用于测定与哺乳动物细胞相关的细菌活力的荧光显微镜方法

摘要

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在接触真核细胞后是否能够存活以及其存活机制。本文概述了使用荧光染料检测单个细菌在宿主细胞内及与宿主细胞相关时活力状态的实验方案。

摘要

细菌致病性研究的核心在于确定微生物在暴露于真核细胞后是否以及如何存活。目前用于回答这些问题的实验方法包括菌落计数法、庆大霉素保护法和电子显微镜法。菌落计数法和庆大霉素保护法仅能评估整个细菌群体的存活能力，无法判断单个细菌的活力状态。电子显微镜可用于评估单个细菌的存活情况，并提供其在宿主细胞内定位的信息。然而，细菌通常表现出不同的电子密度，使得活力判断较为困难。本文介绍了一系列使用荧光染料的实验方案，可揭示宿主细胞内及与宿主细胞相关的单个细菌的活力状态。这些方法最初用于评估淋病奈瑟菌（Neisseria gonorrhoeae）在原代人中性粒细胞中的存活情况，但应适用于任何细菌与宿主细胞相互作用的研究。这些实验方案结合使用膜通透性荧光染料（SYTO9 和 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 [DAPI]），可对所有细菌进行染色，以及膜不通透性荧光染料（碘化丙啶和 SYTOX Green），后者仅能进入无活力的细菌。在对真核细胞进行膜通透化处理之前，加入抗体或荧光试剂以识别细胞外细菌。因此，这些方法能够区分黏附于真核细胞表面以及位于其内部的细菌的活力状态。本文还提供了一种将活力染料与针对真核细胞标记物的荧光抗体联合使用的方案，以确定单个细菌在细胞内的亚细胞定位。本文所讨论的细菌活力染料是对传统微生物学技术的灵敏补充或替代方法，可用于评估单个细菌的活力，并提供细菌在宿主细胞内存活位置的相关信息。

引言

细菌与其宿主之间存在着动态的相互作用和共同进化关系。细菌已进化出黏附器官、分泌系统和/或产生毒素的能力，使其能够有效感染宿主的吞噬细胞和非吞噬细胞。同时，细菌还必须应对宿主免疫系统的识别以及其抗菌活性。宿主免疫系统由先天性和适应性免疫组分构成，包括物理和化学屏障、免疫细胞、补体系统以及其他体液免疫成分。尽管许多细菌易被宿主多层次的免疫反应杀灭并清除，但一些致病性和机会性细菌已进化出感染多种宿主细胞并逃避宿主免疫清除的机制¹。Neisseria gonorrhoeae（淋病奈瑟菌）便是一种高度适应在人类宿主体内持续存在的细菌病原体。N. gonorrhoeae 易于定植于泌尿生殖道、咽部、结膜和直肠黏膜上皮细胞的管腔表面。定植过程会引发黏膜部位大量中性粒细胞的募集。中性粒细胞是专职吞噬细胞，具备多种抗菌机制以杀灭微生物；然而，N. gonorrhoeae 能够在中性粒细胞存在的情况下存活^2-5。深入了解N. gonorrhoeae等细菌病原体如何逃避、抑制并劫持免疫反应，从而最终在通常具有杀伤性的宿主环境中存活，对于开发防治感染性疾病的新疗法至关重要。

常用于研究细菌在宿主细胞内存活的实验方案包括菌落计数法、庆大霉素保护法以及电子显微镜技术。在菌落计数法中，通过裂解被感染的细胞群体（例如使用细菌具有抗性的去污剂）释放出细菌。将裂解液进行稀释后接种于琼脂培养基上，对....

方案

1. 使用碘化丙啶和SYTO9评估细菌活力

1. 在24孔板中，将目标细菌感染接种于直径为12 mm的圆形玻璃盖玻片上的贴壁细胞。 非 用醛类或有机溶剂固定细胞。
2. 用含 1 mM MgCl₂ 的 0.1 M 3-(N-吗啉代)丙磺酸 (MOPS) 缓冲液（pH 7.2）轻轻冲洗细胞一次₂ (MOPS/MgCl₂)₂).
3. 在黑暗条件下，室温孵育细胞10分钟，加入与目标细菌种类结合的Alexa Fluor 647标记抗体或凝集素，溶于MOPS/MgCl中₂，用于检测外部细菌。

注意：在无宿主细胞的条件下，使用活菌和死菌进行对照实验，以证明目标凝集素或抗体可结合所有细菌，而不论其活性状态如何（图1）。

4. 用 MOPS/MgCl₂ 溶液清洗细胞两次。
5. 吸除细胞培养基，加入 0.5 ml 活/死细胞染色液。活/死细胞染色液的终浓度为 5 μM SYTO9、30 μM 碘化丙啶（propidium iodide）和 0.1% 皂苷（saponin），溶于 MOPS/MgCl₂ 中。
6. 将细胞在室温避光条件下孵育 15 分钟。
7. 用 MOPS/....

结果

所概述的方案用于检测存活率 N. gonorrhoeae 暴露于原代人中性粒细胞后 ^5,26中性粒细胞被感染 N. gonorrhoeae 并采用方案1进行处理，使用绿色荧光活力染料SYTO9和红色荧光碘化丙啶（图 4A）。染料在皂苷存在下加入，皂苷可螯合胆固醇，从而优先通透宿主细胞质膜，而非 N. gonorrhoeae 膜。如果目标细菌的膜含有大量胆固醇，则可能需要测试其他去垢剂。所有 N. gonorrhoeae 用SYTO9染色，但只有膜受损的细菌才会被碘化丙啶染色。碘化丙啶的荧光会掩盖SYTO9的荧光，因此活细菌呈绿色，死细菌呈红色 ²⁷在某些细菌种类中，碘化丙啶可能无法完全抑制SYTO9的染色，导致死亡细菌呈现黄色或橙色。碘化丙啶与SYTO9的比例可能需要根据不同细菌种类进行优化。在对细胞进行透化处理并加入SYTO9和碘化丙啶之前，向感染的细胞中添加了偶联Alexa Fluor 647的豆粕凝集素，以检测细胞外的结构 N. gonorrhoeae 远红荧光信号.......

讨论

本文介绍了两种利用DNA结合染料和活力染料，并结合荧光凝集素来鉴定附着于和位于人类细胞内活菌与死菌的实验方案。由于这两种方案均能有效区分活菌与死菌，因此选择哪种方案取决于实验目的。第一种方案使用碘化丙啶（propidium iodide）检测无活力细菌，使用SYTO9染料检测完整细菌。图4A展示了将方案1应用于感染了N. gonorrhoeae的人类中性粒细胞的代表性图像。这些染料与一种凝集素——大豆凝集素（soybean agglutinin）联合使用，以识别细胞外的N. gonorrhoeae，但也可用荧光标记的细菌特异性抗体作为替代。方案1能够清晰显示单个细菌的活力状态，因为碘化丙啶会排斥SYTO9，从而使无活力细菌呈现红色荧光，而有活力细菌呈现绿色荧光。然而，由于碘化丙啶在常规荧光显微镜可用的四个通道中的两个通道内具有荧光信号，该方案无法与宿主蛋白的免疫荧光染色联用。因此开发了方案2，该方案使用SYTOX Green识别无活力细菌，DAPI检测总细菌群体。在图4B中展示了利用SYTOX Green和DAPI处理与人类中性粒细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
用于采血的21 G 3/4蝶形针	Becton Dickinson	367251
含10 ml肝素钠的采血管	Becton Dickinson	366480
无菌冲洗用水	Baxter	07-09-64-070
右旋糖酐500	Sigma	31392
氯化钠	Fisher Scientific	S641
葡萄糖	Ricca Chemical Company	RDCD0200
不含Ca2+或Mg2+的Dulbecco磷酸盐缓冲液	Thermo Scientific	SH3002802
Ficoll溶液	GE Healthcare	17-1440-03
乙酸	Fisher Scientific	BP2401
12 mm圆形玻璃盖玻片	Fisher Scientific	12-545-80 12CIR-1
24孔板	Corning Incorporated	3524
人混合血清	Sigma	S7023
RPMI培养基	Mediatech	15-040-CV
胎牛血清	Thermo Scientific	SH3007103
人白细胞介素-8	R&D Systems	208-IL/CF
MOPS	Sigma	M3183
MgCl2	Fisher Scientific	BP214
碘化丙啶	Life Technologies	L7007 或 L7012
SYTO9	Life Technologies	L7007 或 L7012
皂苷	Fluka Analytical	47036
Alexa Fluor 647标记的大豆凝集素	Life Technologies	L-32463
DAPI	Sigma	D8417
SYTOX Green	Life Technologies	S7020
小鼠抗CD63单克隆抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank	H5C6
Alexa Fluor 555抗体标记试剂盒	Life Technologies	A20187
亮线血细胞计数板	Hausser Scientific	1492
镊子	EMS	78320
Sorvall Legend RT + 离心机	Thermo Scientific	75004377