一种基于荧光的外切酶检测方法用于表征人类早衰相关WRN外切酶的果蝇同源蛋白DmWRNexo及其在其他核酸酶中的应用

摘要

外切核酸酶在维持基因组稳定性方面发挥着关键作用。WRN外切核酸酶功能的缺失会导致早衰。研究该核酸酶的底物及其他需求因素 体外 有助于阐明其作用 体内在此，我们展示了一种快速且可重复的基于荧光的检测方法，用于测量其核酸酶活性。

摘要

WRN 外切核酸酶参与修复在 DNA 复制过程中或暴露于内源性或外源性基因毒素后发生的 DNA 损伤。它可能在防止重组中间产物的积累中发挥作用，这些中间产物通常会在暂时停滞的复制叉处积聚，这与缺乏 WRN 的细胞表现出的高重组表型一致。在人类中，外切核酸酶结构域是更大蛋白的N端部分，该蛋白还具有解旋酶活性，并含有对DNA和蛋白质相互作用重要的其他位点。相比之下，在果蝇（Drosophila）中，WRN 的外切核酸酶活性（DmWRNexo）由一个与推测的解旋酶不同的遗传位点编码，从而允许对外切核酸酶活性在基因组稳定性机制中的作用进行生化（和遗传）分析。在此，我们展示了一种荧光方法，利用纯化的重组 DmWRNexo 蛋白和末端标记的荧光寡核苷酸来测定 WRN 外切核酸酶活性。该系统比放射性检测具有更高的可重复性，因为底物寡核苷酸可稳定保存数月，同时提供一种更安全且相对快速的方法，用于对外切核酸酶活性进行详细分析，可确定其切割方向性、持续性和底物偏好性。

引言

核酸酶在细胞中具有重要作用，包括清除受损的DNA、解析Holliday连接体等非双链结构，以及在DNA复制过程中提供校对功能，这种校对能力既可内源于DNA聚合酶本身，也可由其外在因子提供¹核酸酶可通过从游离末端逐步降解DNA（外切核酸酶）或切割较长DNA分子内部的磷酸二酯键（内切核酸酶）发挥作用。核酸酶活性的丧失可导致高度特异性的基因组不稳定性表型。尽管RecQ解旋酶家族成员BLM发生突变会导致姐妹染色单体交换频率显著升高以及整体癌症发生率显著上升（由Payne和Hickson综述）²），WRN 蛋白的突变会导致早衰³；这两个家族成员之间最主要的区别在于WRN含有一个3'-5'外切酶结构域⁴. 对沃纳综合征（WS）患者基因型的分析已积累大量证据，表明WRN外切酶在维持基因组稳定性中发挥关键作用⁵，结合人类细胞中的点突变和缺失研究，并得到分离的外切酶结构域晶体学研究的支持⁶然而，WRN的外切酶活性与其核心解旋酶活性之间存在协同作用和相互交流⁷ 使其难以区分每个功能域及其对基因组稳定性的相对贡献。在植物和低等后生动物中，WRN 外切酶活性存在于一条缺乏解旋酶活性的单一多肽链上^8-10 （综述见于 Cox 和 Boubriak¹¹）；已在生物化学上证实 拟南芥 该外切酶与相应的WRN解旋酶协同作用，有效重建了在脊椎....

方案

1. 底物寡核苷酸的制备

1. 合成定制寡核苷酸。
   1. 设计一条在5'端偶联荧光素分子的单链寡核苷酸；该链将作为每种底物的骨架。（注意：此设计适用于具有3'-5'外切酶活性的酶；若为5'-3'极性的外切酶，则应使用3'端偶联的骨架链。若极性未知，应同时测试3'和5'端偶联的骨架链。）
   2. 设计互补链，使其与荧光标记的寡核苷酸退火后形成所需的一种或多种双链底物。注意：互补链不偶联荧光基团。订购时需注明采用PAGE纯化（仅脱盐纯化不够充分）。
   3. 将寡核苷酸储备液以10 mM缓冲液配制为1 nmol/μl浓度，于−20 °C避光保存。
2. 将标记的骨架寡核苷酸与各未标记的互补寡核苷酸按标记链:未标记链为1:1.2的摩尔比混合于缓冲液中（10 mM Tris-HCl pH 7.6，1 mM EDTA pH 8.0，50 mM NaCl）。（注意：理想比例为1:1，但更重要的是确保所有标记链均被结合。1:1至1:1.5的比例均可使用。）
3. 将水浴锅或加热块预热至95 °C，将退火混合物放入其中孵育3分钟，随后关闭加热源，使体系缓慢冷却（1 °C/min）至低于30 °C。
4. 通过跑原生10%聚丙烯酰胺凝胶（10% 19:1丙烯酰胺:双丙烯酰胺，溶于1×Tris-硼酸-EDTA缓冲液（TBE，89 mM Tris碱，89 mM硼酸，2 mM EDTA），用....

结果

执行 体外 除了实际分析外，外切酶活性分析还需要进行多项 preparatory 步骤。各步骤的概览如图所示。 图1.

在进行基于荧光的外切酶活性检测之前，必须优化尿素-丙烯酰胺凝胶分离后荧光标记寡核苷酸底物的检测条件，使用合适的荧光成像系统以获得最佳结果。滤光片的选择至关重要，因为它会显著影响整个检测的灵敏度——我们的寡核苷酸底物采用荧光素标记，因此需要能够支持470 nm激发光和520 nm发射光的滤光片。使用该滤光片时，可通过调整成像仪的灵敏度和分辨率，增强对低浓度底物（或产物）的检测能力（图2A 和 2B）。需要注意的是，滤光片带宽具有一定容差，即使使用非最优滤光片（激发520 nm/发射580 nm），仍可实现对底物的部分检测，但灵敏度显著降低（图2C）。我们建议选择适当的标记寡核苷酸浓度和成像仪设置，以确保底物信号稳定可检（图2B 及 图2 右侧图中.......

讨论

纯化蛋白外切酶活性的测定需要分析其DNA切割产物。通过聚丙烯酰胺凝胶分离标记的切割产物，可观察外切酶对DNA的连续切割过程。传统方法涉及使用放射性标记物对DNA底物进行末端标记。例如 ³²P 或 ³⁵S），但存在使用放射性标记固有的缺点（成本高、安全性问题以及随时间推移的不稳定性）。为克服这些问题，我们开发了一种采用荧光标记DNA底物的外切酶检测方法，并展示了该检测系统在测定WRN外切酶同源物核酸酶活性中的实用性 黑腹果蝇DmWRNexo¹⁰本检测方法的关键优势在于，荧光标记的底物在时间上具有稳定性，从而提高了实验的可重复性和标准化程度 例如 在比较不同批次纯化的重组外切核酸酶时，我们已利用该检测方法对DmWRNexo核酸酶活性进行了详细分析，从而确定了其核酸酶极性、持续性以及底物和阳离子偏好（另见^13,14).

尽管该检测方法最初是为测定 DmWRNexo 及相关同源的 3'-5' DNA 外切核酸酶活性而开发，但它同样适用于具有相反极性的.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/材料
定制寡核苷酸	Eurogentec		必须以高纯度获得这些寡核苷酸例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）纯化。
		5'FLO	荧光素-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'
		bubble	5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'
40% 19:1 丙烯酰胺溶液	Severn Biotech	20-2400-05	注意：该物质为强效神经毒素，操作时必须始终佩戴手套
His-Trap 柱（1 ml）	GE Healthcare	17-5247-01
其他所有试剂	任一信誉良好的供应商		必须为分子生物学级别（无DNase）；微量离心管同样应无DNase和RNase
仪器
Hoefer SE400 凝胶电泳装置	Hoefer	SE400-15-1.5
FLA-3000（磷屏与荧光成像仪）	Fuji
Image Reader V2.02	FujiFilm
Image Gauge V3.3	FujiFilm