成年哺乳动物新生神经元的功能仍是当前研究的活跃领域。电离辐射可抑制新神经元的生成。利用计算机断层扫描引导的局部照射（CFIR），现可通过三维解剖定位特定的神经前体细胞群，来评估成年神经发生的生物学功能。
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方法文章
功能性质疑成年下丘脑神经发生：基于局灶性放射学抑制的研究方法 下丘脑, 神经发生, 成年神经发生, 放射抑制, 神经干细胞, 神经前体细胞, 辐照, 焦点性照射, 脑功能成像, 功能分析
本文内容
摘要
摘要
成年新生神经元的功能表征仍是一个重大挑战。通过侵入性病毒递送或转基因动物手段抑制成年神经发生的传统方法存在潜在的混杂因素，使得对这些研究结果的解释变得困难。然而，新兴的放射学工具使得研究者能够非侵入性地通过精确的解剖定位，探究特定成年新生神经元群体的功能。局部电离辐射可抑制新神经元的生成与分化，并可靶向特定的神经前体细胞区域。为了阐明下丘脑成年神经发生在调控生理过程中的潜在功能作用，我们开发了一种非侵入性局部照射技术，用于选择性抑制下丘脑正中隆起区域成年新生神经元的生成。本文描述了一种方法 C计算机断层扫描引导的 f局部 ir辐射（CFIR）递送，以实现对小型动物的精确定位和准确解剖靶向。CFIR采用三维容积成像引导技术进行辐射剂量的定位与靶向，可最大限度减少非靶向脑区的辐射暴露，并实现具有锐利束流边界的适形剂量分布。本方案不仅可用于探究成年新生神经元的功能，同时也为放射生物学、肿瘤生物学和免疫学领域的研究问题提供了新的途径。这些放射学工具将有助于推动从实验室基础研究到临床应用的转化。
引言
最近的研究发现表明，成年哺乳动物的大脑具有显著的可塑性。在整个成年期，成年新生神经元会在哺乳动物大脑的特定微环境中持续产生1。这些成年新生神经元的功能是什么？更重要的是，它们是否在生理和行为中发挥作用？传统上，针对这一主题的研究主要集中在侧脑室的室下区和海马体的颗粒下区；然而，最近的研究已揭示了其他脑区（如哺乳动物下丘脑）中也存在神经发生现象2。已有报道指出，在出生后及成年期的下丘脑中均存在神经发生2-10，而这些新生下丘脑神经元的功能仍是当前研究的热点领域。
成年出生神经元的功能表征对整个神经科学领域而言仍是一个重大挑战。由于目前缺乏仅特异性表达于单一神经前体细胞群体的分子标记物，针对特定神经前体细胞群体的选择性抑制仍然受限11。因此，通过基因靶向手段从这些神经前体细胞中选择性清除成年出生的神经元仍十分困难。同样，利用病毒递送方法靶向成年出生神经元也存在潜在的混杂因素，例如可能对局部环境造成损伤和引发炎症反应12。
然而，新的放射学工具正在出现，这些工具能够规避上述混杂因素，并通过在小型动物中进行准确而精确的解剖定位来研究这些问题。电离辐射能够抑制新神经元的生成与分化，从而提供一种非侵入性方法来靶向神经前体细胞群体13-15。最近，我们描述了哺乳动物下丘脑正中隆起（ME）中的一个生发区域，....
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方案
动物使用
获得机构动物护理与使用委员会对标准护理和使用方案的批准。本方案是为5.5-10周龄小鼠的局部照射研究而制定的。 周 老年C57BL/6J小鼠，如先前所述（图2)2。然而，其他年龄段及小型动物物种（大鼠、仓鼠、地松鼠， 等等。也可使用，前提是具备有效的麻醉方案以及能够识别感兴趣区域（ROI）的放射解剖图谱。
1. CT引导放射学平台的校准
针对所使用的每种准直器尺寸和X射线管滤波器类型，预先在放射学平台上进行基于胶片的辐射剂量校准。为了将弧形照射束精准定位至目标区域，使用大多数商用放射治疗平台配备的辐射剂量计划软件49，根据辐射剂量、基于小鼠CT扫描确定的兴趣区域（ROI）深度以及机器人平台的旋转速度，计算所需的照射时间；由于不同放射治疗平台之间的具体操作存在差异，本方案中省略了相关细节。为通过CT成像可视化腹侧下丘脑2（图3），应使用0.4 mm焦点尺寸的X射线管，射线能量设为100 kVp，并采用1 mm铝滤波。针对HPZ的局部照射，应将X射线管设置为225 kVp、13 mA、1 mm焦点尺寸，并配备0.15 mm铜滤波，在0.6 cm组织深度处于4.6分钟的治疗时间内递送10 Gy的辐射剂量....
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结果
评估 CT 引导下的靶向性与准确性
系统的机械校准对于确保来自不同角度的射束均能相交于单一点至关重要。校准采用一种半自动的基于成像的方法完成，其端到端的对准精度已测得为0.2 mm29。该精度极为关键，因为下丘脑正中隆起结构的体积较小2。为验证此校准效果，我们使用嵌入水等效塑料模拟小鼠模型中的GAFchromic辐射敏感胶片测量了剂量分布35（图4B）。简言之，首先对小鼠受试体进行CT扫描，并确定腹侧基底部下丘脑靶区位置。随后计算辐射递送和旋转速度，并安装适当的准直器和滤片，以确保递送10 Gy的辐射剂量。接着，将设计为水等效塑料结构并嵌入GAFchromic辐射敏感胶片的模拟小鼠模型替代真实小鼠受试体，用于测量不同焦平面处的剂量分布。图4B展示了在模拟小鼠平台上使用1 mm直径射束进行弧形照射时，利用GAFchromic胶片获得的端到端测试结果。机架相对于模拟小鼠模型设置为45°角，同时机器人样本台围绕垂直轴旋转，从而生成一个辐射“弧”或锥形。半高全宽（.......
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讨论
CT引导的局部照射（CFIR）是一种新颖且完整的系统方法，能够在CT引导下通过机器人控制将辐射场递送至小动物体内的靶区32。CFIR向小动物模型递送高度聚焦射线的能力为连接实验室研究与临床转化提供了新的研究机遇。本文描述了CFIR方法在精确辐射递送中特异性靶向下丘脑神经前体细胞群体的应用。我们在此展示了如何通过X射线胶片以及通过免疫组织化学在脑组织中校准并验证辐射递送的特异性。
此外，我们展示了如何利用该技术在特定脑区抑制神经发生。我们证明，可以靶向腹内侧下丘脑区域，在不改变邻近结构神经发生水平的情况下，特异性抑制正中隆起（median eminence）的神经发生。正中隆起神经发生的抑制伴随着代谢和活动水平的改变，并且在高脂饮食条件下，与假照光处理组相比，辐照组体重增加减少（图6）2。这些数据表明，成年期新生的下丘脑神经元在调节代谢和能量稳态中发挥重要作用。此外，结果提示，即使在成年期，过量的高脂饮食仍可能改变关键的代谢神经环路3。我们的研究结果拓展了目前对成年新生神经元功能的认识.......
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披露
J.W. 与 Xstrahl 公司存在研究资助和咨询协议。
致谢
感谢 C. Montojo、J. Reyes 和 M. Armour 提供的技术建议与协助。本工作由美国国立卫生研究院资助项目 F31 NS063550（资助对象：D.A.L.）、Basil O'Connor 新兴学者奖以及 Klingenstein 基金会和 NARSAD 的资助（资助对象：S.B.）支持。S.B. 是医学研究领域的 W.M. Keck 杰出青年学者。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SARRP 研究平台 | Xstrahl | RS225A | http://www.xstrahl.com/xstrahlrs225.htm |
| SARRP 照射屏蔽室 | Xstrahl | 可选，但应使用替代的铅屏蔽以限制辐射暴露 | |
| GAF 示色薄膜 | IPS | GAFchromic ETB2 | |
| 小鼠体模 | Gammex | 457 | 从 Gammex 购买 0.5 cm × 30 cm × 30 cm 的固体水板，并切割至所需尺寸。 |
| 小鼠抗磷酸化组蛋白 H2AX Ser139 抗体 | Millipore, Inc. | 05-636 | 克隆株 JBW301 |
| 高脂啮齿类动物饲料 | Research Diets | D12492i | 60% 的热量来自脂肪，饲料应经过辐照处理 |
| 异氟烷 | Baxter Healthcare Corporation | 10019-360-40 | |
| 0.01 M 柠檬酸钠 | Fisher Scientific | 将 1.471 g 柠檬酸钠溶解于 500 ml 去离子水中 | |
| Superfrost Plus 载玻片 | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| DAPI | Fisher Scientific | 细胞核复染剂 | |
| 封片介质 | Fisher Scientific | 推荐使用 Vectashield 或 Gelvatol |
参考文献
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Lee, D. A., et al. Tanycytes of the hypothalamic median eminence form a diet-responsive neurogenic....
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重印与许可
