检测，可视化和定量活性氧的生成在变形虫模型系统

Summary

我们适于一组协议对活性氧簇（ROS）可以在不同的变形虫和哺乳动物细胞模型被应用于用于定性和定量研究的测量。

Abstract

活性氧簇（ROS）包括一系列反应性和短命的，含氧分子，这被动态地相互转化或消除或者催化或自发的。由于大多数ROS和它们的来源和亚细胞定位的多样性的生命周期短，一个完整的画面只能通过协议的组合仔细的测量来获得。这里，我们提出使用OxyBurst绿色（OBG）一组三个不同的协议包被的珠，或二氢乙（DHE）和的Amplex红外线的（AUR），并监控定性和定量在专业的吞噬细胞如粘菌各种活性氧。我们优化了小珠包衣方法和用过的OBG-包被的珠子和现场显微镜来动态可视化intraphagosomal ROS生成在单细胞水平。我们从大肠杆菌鉴定脂多糖（LPS） 大肠杆菌作为一种有效的刺激活性氧产生在盘基网柄 。此外，我们ðeveloped实时，用DHE和AUR定量测定细胞内超氧化物和细胞外H _{2 O 2}生产，分别介质通量测定。

Introduction

活性氧（ROS）参与多种生物过程，如宿主防御，信号传导，组织发育和响应于损伤以及高血压和癌症。在充分研究的吞噬体NADPH氧化酶的机器是专门为快速ROS的产生，被称为氧化爆发，杀死细菌摄取中性粒细胞"吞噬体^1。此外，电子作为线粒体呼吸链的副产品泄漏，以前被认为是只对活性氧的不受管制的来源负责。但最近，它被确定为促进小鼠巨噬细胞² intraphagosomal杀灭细菌的重要机制。近年来，社会变形虫， 粘菌 ，已经成为一个强大的和流行的模型来研究先天免疫反应的细胞的内在机制。事实上， 粘菌和人分享的吞噬细胞节约molecula的一个令人惊讶的高度负责检测的细菌，吞噬和杀灭^3,4Ř机器。蛋白和相关的活性氧的产生或解毒，如NADPH氧化酶，过氧化氢 ​​酶，超氧化物歧化酶的酶的同源物，可以在人类和粘菌中找到。作为最好的学习变形虫盘基网柄呈现在哺乳动物模型系统的一些独特的优势。它们生长于室温下，无需对CO _2，具有8-10个小时的倍增时间。他们可以很容易地保持为贴壁或悬浮培养。此外，由于他们的全部测序和注释的单倍体基因组，并易于遗传操作， 盘基网柄已经成为一个非常有吸引力的实验模式生物。

在以前的研究中，荧光素（统称为OxyBurst绿，OBG），该氧化的ROS后发出荧光的各种氯化和氟化衍生物，已被用来作为一个ROS记者。细胞穿透物ESTerified衍生工具是用来衡量细胞质活性氧，而细胞透性葡聚糖或蛋白偶联衍生物用于测量细胞外活性氧。特别是，OBG BSA包被的磁珠已经被用来检测吞噬体ROS产生在哺乳动物细胞^5。然而，酶标仪为基础的方法只能给从细胞群体的平均ROS生成曲线。本协议中，通过使用粘菌 ，专业的吞噬细胞，优化实验条件下，我们获得稳定，高效的吞噬功能无任何偶联上调理素珠。 DHE已被应用于各种模型系统中，如哺乳动物嗜中性粒细胞和巨噬细胞，以检测ROS产生^6-9。同时，也有一些争议的方法^8,10的特异性和灵敏度。如Amplex Red试，AUR的是pH值，这使得它更适合于测量较不敏感的荧光强度的改进版本活性氧在非中性或弱酸性milieus。 AUR已在几种哺乳动物系统^11,12最近被应用，但其在非哺乳动物模型，这往往需要弱酸性生长介质，使用了尚未见报道。此外，也没有公布协议的定量和动态测量ROS的产生和本地化的社会变形虫盘基网柄 。

所提出的协议集的目标是提供一个简单而灵活的解决方案来监控各种活性氧和他们的定位，并进一步给出见解活性氧有关的细胞机制。对于OBG实验中，我们用显微镜实时监测吞噬体ROS生成的OBG包被的磁珠由盘基网柄细胞摄取后的全过程，并提供了一种新的方法来研究intraphagosomal杀灭细菌的机制。我们在盘基网柄优化培养基通量DHE和AUR分析，测量细胞内superoxIDE和细胞外H _{2 O 2}生产，分别通过使用LPS作为一种有效的ROS刺激物。需要注意的是脂多糖，最近证实会增加对细菌的吞噬¹³ 粘菌的杀菌活性。此外，随着DEDTC和过氧化氢 ​​酶处理明确地证实了这两种方法特异性地测量不同类型和ROS在盘基网柄亚细胞定位。最后，OBG测定可适应任何粘附的吞噬细胞，通过进一步opsonizing珠粒与配体为动物细胞的吞噬受体。原则上，DHE和AUR分析也可以进行微调，根据合适的实验条件下在任何附着或不依从小区的测量。

Protocol

1。可视化和ROS的产生在吞噬体的定性测量

该OBG包被的磁珠应该提前做好准备。珠涂布过程和琼脂覆盖技术是改编自出版的参考文献^5,14。

1. 加入1毫升悬浮液中3.0微米羧化硅珠（约1.8×10 ⁹个珠）到1.5mL管中，洗涤珠粒通过快速旋转和涡旋3倍，用1ml的PBS中。
2. 重悬珠在1ml的PBS中含25毫克​​/毫升氨腈（激活的羧化的二氧化硅珠共价结合预先标记的BSA）孵育在车轮15分钟。
3. 洗涤3次用1ml偶联缓冲液（0.1M硼酸钠，pH 8.0）中通过快速离心（离心机全速在台式微型离心机，持续5秒或替代离心机在2000×g下在台式离心机1分钟），并涡旋去除多余的氰胺。
4. 混洗过的小珠用500μl的coupling含有1毫克的OxyBurst绿色（OBG）H2HFF（二氢-2'，4,5,6,7,7' - hexafluorofluorescein）-BSA缓冲液，填补该管，用氮气从标准气体罐压盖之前，并孵化在车轮14小时（过夜）在室温在黑暗中。
5. 洗珠2倍1毫升缓冲液淬火（250 mM的甘氨酸的PBS），以除去未反应的OBG，并两次偶联缓冲液通过快速旋转和涡旋消除淬火缓冲区。
6. 加入1 ml偶联缓冲液含50微克的Alexa Fluor 594琥珀酰亚胺酯共轭对BSA。用氮气填充管压盖之前，并孵育在车轮为1.5小时，在室温下在黑暗中。
7. 洗珠3倍，用1ml通过快速旋转和涡旋停止反应淬火缓冲区，然后洗珠通过快速旋转和涡旋3倍用1毫升的PBS。
8. 最后，重悬珠在1ml的PBS中与2微升10％w / v的叠氮化物对于长期贮存。测量concentration个珠子的悬浮液用血细胞计数器（通常大约1-2×10 ⁹个珠/毫升）中，填充在管与氮封端之前，并在4℃储存在暗处。
9. 该OBG荧光素的涂布效率可以通过使用激发波长为500nm的检查的发射光谱进行测试。当通过H _{2 O 2}中的辣根过氧化物酶（HRP）的存在下被氧化，被氧化的珠的荧光强度，在发射峰（538纳米），是11〜12倍的比未氧化涂覆的珠粒更高。
10. 收获指数从10厘米的培养皿中生长粘菌细胞，细胞板在3厘米菜肴的不同密度用光学透明的塑料或玻璃底部，并且它们生长过夜。选择大约80％汇合用于实验的菜肴。培养盘基网柄细胞的详细协议已经出版^15。
11. 与LoFlo培养基（LF介质）更换培养基，孵育在实验中，为了降低HL5C培养基中的细胞外和内体内的自体荧光前2小时。
12. 并联，熔体10毫升1.5％细菌用琼脂的LF介质中，以形成一个琼脂层约1mm厚，等待10-15倒入琼脂在一个平面上（10厘米×10厘米，即在玻璃板）分钟固化。切琼脂层成2厘米×2厘米的正方形并将其放置在LF媒体以备后用。
13. 同时，制备纺丝盘或宽视场显微镜中，将环境室的温度保持在22℃，并调节该实验设置。 （见讨论补充意见）。
14. 经过2小时温育后，吸自3 cm培养皿中的LF介质，但细胞单层仍应被覆盖的介质薄膜。稀释包被的珠子，以1.5×10 ⁷个珠/毫升，并加入10微升到细胞层。
15. 就拿一平方琼脂板，排出多余液体，但保持湿润。轻轻的把日ë琼脂平上的细胞层的顶部。不要移动琼脂广场时，躺在细胞。该琼脂覆盖是用来增加珠和细胞之间的接触，从而改善吸收，并且它也略微压缩的细胞，更好保持它们在物镜的焦平面上。
16. 将盖子上的菜，把它放在显微镜载物台，并自动拍照的红色，绿色和相位通道间隔1分钟，2小时或更长的时间。
17. 选择并专注于含有吞噬的整个过程的细胞活动。合并优化的3个通道，并使用专业图像处理软件组装的图片拍成电影。量化的红色和绿色通道，每个通道选择的珠的荧光强度，和绿色/红色的比例将反映动态的吞噬体ROS产生的细胞。

2。细胞内超氧化物歧化酶生产的定量和中等通量的测量

1. 征收o盘基网柄的10ml HL5C介质的NE 80％汇合的菜。离心机粘菌细胞在850×g离心5分钟，仔细，彻底吸出多余的介质。重悬细胞SS6.4缓冲液[0.12 1M山梨醇中索伦森缓冲液（14.69毫KH ₂ PO ₄和6.27毫米的Na ₂ HPO _4），pH值6.4]，计数细胞并稀释至6×10 ⁶细胞/ ml的最终密度（见讨论补充意见）。
2. 加50微升细胞悬浮液变成白色不透明的96孔板的各孔中（见讨论额外注释）。
3. 稀释DHE股票（30毫米DMSO）500倍的SS6.4，移液管加入50μl稀释DHE到每​​一个使用多道移液器如果有必要很好。 DHE的最终浓度为30μM。反应立即开始。
4. 刺激剂或抑制剂可以在这一点上，根据具体需要可以添加，或者在其它的时间点。
5. 使用结束点"顶部阅读＆＃34，荧光酶标仪，荧光激发/发射在522 nm/605 nm处的模式，阅读每2分钟1小时，中摇5秒/分，在22°C

3。定量和细胞外的高通量测量H _{2 O 2}生产

1. 跟随在2.1和2.2中所述的相同步骤。
2. 加入5微升的HRP的股票（100 U / ml的蒸馏水中）为10毫升SS6.4，旋涡准备稀释的HRP或颠倒离心管拌匀并保持在冰上，供以后使用。稀释的HRP解决方案是在0.05单位/毫升。
3. 通过混合AUR库存中（10mM AUR在DMSO中）和稀释的HRP溶液注入SS6.4缓冲到最终浓度为6.25μM，0.005 U / ml的，准备AUR反应混合物分别。作为一个例子，对40的反应制备反应混合物中，混合1600微升SS6.4用400微升稀释的HRP和2.5微升AUR原液。
4. 加入50微升AUR组合TURE到每个使用多道移液器如果需要良好。现在，反应开始。
5. 刺激剂或抑制剂可以在这一点上，根据具体需要可以添加，或者在其它的时间点。
6. 使用结束点"顶部读数"模式中的荧光微板读数器，具有荧光的激发/发射在530 nm/590 nm处，读取每2分钟1小时后，培养基中摇动5秒/分钟，在22℃下

Results

ROS在吞噬体的生成，可以通过显微镜（ 文件S1）定性和动态可视化。红色荧光通过的Alexa Fluor 594发射的是pH值不敏感的，并保持在吞噬体环境恒定，而OBG的氧化增加其荧光的绿色通道。 在体外的发光光谱的氧化和未氧化的OBG-包被的珠子相比较， 如图1B所示 ，示出的氧化后的强度显著增加。为方便现场活动的可视化，这两个通道内摄取1分钟​​合并，由红吞噬过程中所产生的颜色变为橙色由野生型AX2细胞。在绿色荧光的增加表明ROS的产生可能是直接在吞噬体。通过使用酶标仪，细胞内超氧化物的介质通量定量测定和细胞外H _{2 O 2}生产示于FIGU重新2C和图3B，分别为。基底ROS产生从AX2细胞，可能是从正规氧代还原代谢，可以测量的。当细胞用LPS刺激，对ROS产生的信号在两个测定显著增加。另外，在DHE测定，蓝色荧光（二氢乙）的降低和红色荧光（乙锭）信号的增加是负相关，如预期。 ，ROS的产生由两个DHE和AUR实验测得的定位均证实在图2D

Discussion

相比于先前描述的方法中，OBG测定动态可视化，而不是从细胞群中测量的平均ROS信号吞噬体ROS的产生的过程中在单细胞水平。这样的人口平均的方法往往掩盖造成的非同步吞噬作用的关键信息。我们成功地适应DHE和AUR检测到粘菌和优化的协议。最重要的是，我们指定这两个实验测得的种类和活性氧的亚细胞定位。两者合计，整个集粘菌活性氧测量协议提供了一个有用和强大的系统来研究活性氧有关的细胞机制，如先天性免疫，细胞分化和细胞内信号。

对于OBG测定法，涂布小珠的制备是在实验的成功至关重要。由于在哺乳类受体介导的巨噬细胞吞噬的复杂性Ñ ​​细胞，颗粒需要进行调理（ 例如使用的IgG）来触发摄入。在哺乳动物细胞中的低吸收率严重限制了吞噬体ROS生成的各个事件的可视化。吞噬作用中Dicytostelium率已经观察到在10-20比在巨噬细胞¹⁷倍以上，与本协议中，我们获得健壮和有效的吞噬作用没有任何缀合调理素上的珠子。这不仅简化了小珠的涂层的方法，但降低了OBG荧光素染料的氧化处理过程中的风险。因为OBG荧光素...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
羧化二氧化硅珠	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C 培养基	HLC0102
LoFlo 培养基	中等	LF1001
Bacto 琼脂	BD	204010
二氢乙锭	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
辣根过氧化物酶	罗氏	10108090001
二乙基硫代氨基甲酸酯 （DEDTC）	Sigma	D3506-100G
过氧化氢酶	Sigma	C9322-1G
氰胺	Sigma	187364-25G
脂多糖	Sigma	L2630-25G
EQUIPMENT
>ibidi μ-培养皿 35 毫米，高	ibidi	81156	底部由光学透明塑料制成
MatTek 培养皿 35 毫米	MatTek 公司	P35G-1.5-14-C	底部由 a 制成玻璃盖玻片
Scepter 细胞计数仪	Merck Millipore	PHCC00000
白色 96 孔板	Nunc	236108
离心机	SORVALL	Legend RT
微孔板检测仪	BioTek	Synergy Mx