我们描述了一种利用可生物降解的聚合物纳米颗粒使干细胞过表达促血管生成治疗因子的方法。所述过程包括聚合物合成及转染脂肪来源的干细胞 体外以及在小鼠后肢缺血模型中验证程序化干细胞促进血管生成的疗效。
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方法文章
利用可生物降解的聚合物纳米颗粒编程干细胞以实现治疗性血管生成
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
可控的血管生长对于成功的组织再生和伤口愈合至关重要，同时也可用于治疗缺血性疾病，如中风、心肌梗死或外周动脉疾病。直接递送促血管生成生长因子具有刺激新生血管形成的能力，但常伴随缺乏靶向性和半衰期短等局限性 体内基因治疗通过递送编码促血管生成因子的基因提供了一种替代策略，但通常需要使用病毒载体，且受限于安全性问题。本文描述了一种新近开发的策略，即通过编程干细胞使其过表达促血管生成因子，从而刺激血管生长。 原位 利用可生物降解的聚合物纳米颗粒。具体而言，我们的策略利用干细胞作为递送载体，借助其向缺血组织迁移的能力 体内. 利用优化的聚合物载体，对脂肪来源的干细胞进行修饰，使其过表达编码血管内皮生长因子（VEGF）的促血管生成基因。我们描述了聚合物合成、纳米颗粒形成及干细胞转染的操作流程 体外以及用于验证表达 VEGF 的干细胞在小鼠后肢缺血模型中促进血管生成功效的方法。
引言
该技术的总体目标是利用非病毒方法改造的干细胞，在缺血部位过表达治疗因子，以促进治疗性血管生成。干细胞经过修饰 离体 首先使用实验室合成的可生物降解纳米颗粒，随后在小鼠后肢缺血模型中进行移植，以验证其促进血管生成和组织挽救的潜力。
可控的血管生长是成功实现组织再生的重要组成部分，同时也对治疗多种缺血性疾病（如中风、肢体缺血和心肌梗死）具有重要意义。目前已开发出多种促进血管生长的策略，包括生长因子递送和基于细胞的治疗。1 尽管在动物疾病模型中观察到了疗效，但这些方法仍存在一些局限性，例如需要超生理剂量的生长因子递送，或细胞单独作用时旁分泌释放不足。克服上述局限性的一种潜在策略是将干细胞治疗与基因治疗相结合，即对干细胞进行基因工程改造 离体 在移植前过表达理想的治疗因子。该策略已在包括后肢缺血在内的多种疾病模型中得到验证2，心脏病3骨愈合4 和神经损伤5, 等等然而，大多数基因治疗技术依赖病毒载体，存在潜在免疫原性和插入突变等安全问题。基于生物材料的非病毒基因递送方法可能克服这些局限，但常面临转染效率低下的挑战。为了加快发现可用于高效非病毒基因递送的新型生物材料，近期研究采用了组合化学与高通量筛选策略。已开发并筛选了可降解聚合物文库，如聚(β-氨基酯)(PBAE)，由此鉴定出若干先导聚合物，其转染效率较传统聚合物载体显著提高。6-7
本文描述了PBAE的合成及其转染脂肪源性干细胞（ADSCs）能力的验证 体外随后在小鼠后肢缺血模型中移植过表达血管内皮生长因子（VEGF）的基因修饰脂肪源性干细胞（ADSCs）。通过生物发光成像追踪细胞命运，利用激光多普勒血流灌注成像（LDPI）评估组织再灌注，并通过组织学分析确定血管生成及组织挽救情况。
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方案
1. 聚合物合成
- 在通风橱中，称取 3,523 mg 丁二醇二丙烯酸酯（C），转移至含有搅拌子的玻璃闪烁瓶中。
- 将 5-氨基-1-戊醇（32）预热至 90 °C 以溶解其盐形式，然后在通风橱中称取 1,533 mg 的 32，并加入含有 C 的闪烁瓶中。此方法将得到 C 与 32 的摩尔比为 1:1.2。
- 立即将含有两种溶液的闪烁瓶置于搅拌器上，设置搅拌速度为 600 rpm。
- 将闪烁瓶转移至设定为 90 °C 的烘箱中，以 1,000 rpm 搅拌 4 小时。若搅拌子卡住，可降低转速。4 小时后，将转速降至 300 rpm，并在 90 °C 下继续维持 12–16 小时。
- 在含有搅拌子的玻璃闪烁瓶中，加入 5 g C32 和 10 ml 无水四氢呋喃（THF）。用铝箔包裹后，高速涡旋至完全溶解。
- 在另一个含有搅拌子的玻璃闪烁瓶中，加入 10 mM 四乙二醇二胺（122），再加入 40 ml THF。
- 将两个闪烁瓶（C32 和 122）同时置于搅拌器上搅拌 5 分钟，然后将两者混合。用铝箔包裹，于室温下以 400 rpm 搅拌 24 小时。最终产物称为 C32-122。
- 为每批 5 g 的 C32-122 准备 5 个 50 ml Falcon 离心管并称重。在实验记录本中记录每个离心管的质量。
- 向每个 50 ml Falcon 离心管中加入 30 ml 无水乙醚。
- 向每个 50 ml Falcon 离心管中加入 10 ml C32-122。
- 剧烈涡旋 Falcon 离心管，然后以 2,500 rpm 离心 2 分钟。注意：析出的聚合物将沉积在管底。
- 弃去上清液，并重复步骤 1.9 和 1.11 两次。
- 将含有析出 C32-122 的开口离心管放入干燥器中，真空干燥过夜。确保所有离心管避光保存。
- 称量所有含有 C32-122 的离心管，以确定析出聚合物的最终质量。
- 将析出的聚合物溶解于无水 DMSO 中，浓度为 100 mg/ml。
- 将溶解后的聚合物溶液在 -20 °C 下避光、防潮保存。
2. 细胞接种
- 用0.1%（wt/vol）明胶预包被T-150组织培养瓶底部，明胶在瓶中保留30–45分钟。明胶包被有助于ADSCs的黏附。
- 吸除预包被T-150培养瓶中的明胶。
- 在含有10% FBS、1%青霉素/链霉素和10 ng/ml bFGF的20 ml DMEM中，加入4 × 106个ADSCs（≤第3代）。
- 将T-150培养瓶置于37 °C、5% CO2培养箱中过夜。
- 次日开始转染操作。
3. 纳米颗粒制备与转染
- 以下步骤用于制备每1.0 × 10个纳米颗粒含有16.1 μg质粒DNA的纳米颗粒6 细胞与质粒的聚合物质量比为30:1。
- 在15 ml Falcon管中，将质粒DNA（1 mg/ml，pVEGF165，Aldevron，ND，USA）用乙酸钠（25 mM）稀释至终浓度为120 μg/ml。
- 在另一个15 ml Falcon管中，将C32-122（100 mg/ml）用25 mM醋酸钠溶液稀释至终浓度为3.6 mg/ml。
- 将各Falcon管中的内容物合并至一个15 ml Falcon管中，立即在高速下涡旋振荡10秒。
- 将离心管在室温下静置10分钟，以使纳米颗粒形成。
- 孵育期间，按每1.0 × 10⁶细胞加入7.8 ml完全添加的DMEM培养基，更换组织培养瓶中的培养液6 转染的细胞
- 将纳米颗粒溶液转移至组织培养瓶中，前后倾斜以使其均匀铺布。
- 将培养瓶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中2 4小时
- 孵育2小时后，将含有纳米颗粒的培养基更换为DMEM。
- 在37 °C、5% CO₂条件下继续孵育2小时后2，细胞已准备好进行下一步 体内 注射
4. 后肢缺血手术操作
- 所有实验均按照斯坦福大学动物护理和使用委员会指南以及批准的APLAC方案进行。小鼠后肢缺血模型的建立方法如先前所述8。详细操作步骤请参见参考文献，以下提供简要描述。
- 通过吸入1-3%异氟烷（氧气流速为1 L/min）对小鼠实施麻醉，并通过脚趾夹捏反应、呼吸频率降低及嗜睡状态确认麻醉深度。
- 使用剃须膏去除小鼠腹部区域及双侧后肢部位的毛发。
- 在大腿内侧中线处做切口，沿中线方向切开并分离表层脂肪垫，以暴露股动脉。
- 在两个部位结扎动脉：远端部位（靠近膝关节）和近端部位（腹股沟韧带稍下方）。
- 进行结扎时，先将动脉与静脉分离，然后用5-0丝线围绕动脉穿线，打两个结以完成结扎。
- 移除两个结扎点之间的动脉组织。
- 用PBS冲洗手术区域，随后缝合切口。
- 此时可停止麻醉。保持小鼠体温直至其苏醒。术后护理可在苏醒前于切口部位皮下注射2-4 mg/kg利多卡因。进一步镇痛处理可包括在术后12小时和24小时时分别皮下给予0.05-0.1 mg/kg丁丙诺啡。术后七天内每日监测小鼠健康状况，观察呼吸模式、明显疼痛或痛苦表现以及皮肤颜色的变化。
- 通过激光多普勒血流成像确认后肢缺血情况。
5. 细胞注射
- 当转染细胞和小鼠准备就绪后，用 PBS 洗涤转染细胞，胰酶消化，离心，然后计数。
- 将细胞重悬于 PBS 中，密度为每毫升 10 × 106 个细胞。
- 应将细胞悬液分装至不同的 Eppendorf 管中，每管体积为 110 μl。这可确保每只小鼠接受等量的细胞。
- 使用 2.5% 异氟烷（氧气流速 1 L/min）对每只小鼠实施麻醉。
- 用酒精棉片清洁注射部位。
- 使用 27 G 结核菌素注射器，将细胞悬液在注射器内反复抽吸，以确保形成均一的悬液。然后吸取 100 μl 细胞悬液。
- 将一半细胞悬液注射至内收肌区域，另一半注射至小腿肌区域。注射后，将注射器留置原位至少 15–30 秒，以防止细胞悬液泄漏。
- 动物实验的适当对照包括：1）转染非编码质粒的细胞（e.g. 无生物学活性的质粒）；2）单独的细胞；以及 3）PBS。
- 注射完成后，将小鼠撤离麻醉，并保持其体温直至苏醒。
6. 生物发光成像
- 开始生物发光成像（BLI）时，按照上述方法对小鼠进行麻醉。
- 使用酒精棉片清洁注射部位。
- 使用胰岛素注射器吸取 100 μl 浓度为 15 mg/ml 的 D-荧光素酶底物（D-luciferin，为萤火虫荧光素酶的底物）。避免底物接触光照。
- 进行腹腔注射时，捏住小鼠背部皮肤使其腹部皮肤绷紧，将针头经腹腔注入腹部区域，并注射 100 μl 底物溶液。
- 将小鼠置于麻醉状态下放入 IVIS 荧光素酶成像室中。
- 设置曝光时间为 1.0 分钟，参数设定完成后开始采集图像。
- 图像采集完成后，标记感兴趣区域以测量荧光素酶信号。本实验中，标记细胞注射侧的缺血肢体部位。
- 此后每 3–5 分钟持续测量荧光素酶信号，直至信号达到峰值并开始下降。该峰值用于不同小鼠之间以及多个时间点之间的比较。
- 实验结束后，将小鼠从成像室和麻醉状态中移出，并保持其体温直至苏醒。
7. 激光多普勒灌注成像
- 激光多普勒灌注成像按先前所述方法进行。8 此处简要描述该操作流程。
- 在进行多普勒成像前，应将小鼠后肢及腹部区域的毛发彻底剃除，以避免毛发造成伪影。
- 准备进行多普勒成像时，应按照上述方法对小鼠实施麻醉。
- 将小鼠置于加热板上，使其体温维持在 36 °C，同时通过直肠温度计监测体温。
- 将小鼠仰卧置于非反光黑色表面上，并通过鼻罩持续维持麻醉状态。小鼠四肢应均匀展开并暴露。
- 将激光多普勒传感器置于小鼠上方约 15 cm 处，并调整传感器激光指向小鼠腹股沟区域。
- 当小鼠和多普勒传感器就位后，可通过按下 LDPIwin 软件中的“开始”按钮采集图像。
- 可通过选定双侧后肢（缺血侧与非缺血侧）作为感兴趣区域（ROI）来获取相对灌注量。缺血侧与非缺血侧后肢的平均灌注量之比即表示相对灌注水平。
8. 组织采集步骤
- 当准备收获小鼠组织用于组织学和/或生物化学处理时，应实施安乐死。此处通过将小鼠暴露于5%异氟烷3-5分钟，随后进行颈椎脱位以完成安乐死。
- 在腹部远端区域及后肢近端处，环绕后肢环形切开表层皮肤。切口从腹侧延伸至背侧，以便将皮肤向后拉至足部，暴露后肢。
- 向后拉回皮肤后，可使用钝头解剖剪在骨盆与股骨关节处进行钝性分离，截除肢体。
- 取两个主要组织用于分析：内侧内收肌群和腓肠肌。
- 用于组织学分析时，将一个或两个组织包埋于最佳切割温度（OCT）包埋剂中，以进行冷冻切片。
- 用于生物化学分析时，将一个或两个组织放入1.5 ml离心管中，并浸入液氮浴中至少2分钟。样品可于-80 °C保存，以备后续处理。
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结果
将带正电荷的聚合物（C32-122）与带负电荷的DNA质粒混合后，二者可自组装形成纳米颗粒。可通过电泳分析验证纳米颗粒的形成。 即 C32-122 与质粒 DNA 之间的复合物将阻止 DNA 在电泳过程中的迁移。该聚合物作为转染试剂，可促进 DNA 更高效地进入靶细胞，并实现编码蛋白的后续表达。图2）。可将细胞转染任何治疗基因或报告DNA（如绿色荧光蛋白（GFP）），结合荧光激活细胞分选（FACS）和荧光显微镜技术，高效快速优化聚合物载体设计及转染条件。图3对于ADSCs，转染效率高于20%被认为较为理想。
为了便于追踪移植后细胞的命运，可将细胞稳定转导表达荧光素酶，从而通过非侵入性生物发光成像（BLI）在活体内实时监测细胞的存活状态和分布情况。in vivo 生物发光成像显示，来自后肢的发光信号强度较高（图4，左图），表明植入的细胞在数天内仍保留在注射部位，在21天的观察期内未发现细胞向其他组织或器官明显迁移。总体而言，细胞信号随时间逐渐减弱，...
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讨论
本文报道了一种利用非病毒性、可生物降解的纳米颗粒使成体干细胞过表达治疗因子的编程方法。该技术平台特别适用于干细胞可自然归巢的疾病治疗，如缺血性疾病和癌症。9-10 此外，非病毒基因递送平台可实现治疗因子的瞬时过表达，适用于大多数组织再生和伤口愈合过程。转染过程依赖于DNA高效进入细胞，在一般情况下，该方法在活跃分裂的细胞类型中效果良好，但在非分裂细胞中效果较差。PBAE聚合物的转染效率因细胞类型而异，需针对不同细胞类型 individually 优化，还可进一步探索化学结构修饰，以在特定靶向细胞群体中实现最佳转染效率。11-12 采用上述方法转染的细胞通常可实现为期两周的瞬时基因表达与蛋白分泌，基因表达峰值出现在第2至4天左右。对于动物实验，建议选用转染效率高于20%的ADSCs。每次改变实验参数时，均建议进行FACS分析，以保持实验一致性。例如 新的聚合物、质粒或细胞批次
与市面上可获得的非可降解转染试剂（如PEI和Lipofectamine 2000）相比，上述报道平台所使用的PBAE聚合物具有可生物降解性，更适用于...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
作者感谢美国心脏协会国家科学家发展基金（10SDG2600001）、斯坦福Bio-X跨学科倡议计划以及斯坦福医学学者研究计划提供的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Invitrogen | 11965 | |
| 胎牛血清 | Invitrogen | 10082 | |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15070 | |
| 碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | 100-18B | |
| 1,4-丁二醇二丙烯酸酯 (90 %) | Sigma Aldrich | 411744 | 缩写: C |
| 5-氨基-1-戊醇 (97 %) | Alfa Aesar | 2508-29-4 | 缩写: 32 |
| 四乙烯五胺 >99 %) | Molecular Biosciences | 17774 | 缩写: 122 |
| 乙酸钠 | G-Biosciences | R010 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Invitrogen | 14190-144 | |
| 无水四氢呋喃 (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 401757 | |
| 无水乙醚 (>99 %) | Fisher Scientific | E138-4 | |
| 无水DMSO (>99.9 %) | Sigma Aldrich | 276855 | |
| 明胶 | Sigma Aldrich | G9391 | |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200 | |
| D-荧光素 | GoldBio | ||
| 最佳切割温度包埋剂 (O.C.T) | Tissue-Tek | 4583 | |
| 大鼠抗小鼠CD31抗体 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Alexa Fluor 594 标记的抗大鼠IgG抗体 | Invitrogen | A11007 |
参考文献
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