用于测定与哺乳动物细胞相关的细菌活力的荧光显微镜方法

摘要

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在接触真核细胞后是否能够存活以及其存活机制。本文概述了使用荧光染料检测单个细菌在宿主细胞内及与宿主细胞相关时活力状态的实验方案。

摘要

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在暴露于真核细胞后是否以及如何存活。目前用于回答这些问题的实验方法包括菌落计数法、庆大霉素保护法和电子显微镜法。菌落计数法和庆大霉素保护法仅能评估整个细菌群体的存活能力，无法判断单个细菌的活力状态。电子显微镜可用于评估单个细菌的存活情况，并提供其在宿主细胞内定位的信息。然而，细菌通常表现出不同的电子密度，使得活力判断较为困难。本文介绍了一系列使用荧光染料的实验方案，可揭示宿主细胞内及与宿主细胞相关的单个细菌的活力状态。这些方法最初用于评估淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）在原代人中性粒细胞中的存活情况，但应适用于任何细菌与宿主细胞相互作用的研究。这些实验方案结合使用膜通透性荧光染料（SYTO9 和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]），可对所有细菌进行染色，以及膜不通透性荧光染料（碘化丙啶和 SYTOX Green），后者仅能进入无活力的细菌。在对真核细胞进行膜通透化处理之前，加入抗体或荧光试剂以识别细胞外细菌。因此，这些方法能够区分黏附于真核细胞表面以及位于其内部的细菌的活力状态。本文还提供了一种将活力染料与针对真核细胞标记物的荧光抗体联合使用的方案，以确定单个细菌在细胞内的亚细胞定位。本文所讨论的细菌活力染料是对传统微生物学技术的灵敏补充或替代方法，可用于评估单个细菌的活力，并提供细菌在宿主细胞内存活位置的相关信息。

引言

细菌与其宿主之间存在着动态的相互作用和共同进化关系。细菌已进化出黏附器官、分泌系统和/或产生毒素的能力，使其能够有效感染宿主的吞噬细胞和非吞噬细胞。同时，细菌还必须应对宿主免疫系统的识别以及其抗菌活性。宿主免疫系统由先天性和适应性免疫组分构成，包括物理和化学屏障、免疫细胞、补体系统以及其他体液免疫成分。尽管许多细菌易被宿主多层次的免疫反应杀灭并清除，但一些致病性和机会性细菌已进化出感染多种宿主细胞并逃避宿主免疫清除的机制¹。Neisseria gonorrhoeae（淋病奈瑟菌）便是一种高度适应在人类宿主体内持续存在的细菌病原体。N. gonorrhoeae 易于定植于泌尿生殖道、咽部、结膜和直肠黏膜上皮细胞的管腔表面。定植过程会引发黏膜部位大量中性粒细胞的募集。中性粒细胞是专职吞噬细胞，具备多种抗菌机制以杀灭微生物；然而，N. gonorrhoeae 能够在中性粒细胞存在的情况下存活^2-5。深入了解N. gonorrhoeae等细菌病原体如何逃避、抑制并劫持免疫反应，从而最终在通常具有杀伤性的宿主环境中存活，对于开发防治感染性疾病的新疗法至关重要。

常用于研究细菌在宿主细胞内存活的实验方案包括菌落计数法、庆大霉素保护法以及电子显微镜技术。在菌落计数法中，通过裂解被感染的细胞群体（例如使用细菌具有抗性的去污剂）释放出细菌。将裂解液进行稀释后接种于琼脂培养基上，对各时间点和/或实验条件下裂解液中的菌落形成单位进行计数。该方法可反映整个细菌群体的存活能力，但无法区分细胞内与细胞外的存活情况。作为菌落计数法的一种变体，庆大霉素保护法专门用于检测细胞内细菌的存活，其原理基于庆大霉素无法穿透真核细胞质膜⁶。然而，该方法依赖于细菌对庆大霉素（或具有类似真核膜不通透性的其他抗生素）敏感，且抗生素无法接触到细胞内部的细菌。因此，在研究某些细菌种类或在高度吞噬活性的细胞（如中性粒细胞）中评估细菌存活时，庆大霉素保护法可能不适用。上述两种方法均不能揭示单个细菌的亚细胞定位或其他行为（e.g. 细菌是否形成聚集体或微菌落，其行为是否与单个细菌细胞不同）。另一种常用于检测单个胞外和胞内细菌存活状态的方法是超薄切片透射电子显微镜（TEM）。该方法的优势在于可提供细菌在宿主细胞内位置的信息（e.g. 吞噬体、细胞质、自噬体），并通过针对亚细胞标志物的胶体金标记抗体进行免疫电镜进一步验证。然而，电子显微镜在评估细菌存活能力方面并不特别敏感。当包埋切片经醋酸铀、柠檬酸铅或其他电子致密试剂染色并进行电镜成像时，电子致密的细菌被视为存活，而电子透明的细菌则被视为非存活^7,8。但这一判断标准会高估细菌的存活率，因为只有那些细胞膜严重破裂且胞质缺失的死亡细菌才会呈现电子透明。此外，某些细菌种类在其不同生长阶段可能表现出不同的电子密度，从而难以准确判断其存活状态。

作为这些广泛应用方法的替代或补充，本文提供了利用可指示细菌活性的荧光染料来评估附着于宿主细胞及被宿主细胞内吞的细菌存活情况的实验方案及其理论依据。为识别胞外细菌，首先将感染的细胞暴露于一种荧光试剂，例如凝集素或细菌特异性抗体。随后对感染细胞进行透化处理，并加入特异性结合DNA的染料，这些染料对细胞膜完整与膜已受损的细菌具有不同的通透性，从而作为细菌活性的替代指标。在第一种方案中，膜通透性染料SYTO9用于标记全部细菌群体，而碘化丙啶仅能进入细胞膜受损、因而被视为无活性的细菌。碘化丙啶与SYTO9已被用于评估生物膜中细菌的活性，区分致病性与非致病性细菌，并计数水传播的活菌^9-12。在第二种方案中，4',6'-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）标记全部细菌，而SYTOX Green仅能进入无活性的细菌群体。这些活性染料组合可与免疫荧光技术联用，以确定每个细菌相对于特定目标蛋白的位置，例如用于界定细菌的亚细胞定位。采用这些检测方法可深入揭示感染过程中导致细菌被杀灭或存活的相互作用机制。本文所述方案曾用于评估附着于及存在于原代人中性粒细胞内部的N. gonorrhoeae的活性，包括存在于中性粒细胞不同群体吞噬体中的细菌^5,13,14。然而，这些方案亦可广泛应用于评估革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌在专职吞噬细胞、非专职吞噬细胞以及原生动物中的活性^15-24。

方案

1. 使用碘化丙啶和SYTO9评估细菌活力

1. 在24孔板中，将目标细菌感染接种于直径为12 mm的圆形玻璃盖玻片上的贴壁细胞。 非 用醛类或有机溶剂固定细胞。
2. 用含 1 mM MgCl₂ 的 0.1 M 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS) 缓冲液（pH 7.2）轻轻冲洗细胞一次₂ (MOPS/MgCl₂)₂).
3. 在黑暗条件下，室温孵育细胞10分钟，加入与目标细菌种类结合的Alexa Fluor 647标记抗体或凝集素，溶于MOPS/MgCl中₂，用于检测外部细菌。

注意：在无宿主细胞的条件下，使用活菌和死菌进行对照实验，以证明目标凝集素或抗体可结合所有细菌，而不论其活性状态如何（图1）。

4. 用 MOPS/MgCl₂ 溶液清洗细胞两次。
5. 吸除细胞培养基，加入 0.5 ml 活/死细胞染色液。活/死细胞染色液的终浓度为 5 μM SYTO9、30 μM 碘化丙啶（propidium iodide）和 0.1% 皂苷（saponin），溶于 MOPS/MgCl₂ 中。
6. 将细胞在室温避光条件下孵育 15 分钟。
7. 用 MOPS/MgCl₂ 溶液再次清洗细胞两次。
8. 将盖玻片倒置在载玻片上，并用透明指甲油封片。请勿使用封片剂。
9. 在 30 分钟内使用配备适用于绿色、红色和远红荧光成像滤光片组的荧光显微镜采集图像。

注意：可使用常规荧光显微镜或共聚焦激光扫描显微镜。30 分钟后，荧光染料开始从细菌中泄漏，所获取的数据将不再准确。本文所示图像采用 Nikon Eclipse E800 正置荧光显微镜，配备 Hamamatsu Orca-ER 数字相机及 Openlab 软件采集。Alexa Fluor 647 的荧光使用激发波长 590 - 650 nm、发射波长 663 - 735 nm 的滤光片检测，并伪染为蓝色。碘化丙啶的荧光使用激发波长 540 - 580 nm、发射波长 600 - 660 nm 的滤光片检测。SYTO9 的荧光使用激发波长 465 - 495 nm、发射波长 515 - 555 nm 的滤光片检测。

10. 本方案将获得如下图像：外部无活力细菌呈蓝色+红色，内部无活力细菌仅呈红色，外部有活力细菌呈蓝色+绿色，内部有活力细菌仅呈绿色。通过肉眼计数分别统计外部无活力、内部无活力、外部有活力及内部有活力的细菌数量。
11. 通过将外部有活力细菌数量除以总外部细菌数量（有活力与无活力之和），计算外部有活力细菌的百分比。通过将内部有活力细菌数量除以总内部细菌数量（有活力与无活力之和），计算内部有活力细菌的百分比（图4）。
12. 本方案需进行两个关键对照实验。首先，需验证所有无活力细菌均为碘化丙啶阳性，所有活细菌均为SYTO9阳性。在无任何宿主细胞存在的情况下，处于对数中期的细菌培养物（mid-logarithmic culture）中，SYTO9阳性比例应 >95%。图 2 显示的是淋病奈瑟菌（N. gonorrhoeae）对数中期培养物（浓度为每毫升10⁸ 个菌落形成单位）与活/死染色液孵育后的结果。其次，需验证碘化丙啶和SYTO9均可进入经透化处理的感染宿主细胞。
    1. 为制备死细菌群体，取2 × 10⁸ 个细菌菌落形成单位，置于1.5 ml 微离心管中，加入70%异丙醇，静置10分钟。在微量离心机中离心收集细菌沉淀，并用PBS洗涤两次以去除残留异丙醇。随后按本方案步骤1.5–1.7操作。取5 μl细菌悬液滴加于载玻片上，加盖盖玻片。按本方案步骤1.9的方法对样本进行成像。在此条件下，群体中100%细菌应为碘化丙啶阳性（图2）。在某些细菌种类中，碘化丙啶的荧光可能未能完全掩盖SYTO9染色，导致无活力细菌呈现黄色或橙色。
    2. 对于中性粒细胞等吞噬性细胞，将其暴露于经异丙醇灭活的细菌中，并确保所有胞内细菌均为碘化丙啶阳性（图3）。对于可能无法内化死细菌的非吞噬性细胞，可在加入活/死染色液前，用叠氮化钠或其他细胞通透性抗菌剂处理感染细胞，以达到验证目的。

2. 使用SYTOX Green和DAPI评估细菌活力

1. 在 Morse's Defined 培养基中，用 10 μg/ml DAPI 标记目标细菌 ²⁵ 在室温避光条件下孵育20分钟。
2. 在24孔板中，用DAPI标记的细菌感染贴壁于直径12 mm圆形玻璃盖玻片上的细胞。 NOT 使用醛类或有机溶剂固定细胞。
3. 用 MOPS/MgCl₂ 溶液洗涤细胞一次_2.
4. 在黑暗条件下，于室温将细胞与偶联 Alexa Fluor 647 的抗体或凝集素（可结合目标细菌种类）在 MOPS/MgCl 溶液中孵育 10 分钟₂，用于检测外部细菌。有关建议的对照，请参见方案步骤1.3中的注释。
5. 吸弃细胞培养液，加入 0.5 ml 含 0.4 μM SYTOX Green 的 MOPS/MgCl 溶液₂.
6. 在室温避光条件下孵育细胞5分钟。
7. 用 MOPS/MgCl 溶液洗涤细胞两次₂.
8. 用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次₂ 5 分钟。
9. 在30分钟内使用荧光显微镜采集图像。显微镜、数字相机及图像采集软件的详细说明见实验方案步骤1.9。

注意：使用激发波长为 590 - 650 nm、发射滤光片为 663 - 735 nm 的滤光系统检测 Alexa Fluor 647 的荧光信号，并以伪红色显示。使用激发波长为 465 - 495 nm、发射滤光片为 515 - 555 nm 的滤光系统检测 SYTOX Green 的荧光信号。使用激发波长为 355 - 375 nm、截止滤光片为 400 nm 的滤光系统检测 DAPI 的荧光信号。

10. 本实验方案将获得如下图像：外部无活力细菌呈红色+绿色，内部无活力细菌呈绿色+蓝色，外部有活力细菌呈红色+蓝色，仅内部有活力细菌呈蓝色（图4）。按照方案步骤1.11所述方法，定量分析外部和内部细菌的百分比。
11. 应使用DAPI/SYTOX Green染料组合进行方案步骤1.12中所述的对照实验（图2和图3）。

3. 在亚细胞定位的同时评估细菌活力

1. 在避光条件下，于室温下用含10 μg/ml DAPI的Morse's Defined培养基标记目标细菌20分钟。
2. 在24孔板中，用DAPI标记的细菌感染贴壁于直径12 mm圆形玻璃盖玻片上的细胞。 NOT 使用醛类或有机溶剂固定细胞。
3. 用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次_2.
4. 在 MOPS/MgCl 溶液中，避光、室温孵育 10 分钟，加入与目标细菌物种结合的 Alexa Fluor 647 偶联抗体或凝集素₂，以检测外源细菌。有关建议的对照，请参见实验方案步骤1.3中的注释。
5. 吸弃细胞培养基，用 MOPS/MgCl 溶液冲洗细胞两次_2.
6. 将细胞与Alexa Fluor 555标记的针对目标亚细胞标志物的抗体在MOPS/MgCl中于室温孵育20分钟₂ 含 0.2% 皂苷
7. 用 MOPS/MgCl 溶液洗涤细胞两次₂.
8. 用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次₂ 5分钟。
9. 吸去细胞培养液，加入含 0.4 μM SYTOX Green 的 MOPS/MgCl₂ 溶液₂.
10. 在室温避光条件下孵育细胞5分钟。
11. 用 MOPS/MgCl 溶液洗涤细胞两次₂.
12. 用 MOPS/MgCl 洗涤细胞一次₂ 5 分钟。
13. 在荧光显微镜下于30分钟内获取载玻片的图像。显微镜、数字相机及图像采集软件的说明详见方案步骤1.9。

注意：使用激发波长为 590 - 650 nm、发射滤光片为 663 - 735 nm 的滤光系统检测 Alexa Fluor 647 的荧光信号，并以伪色紫色显示。使用激发波长为 540 - 580 nm、发射滤光片为 600 - 660 nm 的滤光系统检测 Alexa Fluor 555 的荧光信号。使用激发波长为 465 - 495 nm、发射滤光片为 515 - 555 nm 的滤光系统检测 SYTOX Green 的荧光信号。使用激发波长为 355 - 375 nm、截止滤光片为 400 nm 的滤光系统检测 DAPI 的荧光信号。

14. 本方案将获得如下图像：外部非活菌呈紫色+绿色，内部非活菌呈绿色+蓝色，外部活菌呈紫色+蓝色，内部活菌仅呈蓝色，亚细胞蛋白呈红色（图4）。按照方案步骤1.11所述，定量分析外部和内部活菌的百分比。
15. 应使用DAPI/SYTOX Green染料组合进行方案步骤1.12中所述的对照实验（图2和图3）。
16. 除计数活菌和非活菌外，还需将每个细菌分类为与目标亚细胞标记物共定位阳性或阴性。
17. 通过将共定位的活菌数量除以活菌总数，计算与亚细胞标记物共定位的活菌百分比；通过将共定位的非活菌数量除以非活菌总数，计算与亚细胞标记物共定位的非活菌百分比。

结果

所概述的方案用于检测存活率 N. gonorrhoeae 暴露于人原代中性粒细胞后 ^5,26中性粒细胞被感染了 N. gonorrhoeae 并使用方案1进行处理，采用绿色荧光活细胞染料SYTO9和红色荧光碘化丙啶（图 4A）。染料在皂苷存在下加入，皂苷可螯合胆固醇，从而优先通透宿主细胞的质膜，而非 N. gonorrhoeae 膜。如果目标细菌的膜含有大量胆固醇，则可能需要测试其他去垢剂。所有 N. gonorrhoeae 用SYTO9染色，但只有膜受损的细菌才会被碘化丙啶染色。碘化丙啶的荧光会覆盖SYTO9的荧光，因此活细菌呈绿色，死细菌呈红色 ²⁷在某些细菌种类中，碘化丙啶可能无法完全抑制SYTO9的染色，导致死菌呈现黄色或橙色。碘化丙啶与SYTO9的比例可能需要根据不同细菌种类进行优化。在对细胞进行透化处理并加入SYTO9和碘化丙啶之前，向感染的细胞中添加了偶联Alexa Fluor 647的豆粕凝集素，以标记胞外菌 N. gonorrhoeae 远红荧光信号被伪...

讨论

本文介绍了两种利用DNA结合染料和活力染料，并结合荧光凝集素来鉴定附着于和位于人类细胞内活菌与死菌的实验方案。由于这两种方案均能有效区分活菌与死菌，因此选择哪种方案取决于实验目的。第一种方案使用碘化丙啶（propidium iodide）检测无活力细菌，使用SYTO9染料检测完整细菌。图4A展示了将方案1应用于感染了N. gonorrhoeae的人类中性粒细胞的代表性图像。这些染料与一种凝集素——大豆凝集素（soybean agglutinin）联合使用，以识别细胞外的N. gonorrhoeae，但也可用荧光标记的细菌特异性抗体作为替代。方案1能够清晰显示单个细菌的活力状态，因为碘化丙啶会排斥SYTO9，从而使无活力细菌呈现红色荧光，而有活力细菌呈现绿色荧光。然而，由于碘化丙啶在常规荧光显微镜可用的四个通道中的两个通道内具有荧光信号，该方案无法与宿主蛋白的免疫荧光染色联用。因此开发了方案2，该方案使用SYTOX Green识别无活力细菌，DAPI检测总细菌群体。在图4B中展示了利用SYTOX Green和DAPI处理与人类中性粒细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于采血的21 G 3/4蝶形针	Becton Dickinson	367251
含10 ml肝素钠的采血管	Becton Dickinson	366480
无菌冲洗用水	Baxter	07-09-64-070
右旋糖酐500	Sigma	31392
氯化钠	Fisher Scientific	S641
葡萄糖	Ricca Chemical Company	RDCD0200
不含Ca2+或Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll溶液	GE Healthcare	17-1440-03
乙酸	Fisher Scientific	BP2401
12 mm圆形玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24孔板	Corning Incorporated	3524
人混合血清	Sigma	S7023
RPMI培养基	Mediatech	15-040-CV
胎牛血清	Thermo Scientific	SH3007103
人白细胞介素-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
碘化丙啶	Life Technologies	L7007 或 L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 或 L7012
皂苷	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647标记的大豆凝集素	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
小鼠抗CD63单克隆抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555抗体标记试剂盒	Life Technologies	A20187
亮线血细胞计数板	Hausser Scientific	1492
镊子	EMS	78320
Sorvall Legend RT + 离心机	Thermo Scientific	75004377