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方法文章

总蛋白提取与二维凝胶电泳方法 伯克霍尔德菌属 物种

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DOI：

10.3791/50730

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2013年10月15日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Centre for Understanding and Preventing Infection in Children, University of British Columbia

本文内容

摘要

伯克霍尔德菌属（Burkholderia）成员是具有重要临床意义的病原体。本文介绍一种利用机械破碎法进行细菌总蛋白提取，并结合二维凝胶电泳进行后续蛋白质组学分析的方法。

摘要

研究细菌物种的细胞内蛋白质水平对于理解这些微生物所致疾病的致病机制具有重要意义。本文描述了一种从 伯克霍尔德菌属 基于在磷酸盐缓冲液中使用玻璃珠进行机械裂解，并在乙二胺四乙酸和苯甲基磺酰氟存在下提取物种。该方法可用于不同 伯克霍尔德菌属 物种、不同生长条件，且可能适用于其他细菌的蛋白质组学研究。在蛋白质提取后，采用二维（2-D）凝胶电泳蛋白质组技术，以研究这些生物体蛋白质组的全局变化。该方法首先在第一维中通过等电聚焦根据蛋白质的等电点进行分离，然后在第二维中通过丙烯酰胺凝胶电泳根据分子量进行分离。分离后的蛋白质通过银染法进行显色观察。

引言

属 伯克霍尔德菌属 包含60多种物种，为革兰阴性菌，分离自多种不同生境，可分为两个主要类群1,2第一个类群包括人类、动物和植物营养型生物，大多数研究集中于该类群中的致病物种，因其具有重要的临床意义。致病性最强的成员是 B. pseudomallei 和 B. mallei （分别引起类鼻疽和鼻疽）3,4 和机会性病原体（定义的17个物种的 洋葱伯克霍尔德菌 复合物，基底细胞癌)5，这些疾病会导致囊性纤维化（CF）和慢性肉芽肿病（CGD）1第二个类群包含30多种非致病性物种，包括与植物或环境相关的细菌，被认为对宿主具有潜在益处2.

由致病性细菌感染引发的多种并发症 伯克霍尔德菌属 属，例如病原体在患者之间的传播、疾病扩散以及由于对抗生素的固有或获得性耐药导致治疗失败，使得在大多数情况下难以根除6-9因此，深入了解细菌感染建立的基础，对于治疗这些病原体引起的疾病至关重要。为了揭示感染建立的机制，需要对与致病过程相关的细菌组分进行广泛研究。聚焦于蛋白质组学分析的研究 伯克霍尔德菌属 利用蛋白质组学方法研究生物体，已鉴定出与细菌致病性相关的蛋白质以及其蛋白质组谱的变化10-16.

在含有高浓度尿素、硫脲并联合去垢剂和两性电解质的裂解缓冲液中，采用超声处理和反复冻融循环的方法已应用于伯克霍尔德菌（Burkholderia）的蛋白质组学研究10-13。尽管尿素在蛋白质变性方面效率较高，但在水溶液中可与异氰酸铵建立平衡，后者可与氨基酸基团发生反应，从而产生人工产物（氨基甲酰化反应）17。因此，建议添加载体两性电解质以充当异氰酸根清除剂，并避免温度超过37 °C17。此外，为防止裂解缓冲液对蛋白质定量产生化学干扰，可使用相同的裂解缓冲液制作标准曲线，使样品与标准品具有相同的背景10。其他方法包括使用碱性缓冲液和去垢剂并结合加热孵育步骤17,18；然而这些条件可能引起蛋白质组的改变，且某些去垢剂若不进行后续去除步骤，则不适用于蛋白质组学分析17,18。

在充分提取和定量之后，可采用蛋白质组学方法（如二维（2-D）凝胶电泳）研究每种蛋白质的全局表达水平。该技术最初由 O'Farell19 描述，其原理是在第一维中通过等电聚焦根据蛋白质的等电点进行分离，然后在第二维中通过丙烯酰胺凝胶电泳根据其分子量进行分离。由于其高分辨率和高灵敏度，该技术成为分析和检测复杂生物来源蛋白质的有力工具19,20。目前，该分离技术已应用于以蛋白质为中心的研究策略中，其显著优势在于能够分辨由转录后修饰或蛋白水解加工引起的蛋白质亚型。通过比较染色后凝胶上相应蛋白点的强度，可检测到定量变化20。然而，该技术不适用于分子量极大、膜结合、极性强酸或强碱性以及疏水性蛋白质的鉴定，且操作较为繁琐、耗时较长20。近年来，出现了更为稳健和客观的以肽段为中心的新方法（非凝胶技术），可通过稳定的同位素标记进行定量比较，例如采用同位素编码亲和标签（ICAT）对半胱氨酸进行标记21，以及采用相对和绝对定量同位素标签（iTRAQ）对氨基进行标记22。单一蛋白质组学技术可能提供的信息有限，因此通常需要结合两种互补的蛋白质组学方法，才能全面评估蛋白质组的变化。尽管如此，二维凝胶电泳仍被广泛使用，并可常规应用于不同生物体中多种蛋白质的定量表达分析。

本文介绍了一种全细胞蛋白提取及二维凝胶电泳实验方法 伯克霍尔德菌属 根据通用电气医疗集团《二维电泳原理与方法手册》80-6429-60AC 2004 版中优化和调整的物种www.amershambiosciences.com）。蛋白质提取采用珠磨机，在含有5 mM EDTA（乙二胺四乙酸）和1 mM PMSF（苯甲基磺酰氟）的PBS中，加入玻璃珠进行。该方法可实现蛋白质的定量提取并最大限度减少降解，且适用于此前报道过的蛋白质组学研究。15,23,24采用24 cm长的固定pH 4-7梯度胶片进行二维凝胶电泳，蛋白质首先根据其等电点进行分离；随后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，依据分子量大小进一步分离蛋白质。此外，我们描述了一种用于检测蛋白质点的银染方法，以及一种适用于质谱分析的银染技术。这些方法结合使用，可实现对重要蛋白质的有效鉴定 伯克霍尔德菌属 可能参与致病过程的物种

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方案

1. 培养物生长（第1+2天）

  1. 培养起始菌液：在15 ml带螺旋盖的试管中加入3 ml LB（Luria Bertani）液体培养基，于37 °C旋转摇床过夜培养。将过夜培养物稀释至OD600为0.6。取1 ml该稀释液加入装有100 ml LB液体培养基的250 ml锥形瓶中。于37 °C、250 rpm振荡培养16小时，使其进入稳定期（SP），以在批量培养条件下更接近感染状态，并确保受稳定期信号因子（如rpoS）和群体感应调控的细菌毒力因子得以表达。 alternatively，也可使用处于早期稳定期或对数生长中期至后期的细菌，以研究细菌的适应阶段。
  2. 培养16小时后，测定OD600，并通过与相同条件下预先构建的生长曲线进行比较，确认菌液已达到稳定期。

2. 蛋白质提取（第3天）

  1. 提前将所有培养基和溶液在冰箱中预冷过夜。所有操作步骤均需在冰桶中进行。预先将微量离心机和贝克曼库尔特高性能离心机（或同等设备）及其转子（转子型号=JA-20，离心机型号=J2-HS）冷却至 4 °C。
  2. 用丙酮新鲜配制 0.1 M 苯甲基磺酰氟（PMSF，174.19 g/mol）溶液：将 0.0174 g PMSF 溶于 1 ml 丙酮中（“警告”：PMSF 有毒且具腐蚀性，需佩戴面罩和手套；“警告”：丙酮有毒且易燃，需佩戴面罩和手套）。
  3. 配制 PBS/EDTA/PMSF 溶液：取 0.1 ml 0.1 M PMSF、0.1 ml 0.5 M EDTA 和 9.8 ml PBS 混合。检测 16 小时培养物在 SP 中的光密度（OD）是否达到预期值。
  4. 取 35 ml 细菌培养物转移至 Oakridge 离心管中，在 4 °C 条件下以 4,500 × g 离心 20 分钟。
  5. 弃去上清液至废液容器中，加入 35 ml 预冷的 PBS 重悬沉淀，再次在 4 °C 条件下以 4,500 × g 离心 20 分钟。
  6. 弃去上清液，用 1 ml 冷 PBS 重悬沉淀，转移至无菌 2 ml 离心管中，在微量离心机中于 4 °C 以 14,000 × g 高速离心 1 分钟，弃去上清液。
  7. 加入 1 ml PBS/EDTA/PMSF 溶液重悬沉淀，并转移至含有约 0.5 ml 玻璃珠（预先灭菌）的 2 ml 螺口管（带密封圈）中。将重悬的沉淀加入含玻璃珠的管中，在 4 °C 冷室中震荡破碎 1 分钟，重复 3 次，每次破碎后将样品置于冰上冷却。
  8. 在微量离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟，收集上清液并转移至无菌 5 ml 聚苯乙烯管中。
  9. 为提高得率，向同一含玻璃珠的管中再次加入 1 ml PBS/EDTA/PMSF 溶液，在 4 °C 震荡破碎 1 分钟，重复 2 次，每次破碎后将样品置于冰上冷却。在离心机中以 14,000 × g 离心 1 分钟，收集上清液并与步骤 8 所得上清液合并。使用 1 ml 注射器和 0.20 μm 滤器将聚苯乙烯管中的上清液过滤至新的无菌 2 ml Eppendorf 管中。
  10. 此时应对样品进行蛋白定量检测（使用 Pierce MicroBCA 蛋白检测试剂盒），并将含 200 μg 蛋白的分装样品于 -80 °C 冻存，待后续使用。

3. 样品制备（第4天）

  1. 配制25 ml复溶贮存液（8 M尿素，2% CHAPS，2% IPG缓冲液，0.002%溴酚蓝），分装为2.5 ml等份，于-20 °C保存。使用前向2.5 ml复溶贮存液中加入7 mg二硫苏糖醇（DTT，154.2 g/mol）。
  2. 使用2-D清洁试剂盒处理步骤2.10中解冻的样品，最终用步骤3.1制备的450 μl复溶贮存液重悬。

4. 第一向等电聚焦（IEF）（第4天）

本节所有步骤均使用 Ettan IGPhor IEF 系统。

  1. 设置IPG第一向电泳胶条：用胶条清洗液清洗胶条槽，然后用Milli-Q水冲洗，倒置晾干。为每个样品分配对应的胶条槽编号。
  2. 在胶条负极（-）端起第二个较宽区域加入再水化步骤中的样品。使用洁净镊子从包装中取出胶条，撕去保护层。将胶条粗糙面向下，以缓慢滑动的方式依次从负极（-）向正极（+）方向贴放，使胶条逐步润湿。
  3. 在电极上方及胶条下方放置经无菌水润湿的滤纸，防止电极烧毁。每次操作后用纯水和乙醇冲洗镊子。彻底排除气泡，表面薄薄覆盖一层矿物油以防止干燥。将胶条槽整齐放入仪器中。
  4. 程序设置：20 °C下再水化12小时，200 V运行1小时，500 V运行1小时，1,000 V运行1小时，4,000 V运行0.5小时，8,000 V运行12小时，最后在300 V保持24小时，此时可取出胶条。
  5. 等电聚焦（IEF）完成后，建议立即进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳；除非需将IPG胶条用矿物油包裹后置于Saran Wrap中，在-80 °C冷冻保存以备后续分析。另外，为避免因DTT残留导致蛋白点拖尾，可在进行第二向电泳前增加一个平衡步骤，使用含碘乙酰胺的缓冲液对IPG胶条进行第二次平衡处理。

5. 第二维SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（第5天）

本节所有步骤均使用 Ettan DALTsix 电泳仪进行。

  1. 组装凝胶灌注装置时，需彻底清洁所有组件，确保凝胶灌注仪水平放置，并且灰色橡胶密封条已用硅胶润滑。将黑色橡胶三角塞安装在底部，然后交替放置分隔板和玻璃板，短玻璃板朝前。确保分隔板位于前后两侧，剩余空间用填充片（约5片）填满，使顶部平整。将前面板装上，红色端朝外。用夹子夹紧两侧，并拧紧底部螺丝。
  2. 制备凝胶：在带有真空接口并内置搅拌子的烧瓶中加入297.3 ml Duracryl（“警告”：Duracryl有毒，使用时需佩戴面罩和手套）、147 ml Tris缓冲液（1.5 M，pH 8.8）和143.3 ml Milli-Q水。盖上瓶盖，在中等转速下开启真空搅拌20分钟，以去除溶液中的气泡。现配10%过硫酸铵溶液（APS，218.8 g/mol）：将0.2 g APS溶于2 ml Milli-Q水中。
  3. 将凝胶混合液加入凝胶灌注装置：真空处理完成后，沿烧瓶壁加入6 ml 10%十二烷基硫酸钠（SDS，228.38 g/mol），避免引入过多气泡。加入APS，搅拌，再加入0.25 ml N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED，116.20 g/mol）（“警告”：TEMED易燃，使用时需佩戴面罩和手套），再次搅拌。
  4. 通过装置后部插入的漏斗将凝胶混合液倒入凝胶灌注装置，液面升至短玻璃板下方约2.5 cm处。在凝胶顶部加入1.5 ml水饱和正丁醇，并用保鲜膜封口以防止脱水。静置1小时，确保凝胶完全聚合。
  5. 检查凝胶：凝胶聚合完成后（同时检查烧瓶内残留物），在水槽边拆卸凝胶灌注装置。用温水冲洗玻璃板时检查凝胶完整性，注意勿使水进入板间。倒出正丁醇，并用水冲洗凝胶顶部两次以去除残留正丁醇。若凝胶暂不使用，再次加水覆盖并静置。
  6. 制备胶条：从冷冻箱中取出平衡缓冲液（6 M 尿素，75 mM Tris-HCl pH 8.8，29.9% SDS，0.002% 溴酚蓝）。该溶液可预先分装为10 ml等份，储存于-20 °C。将0.1 g DTT溶于10 ml平衡缓冲液中。每管溶液可用于两条IPG胶条。将胶条胶面朝下放入缓冲液中，静置30分钟。注意标记各端方向。
  7. 准备电泳装置（二维分离装置）：向电泳槽中加入4.5 L 1x电泳缓冲液（25 mM Tris碱[121.1 g/mol]，192 mM 甘氨酸[288.38 g/mol]，0.1% w/v SDS[288.38 g/mol]）。该缓冲液最多可重复使用3次。开启电泳装置。检查水冷机水位，若偏低则加水补充。开启水冷机，按模式键确认设定温度应为10 °C。
  8. 配制1 L 2x运行缓冲液和1 L 1x运行缓冲液，储存于4 °C。配制琼脂糖封胶液：称取0.25 g琼脂糖，溶于50 ml 1x运行缓冲液中。每次脉冲加热15秒，重复操作。
  9. 设置电泳装置：用镊子取出每条胶条，用干净纸巾擦去两侧多余缓冲液。切勿用手接触胶条。倒去凝胶顶部的水，并用1x运行缓冲液润洗凝胶表面。用干净镊子将胶条放置在长玻璃板顶部，胶面朝向操作者。在胶条上加1x运行缓冲液以润滑。使用塑料条将胶条进一步推入，排除胶条与凝胶之间的所有气泡。
  10. 在胶条顶部加入琼脂糖封胶液以密封。对剩余胶条重复此操作。将装有凝胶的玻璃板放入电泳槽支架中，并缓缓下放至电泳槽内。在安装上层腔室前，确保外层腔室中的1x缓冲液液面达到指定的下标记线。
  11. 将上层缓冲液室框架置于玻璃板顶部，并通过向下按压底部确保其完全就位。使用漏斗将2x运行缓冲液加入上层腔室至中线处。使用漏斗将1x运行缓冲液加入外层腔室至顶部标记线。盖上电泳槽盖，开启电泳装置和电源。
  12. 以52 V、96 mA、5 W恒定功率过夜运行。通过观察顶部附近银丝电极上是否有气泡产生来判断电流是否正常。持续电泳直至前沿线距离底部1 cm处停止。
  13. 蛋白质也可根据制造商说明，使用其他公司（如BIORAD或Hoefer）的设备和试剂进行分析。

6. 凝胶银染以进行凝胶显影（第5-6天）

  1. 在通风橱中，将800 ml乙醇、200 ml冰醋酸和1,000 ml Milli-Q水加入塑料桶中，配制固定液1（该溶液适用于6块凝胶）。关闭所有仪器，取出电泳装置的整个中部组件并放入水槽中，同时将白色支架也放入水槽中。取出顶部盛有2×电泳缓冲液的托盘。
  2. 拆卸装置，将凝胶从玻璃板中取出并放入固定液1中。可通过在从玻璃板上取下凝胶时切去不同数量的角来区分凝胶，切角的数量对应于制胶模具中凝胶的顺序。
  3. 将盛有固定液和凝胶的容器置于摇床上，4 °C下振荡处理至少1小时至过夜。
  4. 将凝胶转移至固定液2（20 ml 50% 戊二醛、600 ml 乙醇、5 g 四硫代钼酸钾（302.46 g/mol）、136 g 乙酸钠（82.03 g/mol），加Milli-Q水至2,000 ml），在摇床上振荡处理1小时。
  5. 用Milli-Q水洗涤凝胶，每次15分钟，重复4次。
  6. 将凝胶置于硝酸银染色液（4 g 硝酸银（169.87 g/mol）、500 μl 甲醛，加Milli-Q水至2,000 ml）中染色30分钟至48小时。
  7. 用Milli-Q水洗涤凝胶1分钟。
  8. 转移至显影液（60 g 碳酸钠（105.99 g/mol）、300 μl 甲醛、15 mg 硫代硫酸钠（158.11 g/mol），加Milli-Q水至2,000 ml）中，显影5–30分钟，直至凝胶显色。
  9. 将凝胶放入终止液（100 g Tris-Base（121.14 g/mol）、40 ml 冰醋酸，加Milli-Q水至2,000 ml）中10分钟。
  10. 如需长期保存，将凝胶转移至甘油溶液（40 ml 甘油，如需长期保存则用400 ml，加1,600 ml Milli-Q水）中10分钟，然后使用凝胶干燥仪干燥。
  11. 染色后可通过成像系统（如扫描仪/密度计）、透射式光照明器或凝胶成像系统对凝胶进行观察。可使用BIORAD公司的PDQuest 2-D分析等图像分析软件，从样品中获取蛋白质的定性和定量信息。

7. 用于质谱分析的凝胶银染色

  1. 用 50% 甲醇和 5% 乙酸在室温下固定凝胶 1 小时。
  2. 用 50% 甲醇洗涤至少 10 分钟至过夜。
  3. 用蒸馏水洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  4. 用 0.02% 硫代硫酸钠（158.11 g/mol）敏化处理 2 次，每次 15 分钟。
  5. 用冰冻蒸馏水洗涤 3 次，每次 10 分钟。
  6. 将凝胶浸入冰冻的 1% 硝酸银溶液（169.87 g/mol）中，在 4 °C 下反应至少 20 分钟至 1 小时。
  7. 用蒸馏水洗涤 2 次，每次 1 分钟。更换容器。
  8. 在含有 0.04% 甲醛的 2% 无水碳酸钠（105.99 g/mol）溶液中显影，当溶液明显变黄时立即弃用；准备三批显影液，每 5 分钟更换一次。
  9. 用 5% 乙酸洗涤，然后保存在 1% 乙酸中。
  10. 使用 USP 级乙醇冲洗 1.5 ml 离心管（用于盛放切下的蛋白点），并在使用前空气干燥。
  11. 用 100% 甲醇清洁镊子、刀片和操作表面。
  12. 用乙醇喷洒手套和操作表面。
  13. 在超净工作台或洁净空气区域中切除蛋白点。也可使用自动点切割仪进行切除。
  14. 将切下的蛋白点放入离心管中，冰上运输或保存在冰箱中。

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结果

对同一细菌培养物在两个不同时间点提取的蛋白质谱进行比较分析，结果显示条带模式相似，表明蛋白质提取成功。提取的蛋白质分子量范围为10-150 kDa。图1展示了从在LB或酵母/甘露醇（YEM）肉汤中培养并处于稳定期的Burkholderia multivorans（BCC成员）临床分离株中提取的全细胞蛋白质的代表性考马斯亮蓝染色凝胶图谱。

进行二维凝胶电泳分析时，使用了200 μg的Burkholderia pseudomallei总蛋白（图2）。由于该病原体被美国疾病控制与预防中心列为B类生物战剂25，蛋白制备操作均在生物安全三级防护实验室中，依照标准操作程序进行。将蛋白重悬于再水化溶液中，并加样至24 cm长、固定pH 4-7梯度的胶条上，根据蛋白的等电点（pI）进行分离。随后将胶条置于SDS-聚丙烯酰胺凝胶上，根据蛋白的分子量（MW）进行第二维分离。之后对凝胶进行银染，以实现蛋白点的可视化。结果表明，可分辨出500多个蛋白点，每个蛋白点均可通过质谱技术单...

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讨论

已描述一种蛋白质制备方法，该方法能够以良好的重复性提取大多数 Burkholderia 蛋白质。如图1所示，使用在LB或YEM液体培养基中培养的同一批细菌，在不同日期独立进行两次制备，获得了相同的蛋白质谱，证明了该方法的可重复性。该方法对液体培养基中生长的细菌提取效率较高；但我们尚未测试该方法在平板上生长的细菌中的适用性。该方法还被用于后续的蛋白质表征分析，结合蛋白质组学工具，我们的研究团队已成功利用二维凝胶电泳及用于相对与绝对定量的同位素标签技术（iTRAQ）进行蛋白质组变化的研究15,23,24。对于iTRAQ实验，为避免PMSF对实验造成干扰，蛋白质被提取至含有0.5 M EDTA的PBS缓冲液中15。

需要强调的是，在蛋白质提取过程和二维凝胶电泳中，所有操作步骤均应在 4 °C 或使用冰桶的低温条件下进行，以最大限度减少蛋白质降解；同时应使用带滤芯的吸头，佩戴腈手套，并遮盖所有皮肤，防止角蛋白污染后续用于质谱鉴定的蛋白点。在进行蛋白质提取时，还需注意苯甲基磺酰氟（PMSF）在水溶...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作获得了不列颠哥伦比亚大学研究生奖学金（授予 B.V.）以及加拿大囊性纤维化协会和加拿大卫生研究院基金（授予 D.P.S.）的支持。我们感谢 Jacqueline Chung 对实验方案的初步准备工作。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
苯甲基磺酰氟（PMSF）SigmaP7626有毒，腐蚀性
丙酮FisherA18-1易燃
PBS缓冲液BioscienceR028
乙二胺四乙酸（EDTA）FisherBP118-500有毒
玻璃珠（0.1 mm）BioSpec Products11079101
Nalgene Oak Ridge 离心管，聚碳酸酯材质（50 ml）VWR21009-342
MicroBCA 蛋白提取试剂盒Pierce23235
2.0 ml 圆底微量离心管，带螺口盖和O型圈Fisher02-681-375
2-D Clean-Up 试剂盒GE Healthcare80-6484-51
尿素Invitrogen15505-050刺激性
CHAPSAmersham Biosciences17-1314-01
二硫苏糖醇（DTT）MPBiomedical, LCC856126刺激性
Immobil ine DryStrip pH 4-7 24 cmAmersham Biosciences176002-46
DuracrylProteomic Solutions80-0148剧毒，致癌物
过硫酸铵FisherBP179-100易燃，有毒，腐蚀性
N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED）Invitrogen15524-010易燃
十二烷基硫酸钠（SDS）FisherBP166-500急性毒性，易燃
琼脂糖Invitrogen15510-027
乙醇FisherHC1100-1GL易燃，有毒
乙酸FisherA491-212易燃，腐蚀性
戊二醛FisherG151-1剧毒，腐蚀性，对环境有害
四硫代硫酸钾SigmaP2926刺激性
乙酸钠EM Science7510
硝酸银Sigma209139腐蚀性，对环境有害
甲醛Sigma252549有毒
硫代硫酸钠SigmaS7026
Tris碱EMD9230
甘氨酸MPBiomedical, LCC808831
甘油MPBiomedical, LCC800688
甲醇FisherA412-4易燃，有毒，健康危害
无水碳酸钠EMDSX0400-3有毒
矿物油ACROS415080010
设备
JA-20 超速离心转子Beckman Coulter334831
Mini BeadbeaterBiospec Products3110BX
Ettan IPGphor II 等电聚焦系统及配件GE Healthcare80-6505-03www.amershambiosciences.com
Ettan DALT 大型垂直电泳系统GE Healthcare80-6485-27www.amershambiosciences.com

参考文献

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