此前已有报道称，二蒽醇（DT；1,8-二羟基-9,10-二氢蒽-9-酮）可作为小分子组织成像的基质辅助激光解吸电离（MALDI）基质；本文提供了在超高清分辨率四极杆-傅里叶变换离子回旋共振（quadrupole-FTICR）仪器上，采用正离子模式MALDI-MS技术，利用DT对组织切片表面内源性脂质进行MALDI成像的实验方案 。
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摘要
摘要
质谱成像（MSI）主要用于MALDI（基质辅助激光解吸电离）技术，以确定化合物在组织切片表面的空间定位与分布模式 基于基质辅助激光解吸/电离的分析技术。针对小分子质谱成像，亟需开发能够提升低分子量（MW）化合物分析性能的新基质。这些新基质应能在增强分析物信号的同时降低MALDI背景信号。此外，使用超高分辨率仪器，如傅里叶变换离子回旋共振（FTICR）质谱仪，已显著提升质谱成像的分辨率与检测能力。 分辨分析物信号与基质信号的能力有助于部分克服与MALDI基质背景信号相关的诸多问题。傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR MS）可降低亚稳态基质簇离子的强度，从而有助于减轻其他仪器上由基质峰引起的某些干扰。高分辨仪器（如FTICR质谱仪）具有优势，因其可同时生成多种化合物的分布图谱，同时仍能确保化学鉴定的可靠性。二羟蒽醇（DT；1,8-二羟基-9,10-二氢蒽-9-酮）此前已被报道作为组织成像的MALDI基质。本研究提供了一种在超高清分辨率混合四极杆FTICR仪器上，利用DT通过正离子模式MALDI-MS对哺乳动物组织切片表面内源性脂质进行MALDI成像的操作方案。
引言
质谱成像（MSI）是一种用于确定化合物在组织切片表面空间定位与分布模式的分析技术1,2。基质辅助激光 解吸/电离（MALDI）质谱成像已用于多肽和蛋白质分析十余年，并在样品制备、检测灵敏度、空间分辨率、重复性及数据处理等方面取得了显著进展3,4。通过整合组织学染色切片与质谱成像实验的信息，病理学家能够将特定化合物的分布与具有病理生理学意义的特征相关联5。
小分子（包括外源性药物6,7及其代谢物8-10）的分布模式也已通过MALDI-MS组织成像技术进行研究11。脂质可能是MALDI成像中研究最广泛的一类化合物，无论是在MS12-17还是MS/MS18模式下均如此。MALDI质谱成像（MSI）在小分子成像中的应用受到若干因素的限制：1）MALDI基质本身即为小分子（通常m/z <500），会产生大量离子信号，这些强信号可能抑制小分子分析物的电离并干扰其检测19,20。为此，已发展出无溶剂基质涂布21、基质升华22以及预涂基质的MALDI质谱23等多种方法，以改善小分子的质谱成像效果。
在小分子质谱成像（MSI）中，能够改善低分子量（low-MW）....
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方案
1. 组织切片
- 组织样本收获后，立即使用液氮进行速冻，如需运输则置于干冰上，并在组织切片前于 -80 °C 下保存。（若使用商业样本，需确保样本以该方式制备。）
- 将器官切割至适合 MALDI 载样靶的尺寸，修除组织上不需要的部分。本研究所述实验中，牛犊晶状体在组织切片前，采用先前描述的方法35进行去囊处理。
- 从 -80 °C 冰箱中取出完整器官，并将其固定于低温组织切片台上。固定牛犊晶状体时，先在冷冻切片机 的组织切片台上滴加一至两滴水，迅速将晶状体放入水中，使其在水凝固前固定到位。也可使用最佳切割温度（OCT）包埋剂将组织固定于切片台上。若使用 OCT 包埋剂，应使用最小量，并需注意避免切下的组织切片被 OCT 污染，以免干扰待测物的离子化与检测5,36,37。
- 使冷冻切片机内部温度平衡至 -18 °C。对于较软或较硬的组织，可分别采用更高或更低的温度。随后将组织沿赤道方向切成 20 μm 厚的切片。大多数组织通常使用 10–15 μm 厚的切片；但由于牛晶状体组织较为脆弱，本实验采用 20 μm 厚的切片。对于牛晶状体组织，弃去最初的组织切片，仅使用接近或位于赤道平面的切片。
- 若对眼晶状体组织进行成像，使用 1.5 μl 甲酸（纯度 98%，液相色谱-质谱级）预先润湿氧化铟锡（ITO）涂层玻璃载玻片的表面。
- 在冷冻切片机内，小心地将组织切片转移至 IT....
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结果
切片后直接解冻贴附于ITO涂层玻璃载玻片上的组织样本应保持完整，无可见撕裂。对于许多组织，可直接将组织解冻贴附于ITO涂层玻璃载玻片上。但对于某些特定组织（如牛晶状体），采用直接解冻贴附时常常会出现严重的组织撕裂（图1a）。在贴附组织前，先用乙醇或甲酸对ITO玻璃载玻片进行预包被（图1b），有助于维持组织切片在贴附过程中的完整性。
基质的选择和溶剂的选取是影响MALDI质谱图质量的重要因素。当从组织切片获得一张合适的MALDI质谱图时，质谱通常在质量检测范围内呈现出密集的脂质信号图2a）。应选择极性相匹配的基质和溶剂 相似的 目标分析物，因为MALDI过程需要分析物在基质晶体中形成固相溶液。通常，当MALDI基质的溶解度与目标分析物的溶解度相近时，可获得最强的分析物信号强度41,42. 图2a
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讨论
成功实现基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）最重要的因素包括：1）组织制备；2）基质选择；3）基质涂布；以及4）数据解释与分析。当样品和基质得到适当制备后，质谱数据采集过程可实现自动化。然而，此类实验的数据分析工作相当耗时。
适当的组织制备对于成功开展基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）实验至关重要。组织来源及其处理方式会对最终分析结果产生重大影响。样品必须立即在液氮中速冻，并在 -80 °C 下保存，且不应长期储存，因为某些代谢物即使在 -80 °C 下也不稳定。
对于许多哺乳动物组织，建议用于基质辅助激光解吸电离质谱成像（MALDI MSI）的组织切片厚度为10–15 μm。在本实验中，采用先前描述的方法35对牛犊晶状体去囊后，沿赤道面切成20 μm厚的组织切片。使用较厚的牛犊晶状体组织切片是因为在组织切片和组织贴附过程中难以保持晶状体组织切片的完整性。晶状体在其赤道平面上具有球形对称性，因此仅收集接近或位于赤道平面的切片。
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
作者谨此感谢Genome Canada和Genome British Columbia提供的平台资金与支持。我们还要感谢Carol E. Parker博士对稿件的审阅和编辑协助。CHL还感谢British Columbia蛋白质组学网络提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 大鼠肝脏 | Pel-Freez Biologicals | 56023-2 | |
| 牛犊晶状体 | Pel-Freez Biologicals | 57114-2 | 使用前应去除囊膜29 |
| 二羟蒽酚（DT） | Sigma-Aldrich | 10608 | MALDI基质 |
| α-氰基-4-羟基肉桂酸（CHCA） | Sigma-Aldrich | 70990 | MALDI基质 |
| 2,5-二羟基苯甲酸（DHB） | Sigma-Aldrich | 85707 | MALDI基质 |
| 利血平 | Sigma-Aldrich | 83580 | |
| 特非那定 | Sigma-Aldrich | T9652 | |
| 甲酸 | Sigma-Aldrich | 14265 | |
| 甲酸铵 | Sigma-Aldrich | 14266 | |
| 氢氧化铵 | Sigma-Aldrich | 320145 | |
| 三氟乙酸（TFA） | Sigma-Aldrich | 302031 | |
| 水 | Sigma-Aldrich | 39253 | |
| 甲醇 | Sigma-Aldrich | 34860 | |
| 乙腈 | Sigma-Aldrich | 34967 | |
| 乙酸乙酯 | Sigma-Aldrich | 34972 | |
| 异丙醇 | Sigma-Aldrich | 34965 | |
| 氯仿 | Sigma-Aldrich | 366927 | |
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 34850 | |
| 乙醇 | Commercial Alcohols | 95% | |
| ES调谐混合液 | Agilent Technologies | G2431A | |
| ITO涂层玻片 | Hudson Surface Technology | PSI1207000 | 确保样品置于导电面一侧 |
| Wite-Out Shake-N-Squeeze修正笔 | Bic | WOSQP11 | |
| 喷笔喷雾器 | Iwata | Eclipse HP-CS | |
| ImagePrep | Bruker | 249500-LS | |
| MALDI适配器 | Bruker | 235380 |
参考文献
- Chaurand, P., Stoeckli, M., Caprioli, R. M. Direct Profiling of Proteins in Biological Tissue Sections by MALDI Mass Spectrometry. Anal. Chem. 71, 5263-5270 (1999).
- Caprioli, R. M., Farmer, T. B., Gile, J. Molecular Imaging of Biological S....
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重印与许可
