神经元的潜在功能。聚焦照射对本研究尤为重要，因为垂体紧邻下丘脑正中隆起；若照射波及垂体，可能影响其内分泌功能，进而干扰实验结果的解读。

辐射后神经发生受到抑制的生物学基础仍不明确。以往的辐射研究依赖于大范围照射束，得出的结论是神经发生的抑制是通过炎症反应介导的14, 37。因此，尚不清楚高度聚焦的辐射是否也能抑制神经发生，因为这种照射方式并不会引发显著的炎症反应。然而，我们课题组最近对海马体经典神经发生区域的研究表明，采用10 Gy剂量的高度聚焦辐射可在照射后至少4周内抑制神经发生35。

为了研究中位隆起区成年新生神经元的功能，我们采用一种精密放射装置，该装置能够结合CT成像与小直径放射束来抑制中位隆起（ME）的神经发生。通过安装在可旋转360°机架上的X射线管，结合机器人控制的样品载台，在放射治疗过程中实现对动物模型的旋转，从而实施弧形束微照射（图1）。当机架处于水平位置时，使用高分辨率X射线探测器获取图像33。在本研究中，CT图像重建后的各向同性体素尺寸为0.20 mm。机载CT成像可在动物处于治疗位置时精确定位目标区域。目标区域的定位借助随商用放射平台提供的CT导航剂量规划软件完成。通过CT成像确定感兴趣区域（ROI）后，由具有四个自由度（X、Y、Z、θ）的机器人样品载台将动物移至相应的治疗位置。通过调节机架角度与机器人载台角度的组合，可从相对于动物的几乎任意方向进行射线照射，从而实现立体定向弧形治疗29。在本研究及其他所有成像实验中，小鼠均被固定于专用固定装置内，该装置可在限制动物活动的同时输送麻醉气体异氟烷。该固定床具备CT兼容性，并与机器人样品载台相连接34。

我们预计，CFIR 将在多个研究领域带来概念上的进展。尽管我们以放射学手段靶向下丘脑正中隆起作为该技术原理的验证，但原则上，CFIR 可用于靶向任何小型模式生物体内的任意区域。例如在神经科学领域，我们设想该技术可用于评估其他室周器官中可能存在并具有活跃增殖能力的前体细胞群体的功能，如最后区38, 39、穹窿下器官40以及垂体41。长期以来关于成体神经发生功能作用的争议，以及确定其在行为中因果作用的问题，现在也能够得到更深入的探讨。在鸣禽中，该技术可能有助于阐明成体神经发生在维持鸟类鸣叫的强烈且季节性行为中的作用42，而此前这一研究因难以在特定脑区选择性抑制神经发生而受到阻碍。理解这一显著的行为模型，可能为成体神经发生在调控其他性二型行为中的作用提供新的见解。此外，在代谢研究领域，CFIR 可能被用于探索肝细胞增殖及其在代谢和能量平衡中所起作用的相关方面。该技术的引入，有望推动多个研究学科在概念上的进步。

本文展示了CFIR在精确定位局灶性照射束解剖靶区方面的功能。尽管我们最初开发了这种小型动物放射研究平台（SARRP）用于自身研究，但现在市场上已有其他类似的设备，均可实现类似的CT引导局灶照射43, 44。因此，本文所述CFIR方案概括了适用于所有研究平台的通用步骤，而非仅限于SARRP的特定操作。相较于以往抑制神经发生的放射学方法，CFIR的优势在于：该技术可利用三维容积成像进行剂量定位与靶向引导，适形剂量可最大限度减少非靶向脑区的辐射暴露，且高精度的射束几何形状可实现具有陡峭边界锐利度的适形剂量分布。我们阐述了如何利用CT引导成像将辐射剂量靶向特定解剖区域，并进一步说明如何通过γ-H2AX免疫组织化学染色——一种DNA双链断裂标志物35, 45-48——直接在组织中可视化辐射剂量分布。该方法用于选择性照射神经发生微环境，可能对揭示新生成年神经元在生理与疾病中的功能作用具有重要意义。

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方案

动物使用

获得机构动物护理与使用委员会对标准护理和使用方案的批准。本方案是为5.5-10周龄小鼠的局部照射研究而制定的。 周 老年C57BL/6J小鼠，如先前所述（图2)2。然而，其他年龄段及小型动物物种（大鼠、仓鼠、地松鼠， 等等。也可使用，前提是具备有效的麻醉方案以及能够识别感兴趣区域（ROI）的放射解剖图谱。

1. CT引导放射学平台的校准

针对所使用的每种准直器尺寸和X射线管滤波器类型，预先在放射学平台上进行基于胶片的辐射剂量校准。为了将弧形照射束精准定位至目标区域，使用大多数商用放射治疗平台配备的辐射剂量计划软件49，根据辐射剂量、基于小鼠CT扫描确定的兴趣区域（ROI）深度以及机器人平台的旋转速度，计算所需的照射时间；由于不同放射治疗平台之间的具体操作存在差异，本方案中省略了相关细节。为通过CT成像可视化腹侧下丘脑2（图3），应使用0.4 mm焦点尺寸的X射线管，射线能量设为100 kVp，并采用1 mm铝滤波。针对HPZ的局部照射，应将X射线管设置为225 kVp、13 mA、1 mm焦点尺寸，并配备0.15 mm铜滤波，在0.6 cm组织深度处于4.6分钟的治疗时间内递送10 Gy的辐射剂量。针对不同ROI之间的靶向照射，需重新计算相应的参数。

  1. 若研究高脂饮食对正中隆起神经发生的影响（如先前所述2），从Jackson Mouse实验室获取四周龄雌性C57BL6/J小鼠，每笼饲养四只。在五周龄时将食物从普通饲料更换为高脂饮食。让小鼠适应新的饲养环境和食物。在5.5周龄时进行CFIR处理。将实验动物转运至配备放射学平台的手术室，转移过程中尽量减少应激。准备异氟烷气体麻醉舱，随后将一只小鼠放入舱内。同时，为处理后的小鼠准备加热垫（低档设置）。
  2. 当小鼠已进入麻醉状态且对足垫压迫无反应时，将其转移至放射学平台，并放置于机器人载物台的固定床上。将小鼠的口部插入鼻罩麻醉杯中，牙齿置于咬合固定器内（图1D）。将小鼠平放于固定床上，检查其是否持续无反应。若确认无反应，则使用纱布胶带将小鼠固定于床上。在固定过程中，确保头部处于水平平面。可通过拉起双耳并观察是否齐平来判断。当小鼠处于正确位置后，关闭铅防护罩。
  3. 使用实验者所用放射学平台的内置软件获取计算机断层扫描图像，以获得小鼠的三维解剖结构图像。检查小鼠头部是否处于水平平面。若未达到水平，重复步骤1.2–1.3，直至头部调平。
  4. 通过CT图像确定感兴趣区域（ROI）。如图3E所示，以与水平面成45°角的方式计算ROI至颅骨表面的距离。
  5. 使用内置软件，如图4A所示，从上方获取小鼠的X射线图像。随后将小鼠从放射学平台移出，置于加热垫上，并持续监测直至恢复活动能力。
  6. 根据冠状面CT图像，计算至少三只小鼠的ROI平均解剖深度，以确定照射剂量。例如，在先前一项研究2中，向腹侧基底下丘脑施加10 Gy照射剂量时，ROI至颅骨的深度（以45°角测量）为0.66 cm（见图3E）。基于此数据，研究人员使用放射学平台安装的剂量规划软件（DPS），计算出实现目标剂量所需的旋转速度和照射时间。
  7. 在通过剂量规划软件确定机器人载物台的处理时长和旋转速度后，使用嵌入水等效塑料模拟小鼠模型中的GAFchromic辐射敏感膜，测量所计算参数的剂量分布。具体操作为：如图4B所示，将三张GAFchromic辐射敏感膜置于四块垂直堆叠的水等效塑料块之间29。
  8. 将含有GAFchromic膜的模拟小鼠模型放置于机器人载物台上，使用新计算的参数运行聚焦照射束。例如，为靶向腹侧基底下丘脑，输入以下参数：0.15 mm Cu滤光片、225 kVp、13 mA、1 mm直径照射束设置、45°机架角、1.3°/秒旋转速度、照射时间4.6分钟，以实现ROI处10 Gy的放射剂量。
  9. 照射完成后，检查膜片上辐射剂量的分布模式和强度。当以360°旋转角度并使用上述参数靶向腹侧基底下丘脑时，可在等中心点上方的膜片上观察到深色环状区域，等中心点膜片上出现小而清晰的斑点，等中心点下方膜片上则呈现较浅的环状区域，这些特征对应于锥形束照射的剂量分布（图4B）。
  10. 将等中心点处的GAFchromic膜图像叠加至用于参数计算的小鼠X射线图像上。等中心点处的照射焦点应与预期的ROI区域重合，如图4C所示。

替代方法：如果仍难以定位脑部感兴趣区域，可使用经鞘内注射碘对比剂，以增强CT图像下脑室的可视化效果。为简洁起见，本方案中未包含该操作步骤，但此前已有描述35, 50。碘对比剂可提供额外的脑室解剖标志（图5A）。

2. 确定照射束的准确性

通过直接可视化组织中的辐射束进一步确认CFIR束流的准确性2, 35, 51。为此，进行免疫组织化学染色以检测γH2AX51，该蛋白是一种组蛋白，也是DNA双链断裂的早期标志物。小鼠必须在照射后一小时内进行经心脏灌注并固定。照射后，DNA修复过程迅速启动，ϒH2AX水平显著下降35。

  1. 重复步骤 1.1 - 1.3。
  2. 在 CT 上确定目标后，通过机器人控制将小鼠移动，使该目标与辐射递送束对齐。将步骤 1.6 中计算出的参数（旋转速度和达到所需剂量的照射时长）输入剂量规划软件，并开始治疗。治疗时，机架指向与垂直方向成 45° 角，同时小鼠围绕垂直轴旋转。
  3. 照射完成后，对小鼠进行经心灌注。灌注需在照射后一小时内完成52。灌注结束后，将脑组织浸入 4% 多聚甲醛（PFA）/PBS 中，并在 4 °C 下轻轻振荡过夜。
  4. 次日早晨，用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟，以去除多聚甲醛固定液。随后，在 1×PBS 中的 30% 蔗糖溶液中浸泡，并于 4 °C 下置于摇床上。
  5. 在 4 °C 下轻轻振荡（通常为 12–16 小时），直至脑组织沉入管底。此步骤起到冷冻保护作用。当脑组织完全下沉后，使用带孔勺小心取出，以避免转移过多的 30% 蔗糖/1×PBS 溶液。迅速在干冰上将脑组织包埋于冷冻介质中，用移液器枪头轻轻搅动冷冻介质，并将脑组织在塑料模具中摆放至合适位置。
  6. 待脑组织完全冻结后，将其转移至 -20 °C 冰箱中保存。
  7. 进行免疫组织化学染色当天，将脑组织以 40 μm 厚度进行冠状切片，并用细毛笔漂浮转移至含有 PBS 的 24 孔板中。切片应保持正确的连续顺序，以便通过免疫染色确定照射区域的覆盖范围。
  8. 将 0.01 M 柠檬酸钠溶液在水浴中预热至 80 °C，以准备抗原修复步骤。同时，在柠檬酸钠溶液加热过程中，用 0.01 M PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟 。
  9. 当柠檬酸钠溶液达到 80 °C 后，将脑切片浸入柠檬酸钠缓冲液中，在水浴中 80 °C 孵育 1 小时。
  10. 取出切片，使柠檬酸钠溶液自然冷却至室温，然后用 0.01 M PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。
  11. 在含 5% 正常山羊血清的 PBS-Triton 中封闭脑切片 1 小时。
  12. 在含 5% 正常山羊血清的 PBS-Triton 中，加入 1:700 稀释的小鼠抗磷酸化 H2AX 一抗，4 °C 下孵育过夜。
  13. 次日，用 0.01 M PBS-Triton 洗涤 3 次，每次 15 分钟 。
  14. 在含 5% 正常山羊血清的 PBS-Triton 中，加入 1:500 稀释的与 488 nm 荧光染料偶联的山羊抗小鼠二抗，孵育 2 小时。
  15. 用 0.01 M PBS-Triton 洗涤 3 次，每次 15 分钟 。
  16. 加入 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）染色液（1:5,000 稀释于 PBS 中），染色 10 分钟以显示细胞核。随后，用 PBS 洗涤脑切片 5 分钟。
  17. 将切片漂浮于 PBS 中，贴附于带静电的载玻片上。擦去多余 PBS，让载玻片自然干燥。用封片剂封片，并将载玻片置于暗处室温下过夜干燥。
  18. 使用荧光显微镜拍摄连续冠状切片图像。ϒH2AX 免疫染色（绿色）显示照射部位。DAPI（蓝色）为细胞核染色（图 5B）。

3. 小鼠受试对象的局部照射准备

观察 ϒH2Ax 免疫染色结果。当对辐照束的校准和定位满意后，即可开始实验。此时，处理一只小鼠所需的总时间（从动物准备到完成束流输送）约为 10-15 分钟，适用于 10 Gy 剂量、1 mm 束径的辐照处理。

  1. 从杰克逊小鼠实验室订购四周龄的雌性C57BL6/J小鼠。每笼饲养四只小鼠，并在小鼠五周龄时将普通饲料更换为高脂饮食。对小鼠进行耳部打孔，以提供唯一的识别标记。每天监测小鼠的健康状况。注意：不可使用金属标记，因其会在CT成像中导致条纹伪影。
  2. 在放射治疗或假手术处理前一天称量小鼠体重。将小鼠分为两组，分别接受放射治疗或假手术处理，并确保两组间体重无显著差异。在处理当天（小鼠六周龄时），重新称量所有小鼠并记录其质量。轻柔地将两组小鼠转运至放射治疗平台，注意尽量减少应激反应。
  3. 准备异氟烷气体麻醉舱。对两只小鼠进行麻醉，其中一只属于预定的照射组，另一只为假手术对照组。准备设定在低温档位的加热垫，用于术后恢复。
  4. 对接受照射的小鼠执行步骤1.2至1.4。对于假手术组小鼠，在治疗期间将其保留在麻醉舱内。确保麻醉舱靠近CFIR平台，以便将环境辐射的任何影响纳入考虑。在CT上确定目标区域后，通过机器人控制将小鼠移动，使该目标与放射线束对齐。将计算好的参数（旋转速度和治疗时长）输入剂量计划软件中。
  5. 放射治疗完成后，将假手术组和照射组小鼠均放回加热垫上，并持续监测直至其苏醒。
  6. 将假手术组和照射组小鼠均送回动物饲养设施，每天进行监测，每半周称重一次。为确认下丘脑增殖区靶向照射效果，治疗后第三天给予腹腔注射BrdU（50 mg/kg），并在首次BrdU暴露后一个月，通过BrdU与神经元标记物的免疫组织化学共标记检测各组间的神经发生情况（图6）2。

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结果

评估 CT 引导下的靶向性与准确性

系统的机械校准对于确保来自不同角度的射束均能相交于单一点至关重要。校准采用一种半自动的基于成像的方法完成，其端到端的对准精度已测得为0.2 mm29。该精度极为关键，因为下丘脑正中隆起结构的体积较小2。为验证此校准效果，我们使用嵌入水等效塑料模拟小鼠模型中的GAFchromic辐射敏感胶片测量了剂量分布35（图4B）。简言之，首先对小鼠受试体进行CT扫描，并确定腹侧基底部下丘脑靶区位置。随后计算辐射递送和旋转速度，并安装适当的准直器和滤片，以确保递送10 Gy的辐射剂量。接着，将设计为水等效塑料结构并嵌入GAFchromic辐射敏感胶片的模拟小鼠模型替代真实小鼠受试体，用于测量不同焦平面处的剂量分布。图4B展示了在模拟小鼠平台上使用1 mm直径射束进行弧形照射时，利用GAFchromic胶片获得的端到端测试结果。机架相对于模拟小鼠模型设置为45°角，同时机器人样本台围绕垂直轴旋转，从而生成一个辐射“弧”或锥形。半高全宽（...

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讨论

CT引导的局部照射（CFIR）是一种新颖且完整的系统方法，能够在CT引导下通过机器人控制将辐射场递送至小动物体内的靶区32。CFIR向小动物模型递送高度聚焦射线的能力为连接实验室研究与临床转化提供了新的研究机遇。本文描述了CFIR方法在精确辐射递送中特异性靶向下丘脑神经前体细胞群体的应用。我们在此展示了如何通过X射线胶片以及通过免疫组织化学在脑组织中校准并验证辐射递送的特异性。

此外，我们展示了如何利用该技术在特定脑区抑制神经发生。我们证明，可以靶向腹内侧下丘脑区域，在不改变邻近结构神经发生水平的情况下，特异性抑制正中隆起（median eminence）的神经发生。正中隆起神经发生的抑制伴随着代谢和活动水平的改变，并且在高脂饮食条件下，与假照光处理组相比，辐照组体重增加减少（图6）2。这些数据表明，成年期新生的下丘脑神经元在调节代谢和能量稳态中发挥重要作用。此外，结果提示，即使在成年期，过量的高脂饮食仍可能改变关键的代谢神经环路3。我们的研究结果拓展了目前对成年新生神经元功能的认识...

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披露

J.W. 与 Xstrahl 公司存在研究资助和咨询协议。

致谢

感谢 C. Montojo、J. Reyes 和 M. Armour 提供的技术建议与协助。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 F31 NS063550（资助对象：D.A.L.）、Basil O'Connor 新兴学者奖以及 Klingenstein 基金会和 NARSAD 的资助（资助对象：S.B.）支持。S.B. 是医学研究领域的 W.M. Keck 杰出青年学者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SARRP 研究平台XstrahlRS225Ahttp://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm
SARRP 照射屏蔽室Xstrahl可选，但应使用替代的铅屏蔽以限制辐射暴露
GAF 示色薄膜IPSGAFchromic ETB2
小鼠体模Gammex457从 Gammex 购买 0.5 cm × 30 cm × 30 cm 的固体水板，并切割至所需尺寸。
小鼠抗磷酸化组蛋白 H2AX Ser139 抗体Millipore, Inc.05-636克隆株 JBW301
高脂啮齿类动物饲料Research DietsD12492i60% 的热量来自脂肪，饲料应经过辐照处理
异氟烷Baxter Healthcare Corporation10019-360-40
0.01 M 柠檬酸钠Fisher Scientific将 1.471 g 柠檬酸钠溶解于 500 ml 去离子水中
Superfrost Plus 载玻片Fisher Scientific12-550-15
DAPIFisher Scientific细胞核复染剂
封片介质Fisher Scientific推荐使用 Vectashield 或 Gelvatol

参考文献

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功能性质疑成年下丘脑神经发生：基于局灶性放射学抑制的研究方法 下丘脑, 神经发生, 成年神经发生, 放射抑制, 神经干细胞, 神经前体细胞, 辐照, 焦点性照射, 脑功能成像, 功能分析
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