在阿米巴模型系统中检测、可视化与定量活性氧的生成

摘要

我们改进了一套可用于多种阿米巴和哺乳动物细胞模型中活性氧（ROS）检测的方案，适用于定性和定量研究。

摘要

活性氧（ROS）包含一系列具有反应性且寿命短暂的含氧分子，这些分子可通过催化或非催化方式动态地相互转化或被清除。由于大多数活性氧的寿命较短，且其来源和亚细胞定位具有多样性，因此只有通过结合多种实验方法进行精细测量，才能获得全面的认识。本文中，我们介绍了三种不同的实验方案，分别利用OxyBurst Green（OBG）包被的微珠、二氢乙啶（DHE）以及Amplex UltraRed（AUR），对Dictyostelium等专业吞噬细胞中的多种活性氧进行定性和定量监测。我们优化了微珠的包被流程，并结合OBG包被微珠与活细胞显微成像技术，在单细胞水平上动态可视化吞噬体内的活性氧生成过程。我们鉴定出来源于E. coli的脂多糖（LPS）是诱导Dictyostelium产生活性氧的强效刺激物。此外，我们还建立了基于DHE和AUR的实时、中通量检测方法，分别用于定量测定细胞内超氧阴离子和细胞外H₂O₂的生成水平。

引言

活性氧（ROS）参与多种生物学过程，如宿主防御、信号传导、组织发育、损伤反应以及高血压和癌症等。其中研究较为深入的吞噬体NADPH氧化酶复合物，其功能是快速产生活性氧，即所谓的氧化爆发，以杀灭中性粒细胞吞噬体中摄入的细菌¹。此外，线粒体呼吸链过程中电子泄漏曾被认为仅仅是活性氧的一种非调控性来源；但最近研究发现，该机制在小鼠巨噬细胞的吞噬体内杀菌过程中也发挥着重要作用²。近年来，社会性变形虫Dictyostelium已成为研究固有免疫反应细胞内在机制的有力且广受欢迎的模型。事实上，Dictyostelium与人类吞噬细胞在负责细菌感知、吞噬和杀灭的分子机制方面表现出出人意料的高度保守性^3,4。与活性氧生成或解毒相关的蛋白和酶的同源物，如NADPH氧化酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶，在人类和Dictyostelium中均可找到。作为研究最为深入的变形虫，Dictyostelium相较于哺乳动物模型系统具有多个独特优势：它们可在室温下生长，无需CO₂环境，倍增时间为8–10小时；可轻松以贴壁或悬浮培养方式维持。此外，得益于其已完全测序并注释的单倍体基因组以及易于进行遗传操作的特点，Dictyostelium已成为极具吸引力的实验模式生物。

在以往的研究中，多种荧光素的氯化和氟化衍生物（统称为 OxyBurst Green，OBG）被用作活性氧（ROS）的报告分子，这些衍生物可在被 ROS 氧化后发出荧光。其中，细胞膜通透性的酯化衍生物用于检测胞质内的 ROS，而细胞膜不通透的葡聚糖或蛋白偶联衍生物则用于检测细胞外的 ROS。特别是，OBG 标记的 BSA 包被微球已被用于检测哺乳动物细胞吞噬体内的 ROS 生成⁵。然而，基于微孔板读数仪的方法只能获得细胞群体的平均 ROS 生成曲线。本方案利用专性吞噬细胞——Dictyostelium，以及优化的实验条件，实现了稳定且高效的吞噬作用，且无需在微球上偶联任何调理素。二氢乙啶（DHE）已被广泛应用于多种模式系统（如哺乳动物中性粒细胞和巨噬细胞）中检测 ROS 的产生^6-9。然而，该方法的特异性和灵敏度仍存在一些争议^8,10。作为 Amplex Red 的改进版本，AUR 的荧光强度对 pH 的敏感性较低，因此更适合用于中性或弱酸性环境中的 ROS 检测。AUR 近期已在多个哺乳动物系统中得到应用^11,12，但尚未见其在非哺乳动物模型（这些模型通常需要弱酸性培养基）中的使用报道。此外，目前尚无公开发表的实验方案可用于定量、动态地检测社会性变形虫 Dictyostelium 中 ROS 的生成及其定位。

本系列实验方案旨在提供一种简便且多功能的方法，用于监测多种活性氧（ROS）及其在细胞内的定位，从而进一步揭示与ROS相关的细胞机制。对于OBG检测法，我们采用活细胞显微成像技术，实时观察Dictyostelium细胞吞噬OBG包被的微珠后吞噬体中ROS生成的全过程，并提出了一种研究吞噬体内细菌杀灭机制的新方法。我们已在Dictyostelium中优化了中等通量的DHE和AUR检测方法，分别用于检测细胞内超氧阴离子和细胞外H₂O₂的生成，实验中使用脂多糖（LPS）作为强效的ROS诱导剂。需注意的是，最近已有研究表明LPS可增强Dictyostelium对被吞噬细菌的杀菌活性¹³。此外，通过DEDTC和过氧化氢酶处理，明确验证了这两种方法可特异性地检测Dictyostelium中不同类型及亚细胞定位的ROS。最后，OBG检测法可通过将微珠进一步包被动物细胞吞噬受体的配体，从而适用于任何贴壁型吞噬细胞。理论上，DHE和AUR检测法也可在适当的实验条件下，针对任何贴壁或非贴壁细胞进行精细调整后应用。

方案

1. 吞噬体中活性氧产生的可视化与定性测量

OBG 包被的珠子应预先制备。珠子包被步骤和琼脂覆盖技术改编自已发表的参考文献^5,14。

1. 加入1 ml 3.0 μm羧基化二氧化硅微球悬浮液（约1.8 × 10⁸个微球）⁹ 将珠子加入1.5 ml离心管中，用1 ml PBS洗涤珠子3次，每次通过快速离心和涡旋混合。
2. 将珠子重悬于1 ml含25 mg/ml氰胺的PBS中（用于活化羧基化硅胶珠，使其共价结合预先标记的BSA），在旋转仪上孵育15分钟。
3. 用1 ml偶联缓冲液（0.1 M硼酸钠，pH 8.0）洗涤3次，每次通过快速离心（在台式小型离心机中全速离心5秒，或 alternatively 在台式离心机中以2,000 × g离心1分钟）并涡旋振荡，以去除过量的氰胺。
4. 将洗涤后的磁珠与500 μl偶联缓冲液混合，缓冲液中含有1 mg OxyBurst Green (OBG) H2HFF（二氢-2',4,5,6,7,7'-六氟荧光素）-BSA，在封管前用标准气罐通入氮气，然后在避光条件下于室温在旋转仪上孵育14小时（过夜）。
5. 用1 ml淬灭缓冲液（PBS中含250 mM甘氨酸）洗涤磁珠2次，以去除未反应的OBG，再用偶联缓冲液洗涤2次，以去除残留的淬灭缓冲液 通过快速离心和涡旋混合。
6. 向偶联缓冲液中加入1 ml含50 μg Alexa Fluor 594 琥珀酰亚胺酯的溶液，用于与BSA偶联。盖盖前用氮气充满离心管，并在室温避光条件下于旋转仪上孵育1.5小时。
7. 用1 ml淬灭缓冲液快速离心并涡旋振荡洗涤磁珠3次，以终止反应；随后用1 ml PBS同样通过快速离心并涡旋振荡洗涤磁珠3次。
8. 最后，将珠子重悬于含有2 μl 10%（w/v）叠氮化钠的1 ml PBS中，用于长期保存。使用血细胞计数板测定悬浮液中珠子的浓度（通常约为1-2 × 10⁶ 个/ml）。⁹ beads/ml），封管前用氮气填充，并在避光条件下于4 °C保存。
9. 可通过在500 nm激发下检测发射光谱来测试OBG荧光素的包被效率。当被H₂O₂氧化时₂O₂ 在辣根过氧化物酶（HRP）存在下，氧化微球在发射峰（538 nm）处的荧光强度为11-12倍 高于非氧化涂层珠。
10. 收获对数生长期 盘基网柄菌 从10 cm培养皿中收集细胞，将不同密度的细胞接种于带有光学透明塑料或玻璃底的3 cm培养皿中，过夜培养。选择约80%汇合度的培养皿用于实验。一种培养 盘基网柄菌 细胞的研究已发表¹⁵.
11. 将培养基更换为低荧光培养基（LF培养基），并在实验前孵育2小时，以降低HL5C培养基的胞外和胞内内体自荧光。
12. 同时，将10 ml含1.5% Bacto琼脂的LF培养基融化，倒入平坦表面即 将10 cm × 10 cm的玻璃板制成约1 mm厚的琼脂层，静置10–15分钟使其凝固。将琼脂层切成2 cm × 2 cm的方块，置于LF培养基中备用。
13. 同时，准备共聚焦显微镜或宽场显微镜，将环境培养室的温度设置为 22 °C，并调整本实验所需的各项参数。（详见讨论部分中的附加说明）。
14. 孵育2小时后，吸出3 cm培养皿中的LF培养基，但细胞单层应仍被一层薄薄的培养基覆盖。将包被的微珠稀释至1.5 × 10⁷ 每毫升珠子溶液中加入10 μl至细胞层。
15. 取一块方形琼脂片，沥去多余液体但保持湿润。将琼脂片轻轻覆盖在细胞层上。琼脂片一旦置于细胞上后，不得移动。琼脂覆盖层可增加珠子与细胞之间的接触，从而提高摄取效率；同时还能轻微压迫细胞，使其更稳定地处于物镜的焦平面内。
16. 将盖子盖在培养皿上，置于显微镜载物台上，自动每隔1分钟在红色、绿色和相差通道各拍摄图像一次，持续2小时或更长时间。
17. 选择并聚焦包含完整吞噬过程的细胞事件。使用专业的图像处理软件，将优化后的三个通道合并，并将图像合成为视频。定量分析每个选定微珠在红色和绿色通道中的荧光强度，绿色与红色荧光强度的比值可反映细胞吞噬体活性氧（ROS）产生的动态变化。

2. 细胞内超氧阴离子生成的定量与中通量检测

1. 收集一个80%融合度的培养皿 盘基网柄菌 在10 ml HL5C培养基中。离心 盘基网柄菌 850 × g 离心 5 分钟，小心且彻底地吸除上清培养基。用 SS6.4 缓冲液 [0.12 M 山梨醇溶于 Sorensen 缓冲液 (14.69 mM KH₂PO₄ 和 6.27 mM Na₂HPO₄），pH 6.4]，计数细胞并稀释至终浓度为 6 x 10⁶ 细胞/毫升（详见讨论部分的附加说明）。
2. 向不透明白色96孔板的每个孔中加入50 μl细胞悬液（详见讨论部分中的附加说明）。
3. 将DHE储备液（DMSO中30 mM）用SS6.4稀释500倍，必要时使用多通道移液器将50 μl稀释后的DHE加入每孔中。DHE的终浓度为30 μM。反应立即开始。
4. 此时可根据具体需要加入刺激物或抑制剂，或其他时间点加入。
5. 使用终点 "顶部读数" 使用荧光酶标仪，激发/发射波长为522 nm/605 nm，22 °C条件下每2分钟读数一次，持续1小时，每分钟中速振荡5秒。

3. 细胞外 H₂O₂ 生成的定量与高通量测定

1. 按照 2.1 和 2.2 中所述的相同步骤进行操作。
2. 将5 μl HRP储备液（100 U/ml，溶于蒸馏水中）加入10 ml SS6.4溶液中，配制稀释的HRP溶液，涡旋振荡或倒置混匀，置于冰上保存备用。稀释后HRP溶液浓度为0.05 U/ml。
3. 将AUR储备液（10 mM AUR溶于DMSO）和稀释的HRP溶液加入SS6.4缓冲液中，配制AUR反应混合液，使AUR和HRP的终浓度分别为6.25 μM和0.005 U/ml。例如，配制40个反应所需的混合液时，将1600 μl SS6.4缓冲液、400 μl稀释HRP溶液和2.5 μl AUR储备液混合。
4. 必要时使用多通道移液器向每孔加入50 μl AUR混合液。此时反应开始。
5. 此时可根据具体需要加入刺激物或抑制剂，或其他时间点加入。
6. 使用终点 "顶部读数" 使用荧光微孔板读数仪，激发/发射波长为530 nm/590 nm，每2分钟读数一次，持续1小时，22 °C条件下，每次读数前中速振荡5秒。

结果

吞噬体中活性氧（ROS）的生成可通过显微镜进行定性和动态可视化观察（文件 S1）。Alexa Fluor 594 发出的红色荧光对 pH 不敏感，在吞噬体环境中保持稳定，而 OBG 被氧化后其绿色荧光通道的荧光增强。发射光谱 体外 氧化与非氧化的OBG包被珠的比较 图1B，显示氧化后荧光强度显著增强。为便于观察动态过程，将两个通道合并显示，野生型AX2细胞在吞噬后1分钟内，荧光颜色由红色转变为橙色。绿色荧光的增强表明可能在吞噬体内直接产生了活性氧（ROS）。通过使用微孔板读数仪，可实现对细胞内超氧阴离子和细胞外H₂O₂的中通量定量检测。₂O₂ 生产情况如图所示 图2C 和 图3B，分别。AX2 细胞的基础活性氧（ROS）产生可能源于常规的氧化还原代谢，可通过实验测定。当细胞经 LPS 刺激后，在两种检测中 ROS 产生的信号均显著增强。此外，在 DHE 检测中，蓝色荧光（二氢乙啶）信号的减少与红色荧光（乙啶）信号的增强呈预期的负相关关系。通过...

讨论

与先前描述的方法相比，OBG 检测法能够在单细胞水平上动态可视化吞噬体活性氧（ROS）的生成过程，而不是测量来自细胞群体的平均 ROS 信号。这类基于群体平均值的方法往往会掩盖由于吞噬作用不同步所导致的关键信息。我们成功地将 DHE 和 AUR 检测法应用于Dictyostelium，并优化了实验方案。最重要的是，我们明确了这两种检测方法所测定的活性氧的类型及其亚细胞定位。综上所述，这一整套针对Dictyostelium的活性氧检测方法为研究与活性氧相关的细胞机制（如先天免疫、细胞分化和细胞内信号传导）提供了一个有用且强大的系统。

对于OBG实验，包被珠的制备是实验成功的关键。由于哺乳动物细胞中受体介导的吞噬作用过程复杂，颗粒需经过调理（opsonized）例如 通过IgG介导以触发吞噬作用。哺乳动物细胞中较低的摄取效率严重限制了对单个吞噬体ROS生成事件的观察。吞噬作用的速率在 盘基网柄菌 比巨噬细胞中的水平高出10至20倍¹⁷，采用本方案可在不将任何调理素连接到珠子上的情况下，获得稳定...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
OxyBURST Green H2HFF BSA	Invitrogen	O-13291
Alexa Fluor 594	Invitrogen	A-20004
羧基化二氧化硅微球	Kisker Biotech	PSi-3.0COOH
HL5C 培养基	ForMedium	HLC0102
LoFlo 培养基	ForMedium	LF1001
细菌琼脂	BD	204010
二氢乙啶	Sigma	37291-25MG
Amplex UltraRed	Invitrogen	A36006
辣根过氧化物酶	Roche	10108090001
二乙基二硫代氨基甲酸盐（DEDTC）	Sigma	D3506-100G
过氧化氢酶	Sigma	C9322-1G
氰胺	Sigma	187364-25G
脂多糖	Sigma	L2630-25G
设备
ibidi μ-Dish 35 mm, high	ibidi	81156	底部由光学透明塑料制成
MatTek 35 mm 培养皿	MatTek corporation	P35G-1.5-14-C	底部由玻璃盖玻片制成
Scepter 细胞计数器	Merck Millipore	PHCC00000
白色 96 孔板	Nunc	236108
离心机	SORVALL	Legend RT
酶标仪	BioTek	Synergy Mx