晚期胚胎表皮 果蝇 胚胎提供了一种 体内 用于快速分析穿刺伤口反应的系统，可与基因操作或化学微量注射处理相结合，以推动伤口愈合研究并向哺乳动物模型转化。
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摘要
摘要
Drosophila 胚胎发育形成一层强韧的表皮层，既可保护内部细胞免受严酷的外部环境影响，又能维持细胞稳态。使用玻璃针进行穿刺损伤可直接触发快速的表皮伤口反应，激活伤口转录报告基因，该反应可通过活体胚胎或幼虫中局部的报告信号进行观察。穿刺或激光损伤还可提供信号，促进血细胞向伤口部位募集。令人意外的是，在晚期胚胎中进行严重的（贯穿性）穿刺损伤极少干扰正常的胚胎发育，当在油性介质中进行胚胎注射以最大限度减少血淋巴从穿刺部位立即泄漏时，超过90%的受伤胚胎可存活至成虫阶段。该伤口实验操作需要对Drosophila胚胎进行显微操作，包括在琼脂平板上手动排列胚胎，并将排列好的胚胎转移至显微镜载玻片上。Drosophila表皮伤口反应检测系统提供了一种快速方法，可用于检验多种促进伤口愈合的生物学功能所需的遗传因素，也可用于筛选潜在的促进伤口愈合的化学化合物。由于其生命周期短且培养简便，Drosophila是一种强大的模式生物。Drosophila清洁性伤口愈合似乎以尚待深入研究的方式协调了表皮再生反应与先天免疫反应，从而为发现Drosophila与哺乳动物表皮损伤中保守的调控机制提供了优良的研究体系。
引言
操作 果蝇 采用显微注射技术处理胚胎是一种成熟的检测方法1表皮伤口响应报告基因方法的意义在于将穿刺/显微注射方案与荧光报告基因相结合，从而实现对伤口响应过程的可视化观察 体内 表皮损伤后的反应 果蝇 胚胎。该方法的目的是使更广泛的科研人员能够利用果蝇作为研究工具，探究调控表皮穿刺损伤转录反应过程的机制。单层表皮在 果蝇 提供了一个简单的系统，用于研究穿刺损伤后的表皮伤口反应2。该 果蝇 胚胎是通过遗传学手段解析伤口修复各阶段（包括伤口反应、炎症和重新上皮化）的有力模型系统3。部分原因在于，即使胚胎发育模式出现严重紊乱，许多或大多数合子突变体仍能存活至胚胎发育结束，并形成表皮屏障。先前对一个高度保守的转录因子 Grainy head（Grh）的研究表明，Grh 的靶基因 多巴脱羧酶 (Ddc）和 酪氨酸羟化酶 (请在损伤部位周围被转录激活4. 果蝇 作为伤口应答的模式生物，为推进哺乳动物伤口愈合研究提供了互补的研究路径5后续研究已鉴定出更多 黑腹果蝇 伤口诱导基因并开发了 "工具包" 多种荧光伤口报告分子用于监测 体内 表皮对无菌创伤的应答6. 近期关于调控的报告 黑腹果蝇 伤口愈合研究主要集中于伤口闭合表型，从而发现了许多调控细胞迁移的通路7,8通过分析荧光伤口报告基因，我们的研究鉴定出一组新的基因，这些基因对于表皮伤口诱导基因的局部表达是必需的9伤口反应报告基因方法的优点之一在于，其结果能够更深入地揭示信号如何从损伤部位传递至邻近细胞的机制。然而，该方法的缺点在于，所得结果无法直接关联到伤口愈合或修复过程中的表型变化。清洁伤口穿刺方案在遗传学和化学筛选中的更广泛应用，将有助于鉴定出表皮损伤转录反应的新调控因子。 并进一步将伤口愈合的研究发现转化为哺乳动物损伤治疗模型。
方案
黑腹果蝇（Drosophila）胚胎伤口实验方案可概括为五个步骤：（1）胚胎收集，（2）胚胎准备，（3）胚胎损伤，（4）胚胎显微注射，以及（5）胚胎固定。
1. 胚胎收集
- 收集羽化后2-3天的成虫，将50只雌蝇和25只雄蝇放入胚胎收集笼中。
- 连续3天，每天早晨放置一个新的苹果汁琼脂加酵母平板。
注意事项：为了获得最佳的胚胎收集效果，应将果蝇置于25℃环境中，按照12小时光照-12小时黑暗的昼夜循环周期进行培养。 °C 培养箱（05:00 开灯 "开启" 和17:00关灯 "关闭"）；雌性果蝇会对光周期的变化产生响应，在光照条件从暗转明时会产下更多的卵 "开启" 光照 "关闭"10,11. - 在第3天下午，将一块新鲜的苹果汁加酵母琼脂平板放入笼中，收集胚胎2小时。随后将一块新的酵母平板放入笼中，并保留已收集2小时的平板。
- 将收集板再保存14天 小时 在25 °C 用于胚胎的衰老处理。
注意事项：可在伤口愈合的任何阶段进行检测 黑腹果蝇 发育；本文所述的伤口诱导型转录报告系统在15-16期阶段具有最佳活性 12. 到发育晚期17期时，胚胎已过于成熟，难以穿透逐渐形成的角质层，从而无法有效激活伤口报告基因或检测伤口诱导的转录反应。为了使胚胎收集和损伤处理的时间能够在实验室工作高峰时段内进行，我们采用以下时间安排：胚胎收集持续2小时（16:00–18:00），在18:00时将收集板更换为新的收集板，并将原收集板置于25℃下继续培养 °在4°C下孵育14小时（过夜），并于次日08:00对胚胎进行包埋。
2. 胚胎制备
注意事项：本实验方案涉及多种锋利或由玻璃制成的工具和物品。请小心操作所有锐器和玻璃制品，以避免造成人身伤害。
- 用毛笔轻轻将胚胎从收集板上移出，向培养板中加入2-3 ml水并轻轻旋转。将水和胚胎从培养板转移至尼龙网和收集管中。
- 向塑料培养皿盖中加入4-5 ml漂白剂，将装有胚胎且覆盖有筛网的一端浸入漂白剂中处理2分钟，以去除胚胎的外层卵壳。在漂白过程中手动旋转收集管数次，防止胚胎在漂白剂中结团。用清水冲洗胚胎10次，并将去壳后的胚胎连同覆盖筛网的收集管置于纸巾上吸干。
- 使用解剖针转移 ∼将50个胚胎从尼龙网转移到琼脂平板上。我们在琼脂平板中加入绿色食用色素，以增强对比度并辅助胚胎排列。在解剖显微镜下，制作两排平行的 ∼25 个胚胎，将胚胎在载玻片上排列整齐，使其与显微注射装置上的穿刺针呈直角。胚胎之间应留出少量空间（约 1 个胚胎长度），以利于气体交换。两条平行的胚胎列间距应约为 5 mm。
- 将带有双面胶带的载玻片置于排列好的胚胎上方，轻轻按压载玻片，使胚胎从绿色培养板转移至载玻片上。随后将胚胎在空气中干燥 ∼25 分钟，以降低胚胎内部压力，防止损伤时破裂。
- 在胚胎上滴加2-3滴卤代烃油混合物，以防止进一步脱水。
3. 胚胎损伤
- 将胚胎载玻片放置在显微注射镜的载物台上。在视野中找到胚胎，并练习操作倒置显微镜的载物台移动。
注意事项：在使用针具前，应沿胚胎的背腹轴方向对焦至胚胎的中层平面。为高效损伤排列整齐的胚胎，应从靠近针具装置的一排开始进行损伤。移动载物台，使排列整齐的胚胎排的顶端进入视野。 - 小心地将拉制好的针头放入持针器中并固定。使用显微操作仪将针头向下移动至载玻片附近。调整针头与胚胎对齐，并处于同一焦平面。当针头与胚胎处于同一焦点时，不要再通过显微操作仪移动针头。
- 移动载物台，彻底刺穿胚胎，然后移至该行的下一个胚胎。完成第一行所有胚胎的穿刺后，在移动载玻片之前，先使用显微操作仪将针头完全上移并远离载物台；手动将载玻片旋转180°° 并缠绕第二排。
- 将胚胎置于卤代烃油中，室温保存，若需进行胚胎固定，则继续后续操作 原位 杂交或抗体染色（参见操作步骤 5). 或者，将胚胎置于卤代烃油下保存4-6小时，随后进行伤口转录荧光报告基因的可视化观察（代表性结果）。
注意事项：为了观察荧光报告基因，我们使用50% 1-苯氧基-2-丙醇对胚胎进行麻醉处理13将胚胎从卤代烃油中取出，置于新的载玻片上。在胚胎周围放置玻璃珠，加入几滴麻醉剂，然后盖上盖玻片。
4. 胚胎显微注射
注意事项：本方案中使用的显微注射装置在实验过程中无法自动递送特定体积的溶液。我们在溶液中加入染料以可视化显微注射过程，并尽量使递送的体积保持一致。若向胚胎中注射过多溶液，卵黄膜将会破裂。
- 从后方用1加载针头 µ化学溶液加染料的升例如 0.6 M H2O2）。让毛细作用将化学溶液吸入针尖。
- 折断针尖时，将盖玻片以一定角度置于载玻片上，并在其边缘涂抹卤代烃油混合物。将装好的针尖对准倾斜盖玻片的边缘，在显微镜下聚焦后，轻轻移动盖玻片边缘划过针尖，直至针尖折断。施加压力于显微注射装置，检查化学溶液与染料是否从针尖流出。
- 将含有排列整齐胚胎的载玻片置于显微镜载物台上。调整焦距，使胚胎与注射针处于同一焦平面。同时对每个胚胎进行穿刺，并显微注射化学溶液及染料。
注意事项：针头堵塞情况较为常见，需更换新针头以避免显微注射不完全。钝头针尖的穿刺效果不如斜面针尖清晰。调整盖玻片角度至非90°° 断裂时的角度最有利于形成斜角针尖。
5. 甲醛固定
注意事项：本实验中使用的化学品 黑腹果蝇 固定剂有害。请使用个人防护装备（例如 处理化学品时应佩戴手套、实验服和安全护目镜。处置受管制化学品时，须遵循各机构的相关规定。
- 损伤后，等待15、30、60分钟或更长时间，以使损伤诱导基因发生转录激活。为将胚胎从注射载玻片上移除，需小心地将卤代烃油混合物从载玻片上吸除，将载玻片倾斜靠在支架上，并用擦镜纸轻拭其末端。
- 使用玻璃移液管将庚烷冲洗过载玻片，并将冲洗液洗入玻璃培养皿中。庚烷会溶解胶带并释放出胚胎。持续冲洗直至所有胚胎从载玻片上完全移除。继续处理下一张载玻片，直至所有载玻片上的胚胎均被移除。
- 将正庚烷与胚胎溶液从玻璃培养皿转移至一个20 ml闪烁瓶中。振荡瓶体2-3分钟，弃去正庚烷，加入5 ml新鲜正庚烷。
- 加入5 ml新鲜的固定液（固定液配方见试剂列表）。盖紧瓶盖，并固定于旋转摇床。将装有胚胎的瓶子在220–230 rpm条件下振荡摇动25分钟。
- 振荡后，等待界面处的气泡破裂。用移液器彻底移除下层水相，注意避免吸出胚胎。下层为固定液，应妥善处理。
- 加入5 ml甲醇，盖紧小瓶，手动剧烈振摇20-30秒，混匀后置于实验台上。受损的胚胎将停留在分裂间期，不会沉入底部。
注意事项：固定后，未损伤胚胎的卵黄膜通常会在甲醇脱水步骤中破裂。然而，受损胚胎的卵黄膜已经破损，脱水步骤无法去除卵黄膜。因此需要手动去卵黄膜，以完成固定程序。 - 小心移除上层的庚烷，然后加入 5 ml 新鲜甲醇。振荡离心管，胚胎应会沉降。
- 用玻璃移液管移除甲醇加胚胎溶液，并收集到玻璃培养皿中的尼龙网收集管内。
- 除去甲醇，并用1x冲洗胚胎 PBS 溶液
- 将胚胎从尼龙网转移到苹果汁平板上，沿平板表面分散开胚胎。
- 将胚胎转移至双面胶带载玻片上，用1x覆盖胚胎 PBS
注意：由于卵黄膜的存在，胚胎容易发生聚集。使用苹果汁培养皿可快速分离聚集的胚胎。必须将胚胎从培养皿中取出并转移至双面胶带载玻片上，因为当施加外力以去除胚胎的卵黄膜时，胚胎会沉入琼脂培养皿中。 - 用解剖针小心地推动胚胎 "流行" 卵黄膜。胚胎应在PBS中下沉。
- 使用玻璃移液管转移1x 将 PBS 和胚胎加入 1.5 ml 离心管中。用 1x PBS 清洗胚胎 PBS 和 4 ℃ 保存 °C. 使用乙醇:PBS 梯度溶液对胚胎进行脱水处理，并继续后续步骤 原位 杂交或免疫定位方案14.
结果
为了获得本方法所示结果，将绿色荧光蛋白（GFP）的开放阅读框与一个来自伤口诱导增强子序列的启动子/ 多巴脱羧酶 (Ddc）且DsRed与伤口增强序列融合 酪氨酸羟化酶 (ple)4,6. 在活体中 果蝇 胚胎中荧光伤口报告蛋白的成熟在损伤后4-6小时达到最佳，此时间段既允许蛋白积累至可观察水平，也使荧光蛋白有足够时间氧化至荧光状态15要观察报告基因的定位，使用复合荧光显微镜即可。若需更高倍数观察报告基因的定位，共聚焦显微镜是最佳选择，可对多个光学切片生成最大强度投影图1). 共聚焦显微镜 体内 成像 果蝇 胚胎的快速波动使得对其进行成像较为复杂。使用20倍物镜可获得胚胎的全景图像，而使用40倍物镜可获得伤口部位的近景图像。表皮伤口报告基因定位的顶视图可通过连续10次成像获取 1µm 光学切片。可通过连续40次成像获取表皮伤口报告基因定位的侧视图 1 µm 光学切片
使用标准的遗传杂交方法，可将伤口报告基因与遗传突变相结合。本文展示的一个实例是 Flotillin-2 (Flo-2），因为功能缺失型（通过P元素插入产生的无效等位基因）和功能获得型（通过在所有细胞中组成型表达产生的过表达）突变体的 Flo-2 证明Flo-2基因产物对于抑制定位是必要且充分的 Ddc-GFP 伤口报告基因9 (图2A 和 2B）。利用显微注射方案，可检测化学溶液的引入是否能够超激活或抑制伤口报告分子的定位。化学损伤的胚胎在受到损伤的同时被注射含有1%甲苯胺蓝染料与溶解化合物按1:4比例混合的溶液。甲苯胺蓝染料可用于直观确认溶解化合物是否成功注入体腔。对照组胚胎则使用含有1%甲苯胺蓝染料与溶剂（不含化学物质）按1:4比例混合的断裂针头进行损伤处理。本文展示了两个示例，分别为过氧化氢（H₂O₂）和2O2）和甲基-β-环糊精（MβCD），因为这两种化学溶液均足以全局性激活定位 Ddc-GFP 伤口报告基因9 (图2C 和 二维）。过氧化氢（H₂O₂2O2) 在 H 中稀释2O 到 0.6 M。甲基-β-环糊精（MβCD）溶于 1 mM NaOH 中至 3 mM。利用胚胎固定方案，可检测伤口周围局部区域中伤口响应基因的转录激活。本文展示的一个实例是 原位 RNA探针杂交检测 Ddc 和 ple 转录本4,6,9 (图3A 和 3B).
图 1. Ddc-GFP 与 ple-DsRed 伤口报告基因的定位。 受损的野生型胚胎的明场与荧光图像。（A） Ddc-GFP 伤口报告基因的顶视图。（B） ple-DsRed 伤口报告基因的顶视图。所有图像均使用 Leica SP2 共聚焦显微镜在 20X 物镜下采集。箭头指示伤口位置。数据图中的虚线标示胚胎的轮廓。点击此处查看高分辨率图像。
图2. Ddc-GFP伤口报告基因在遗传突变背景及化学物质显微注射胚胎中的定位。 受伤的Flotillin-2（Flo-2）突变体胚胎的明场与荧光图像。（A） 功能缺失型Flo-2 {KG00210}突变体，报告基因活性在所有表皮细胞中扩散。（B） 功能获得型Flo-2（armadillo-GAL4, UAS-Flo2）突变体，报告基因活性在所有表皮细胞中受到抑制。（C） 过氧化氢（H2O2）溶液显微注射，报告基因活性在所有表皮细胞中扩散。（D） 甲基-β-环糊精（MβCD）溶液显微注射，报告基因活性在所有表皮细胞中扩散。所有图像均使用Leica SP2共聚焦显微镜采集，物镜倍数为20X。箭头指示伤口位置。数据图中的虚线标示胚胎轮廓。点击此处查看高分辨率图像。
图3. 伤口应答基因RNA转录本的检测 荧光图像 原位 杂交与损伤部位的 RNA 检测 野生型 胚胎 Ddc （A） 和 请 （B） RNA转录本在伤口部位周围聚集。所有图像均使用Leica SP2共聚焦显微镜配合20倍物镜采集。箭头指示伤口位置。数据图中的虚线标示胚胎轮廓。 单击此处以查看大图.
表1. 表皮伤口响应报告基因汇总 四个伤口响应报告基因的插入（Ddc、ple、msn、kkv在第二和第三条染色体上均存在伤口响应报告基因，这些报告基因会在刺伤部位周围有限数量的表皮细胞中激活荧光基因（GFP 或 DsRed） 野生型 背景例如 “局部”表型） Ddc 和 msn 伤口反应报告基因在刺伤损伤后需要Grh来激活荧光基因例如 “无”表型）。所有伤口报告基因在刺伤后均需要 Flo-2 来实现荧光基因的定位（例如 “全局”表型 单击此处以查看大图.
讨论
对外部信号产生即时的转录调控反应，使细胞能够协调对细胞外刺激的局部响应，这些刺激可能包括应激、损伤或感染。对局部反应的不当控制可能对邻近细胞造成损害，并导致用于修复损伤的资源浪费。Drosophila 胚胎为在一种成本低廉且易于维护的模式生物中开展基础伤口愈合实验提供了优良体系。在其他模式生物中的研究与Drosophila研究之间开展合作的潜力，为探索众多生物学问题提供了独特的机会。
伤口报告系统的另一种技术是将突变背景进行遗传组合，从而为检验新基因在表皮伤口反应通路激活中的作用提供一种高效的方法。我们已拥有两种表皮伤口诱导的转录报告系统，分别位于2nd 和 3rd 染色体5. 在本研究中，我们使用UAS和GAL4过表达系统16对于致死突变等位基因的研究，我们使用带有荧光标记的平衡染色体来确定遗传背景， 例如 Kruppel-GFP17我们已在多种遗传背景下分析了伤口报告基因的定位情况（表1).
该技术的一种可能改进是将显微注射与创伤处理相结合。可通过显微注射将化学溶液导入胚胎中。已有多种化合物经过测试，发现能够调控表皮创伤报告基因的活性9。这种同时进行创伤和显微注射的方法可用于增加对创伤信号产生响应的果蝇（Drosophila）胚胎细胞数量，并可直接用于监测创伤后基因表达的变化18。显微注射技术未来的一个应用方向是筛选新型化学物质对表皮创伤反应的调控作用。
Drosophila 作为遗传学研究的模式系统，提供了多种简单且高效的实验方案，可用于解决复杂的科学问题。近期关于 Drosophila 技术可行性的研究报道强调了利用血细胞迁移19 和寄生蜂感染20 等手段，进一步拓展 Drosophila 研究领域的影响力。除了伤口修复研究外，Drosophila 还以成虫盘系统21,22 作为组织再生的经典模型。成虫盘再生研究与穿刺/显微注射损伤技术的结合，为发现高度保守的组织修复机制提供了优良的研究体系。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本方案由 McGinnis 实验室的前成员 Kim A. Mace 和 Joseph C. Pearson 共同开发。我们感谢布卢明顿果蝇品系中心持续不断地整理和分发宝贵的果蝇品系。 本研究获得了美国国立卫生研究院（R01 GM077197 和 K12 GM68524）以及 Herbert Stern 家族的资助。MTJ 目前由美国国家研究资源中心资助项目 5G12RR003060-26 和美国少数民族健康与健康差异研究所资助项目 8G12MD7603-27 支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国少数民族健康与健康差异研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 酵母 | Sigma Aldrich | 51475 | |
| 苹果汁 | 通用品牌 | ||
| 琼脂 | Fisher Scientific | 50-824-297 | |
| 漂白剂 | 通用品牌 | ||
| 卤代烃油，700 W | Sigma Aldrich | H8898 | |
| 卤代烃油，27 W | Sigma Aldrich | H8773 | |
| 1-苯氧基-2-丙醇 | Sigma Aldrich | 484423 | |
| 过氧化氢 | Fisher Scientific | H324 | |
| 甲基-β-环糊精 | Sigma Aldrich | C4555 | |
| 甲苯胺蓝 | Sigma Aldrich | 89640 | |
| 甲醛，16% | Polysciences, Inc | 18814-20 | 有毒化学品 |
| 庚烷 | Fisher Scientific | H360-1 | 有毒化学品 |
| 甲醇 | Fisher Scientific | A412-1 | 有毒化学品 |
| 10x PBS | Fisher Scientific | 50-899-90013 | |
| 0.5 M EGTA | Fisher Scientific | 50-255-956 | |
| RNase 无 DNA 酶的 H2O | Fisher Scientific | BP2819-100 | |
| Drosophila 培养箱 | Genessee Scientific | 59-197 | |
| 果蝇饲养笼 | Genessee Scientific | 59-100 | |
| 胚胎收集管 | Genessee Scientific | 46-101 | |
| 塑料培养皿 | Fisher Scientific | 50-202-037 | |
| 双面胶带 | 通用品牌 | ||
| 画笔 | 通用品牌 | ||
| 解剖针 | Fisher Scientific | 08-965A | 尖锐物品 |
| 玻璃盖玻片 | Thermo Scientific | 3306 | 尖锐物品 |
| 显微镜载玻片 | Thermo Scientific | 4445 | 尖锐物品 |
| 体视显微镜 | Carl Zeiss | Stemi-2000 | |
| 毛细玻璃针 | FHC | 30-30-1 | 尖锐物品 |
| 拉针仪 | Narishige | PC10 | |
| 显微注射针夹持器 | Narishige | MINJ4 | |
| 显微操作器 | Narishige | MN151 | |
| 倒置显微镜 | Carl Zeiss | Primo-Vert | |
| 玻璃培养皿 | Fisher Scientific | 08-747A | 尖锐物品 |
| 玻璃巴斯德移液管 | Fisher Scientific | 22-063-172 | 尖锐物品 |
| 橡胶吸头 | Fisher Scientific | 03-448-25 | |
| 吸水纸（Kimwipe） | Fisher Scientific | 06-666A | |
| 闪烁瓶 | Fisher Scientific | 03-337-7 | 尖锐物品 |
| 旋转摇床 | Fisher Scientific | 14-259-260 | |
| 1.5 ml 离心管 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 激光共聚焦扫描显微镜 | Leica | SP2 | |
| 固定液 | (5 ml) | ||
| 16% 甲醛 | 2.5 ml | 有毒化学品 | |
| 10x PBS | 0.5 ml | ||
| 0.5 M EGTA | 0.5 ml | ||
| RNase 无 DNA 酶的 H2O | 1.5 ml | ||
| 卤代烃油混合液 | (10 ml) | ||
| 卤代烃油，700 W | 5 ml | ||
| 卤代烃油，27 W | 5 ml |
参考文献
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