创伤显微注射和分析在体内表皮的伤口本地化响应记者在果蝇胚胎。

Summary

极后期果蝇胚胎的胚胎表皮提供的体内系统的快速穿刺伤口响应分析，可以用基因操作或化学显微注射治疗组合以推进研究在伤口愈合翻译成哺乳动物模型。

Abstract

果蝇胚胎发育，供应既保护了内部的细胞从一个严峻的外部环境以及维持细胞稳态强大的表皮层。穿刺伤用玻璃针提供了一种直接的方法来触发快速表皮伤口响应，激活伤口转录记者，这可以通过一个局部记者信号在活胚胎或幼虫被可视化。穿刺或激光的伤害还规定，促进血细胞的招募到伤口部位的信号。出人意料的是，重度（通过，并通过）穿刺损伤后期胚胎只有很少干扰正常胚胎发育，如大于90％，例如受伤胚胎存活到成年时的胚胎中，最大限度地减少直接泄漏血淋巴中的从穿刺部位的油介质被注入。卷绕过程确实需要显微操作果蝇胚胎，其中胚胎在银手动对准AR板和对齐胚胎显微镜载玻片转移。 果蝇表皮伤口响应分析提供了一种快速的系统进行测试的各种生物学功能，促进伤口愈合，以及一种方法来筛选潜在的化学化合物，其促进伤口愈合的基因的需求。生命周期短，易培养例行使果蝇的一个功能强大的模式生物。 果蝇清洁伤口愈合出现协调表皮再生反应，与先天免疫反应，在方式，则仍在调查中，它提供了一个很好的系统来找到保守的监管常见的果蝇和哺乳动物表皮伤人机制。

Introduction

用显微注射技术果蝇胚胎的操控是一个行之有效的分析^1。表皮伤口响应报道方法的意义在于对协议 ​​进行穿刺/注射结合荧光报告和可视化的体内响应于表皮损伤的果蝇胚胎。该方法的目的是使一组科学家更广泛的使用果蝇作为一种工具，以调查，调节表皮穿刺伤的转录反应的进程。单层表皮果蝇提供了一个简单系统中的穿刺伤²后，研究表皮伤口响应。 果蝇胚胎是一个强大的模型系统进行遗传解剖的伤口修复的阶段，包括伤口反应，炎症和表皮细胞再生^3。这部分是因为许多或大多数合子突变体存活到embryogenes的端是发展表皮屏障，即使发育模式去深刻出差错。以前表征一个高度保守的转录因子粒状头（GRH），确定该GRH-靶基因的多巴脱羧酶（DDC）和酪氨酸羟化酶（PLE）的转录周围损伤⁴的位点被激活。 果蝇作为模式生物用于伤口响应提供调查的补充，以推进研究在哺乳动物伤口愈合^5。随后的研究发现有其他果蝇伤口诱导的基因，并制定了"工具箱"的许多荧光伤口记者来监视体内表皮伤口的反应来清洁伤人^6。对果蝇伤口愈合的调控最近的报道都集中在伤口闭合型，允许探索多种途径调节细胞迁移^7,8。用的分析荧光伤口记者，我们的研究已经确定了一套所需的表皮伤口诱导基因⁹本地化表达基因的小说。一项所述的伤口响应报道方法的优点是，该结果提供了更深入的信号是如何从损伤部位转导到相邻小区的机制。然而，在伤口响应报道方法的缺点之一是，结果不直接链接到在伤口愈合或修复的表型。在遗传和化学屏幕更广泛地利用清洁伤口穿刺协议将允许转录反应的新的监管机构，以表皮伤人被识别并进一步伤口愈合发现翻译成伤治疗哺乳动物模型。

Protocol

果蝇胚胎伤口协议可以概括为五个步骤:（1）胚胎收集，（2）胚的制备（3）胚胎伤人，（4）胚胎显微注射，和（5）胚胎固定。

1。胚胎收集

1. 收集成蝇，eclosing后2-3天，加上50名女性和25位男性到胚胎收集笼。
2. 每天早晨将一个新鲜的苹果汁琼脂加酵母片3天。
   注:为了获得最佳的胚胎收集，循环在25℃培养箱中培养12小时昼夜时间表苍蝇（05:00灯"ON"和17:00灯"关"）;雌性果蝇作出回应的变化，光周期和将从灯光开关转到"ON"，以灯为^"OFF"10,11中存入大批量的鸡蛋。
3. 在第3天下午，放置一个新鲜的苹果汁加酵母琼脂平板上笼，收集胚胎2小时。将新的酵母片上笼并保存2小时收集板。
4. 存储该收集板为额外的14小时，在25℃下老化所述胚胎。
   注:伤口愈合可以在任何阶段果蝇发育过程中检测，在本文中所描述的伤口诱导的转录记者们的阶段一十二月15 ^日至16日之间的最佳活动。通过后期17，胚胎是太老了，容易穿透角质层成熟而有效地激活伤口记者或检测伤口诱导的转录。要允许发生的集合时间和伤人时间在繁忙的实验室小时，我们按照胚胎收集的2小时（16:00-18:00）的时间表，在18:00交换新盘收集板，年龄收集板在25℃下14小时（过夜），和（第二天）伤口的胚胎在08:00。

2。胚胎的制备

注:此协议包括使用许多工具和对象是尖锐或作出克姑娘。处理所有的锐器，并小心玻璃物体，以免造成人身伤害。

1. 轻轻地加入2-3毫升水盘和旋转从一个画笔收集盘取出胚胎。从板块转移水和胚胎尼龙网和收集管。
2. 加4-5毫升的漂白剂在塑料陪替氏培养皿盘的盖和浸泡在含有漂白剂的胚胎，持续2分钟收集管的网状覆盖端;除去胚的外蛋壳。手动旋转收集管几次，以防止胚胎结块的漂白剂。胚胎冲洗用水10倍和干含在纸巾上的dechorionated胚胎网格覆盖的收集管。
3. 用解剖针转〜50胚从尼龙网到琼脂平板。我们增加了绿色食用色素的琼脂平板加对比度和援助胚胎对齐。在解剖显微镜下，使两排平行〜25的胚胎，对准安莉芳口上滑动，以便它们将是成直角的注射装置中的穿刺针。留下一点空间胚胎进行气体交换的目的之间（约1胚胎长度）。在两个平行的行应该是大约5毫米。
4. 将幻灯片与双节棍磁带上的排列胚胎的顶部，小心地按幻灯片从绿盘转移胚胎到幻灯片中。然后在空气中干燥的胚胎〜25分钟，以减少对胚胎的内部压力，并防止突发伤人时。
5. 将2-3滴卤烃油混合在胚胎，以防止进一步脱水。

3。胚胎伤人

1. 放置在注射显微镜阶段胚胎的幻灯片。发现胚胎在视场和练习移动倒置显微镜的阶段。
   注:在用针工作，专注于沿背腹轴的胚胎中面。允许的有效伤人对齐的胚胎，开始伤人的行靠近针头装置。移动载物台，使对准胚胎的行的顶部进入视场。
2. 小心地放置和固定拉针在针托。使用显微操纵器移动针朝上下滑动。对准胚针，在同一焦平面上。一旦针是关注的焦点与胚胎，不要移动与显微操作针。
3. 移动台通过，并通过穿刺胚胎，然后转移到该行中的下一个胚胎。完成后伤人的第一行，用显微操作来从舞台移动幻灯片之前完全移动针和远离;手动旋转滑盖180°和伤口的第二行。
4. 根据存储卤烃油的胚胎在室温下进行胚胎固定，如果做原位杂交或抗体染色（见程序步骤5）。另外，存储胚胎4-6小时在卤烃油进行伤口转录荧光报告的可视化（代表结果）。
   注意:对于荧光报告的可视化，我们麻醉用50％的1 -苯氧基-2 -丙醇¹³的胚胎。将胚胎从卤代烃油中取出并放在一个新的幻灯片。我们把玻璃珠周围的胚胎，加几滴麻醉，并放置在胚胎盖玻片。

4。胚胎显微注射

注:我们在协议中使用的注射装置不是自动的在试验过程中提供特定的音量。我们的染料添加到溶液中以可视化的显微注射，并尝试正常化递送的体积。如果太多的溶液注入胚胎，卵黄膜会破裂。

1. 负载针从背面用1微升的化学溶液加染料（ 例如 0.6 MH _{2 O 2）。}允许毛细管动作来绘制化学溶液注射针的尖端。
2. 为了打破一针，放置盖玻片在一个角度上一张幻灯片，然后涂上卤烃油混合的边缘。把针头装成焦点与角度的盖玻片的边缘，轻轻移动盖玻片边缘穿过针的尖端，直到破裂。施加压力的显微注射设备，并检查药液加染料流出针。
3. 将包含在显微镜舞台对齐胚胎的幻灯片。继续集中在同一平面内的胚胎和针。同时穿刺和化学微导液加染到每个胚胎。
   注:针头堵塞经常发生，闯出了一条新针，以避免不完整的显微注射。钝针尖不作为伤口清洁是一个倾斜的针尖。调整盖玻片到非90°角破损时是最佳的，以产生一个带角度的针尖。

5。甲醛网络xation

注:在此果蝇固定使用的化学品是有害的。处理化学品时使用个人防护装备（ 如手套，实验室外套，护目镜）。按照处置化学品监管个别机构的指导方针。

1. 伤人后，等待15，30，60，分钟或更长时间的伤口诱导的基因发生了转录激活。若要从幻灯片注射胚胎取出，小心地从滑梯沥干卤烃油混合，靠在机架的幻灯片，用Kimwipe擦拭吸干结束。
2. 使用玻璃移液管将清洗的庚烷在滑动和漂洗液洗入玻璃培养皿。庚烷将解散磁带和释放胚胎。继续漂洗，直到所有的胚从滑动取出。进入到下一张幻灯片，直到所有的胚胎从幻灯片中删除。
3. 转让从玻璃盘庚烷加胚液放入20 ml SCIntillation小瓶。摇动小瓶2-3分钟，取出庚烷，加入5毫升新鲜庚烷。
4. 加入5毫升新鲜的，固定的解决方案（见名单试剂配方）。盖上瓶盖，并连接到一个轨道摇床。摇含有胚胎在220-230转25分钟的小瓶。
5. 摇匀后，让气泡在界面上弹出。完全用吸管除去底部含水相，避免拉起胚胎。底层是由固定的解决方案，并应妥善处置。
6. 加甲醇5ml，盖上瓶盖，并用手用力摇动20-30秒，漩涡，并将其放置在板凳上。受伤的胚胎会留在间期，也不会沉到水底。
   注:固定后的未受伤的胚胎的卵黄膜在脱水步骤用甲醇将正常突发。然而，在一个受伤的胚胎的卵黄膜已经被打破，脱水步骤不会删除卵黄MEMBRANE。手devitellinzation必须完成固定的协议。
7. 小心地取下顶部庚烷层，然后加入5毫升新鲜甲醇。摇瓶和胚胎应该下沉。
8. 除去甲醇加胚胎溶液，用玻璃移液管和收集在玻璃培养皿的尼龙筛收集管。
9. 除去甲醇和冲洗用1×PBS溶液中的胚胎。
10. 从尼龙网胚胎转移到苹果汁板。传播胚胎沿所述​​板的表面上。
11. 胚胎转移到一个双面胶带搏命。覆盖用1×PBS中的胚胎。
    注:胚胎往往因为卵黄膜的结块。用苹果汁的地方允许成群胚胎的快速分离。胚胎必须从板中移除，并转移到一个两面胶带载玻片因为胚胎沉入琼脂平板上时，力被施加到从取出胚胎卵黄膜。
12. 小心地将胚胎用解剖针"啪"的卵黄膜。胚胎应该沉沦在PBS中。
13. 使用玻璃移液管的1×PBS中加胚胎转移到1.5ml管中。冲洗用1×PBS和存储的胚胎在4℃下继续进行脱水用乙醇胚胎:PBS系列，并继续与原位杂交或免疫定位协议^14。

Results

取得在该方法中所示的结果，绿色荧光蛋白（GFP）的开放阅读框融合至从多巴脱羧酶（DDC）和红色荧光蛋白融合到从酪氨酸羟化酶伤增强子序列（启动子/伤口诱导的增强子序列^PLE）4,6。在一个活果蝇胚胎中，荧光伤口报告蛋白的成熟过程是最优的4-6小时后伤人，这使得时间的足够的蛋白质的积累来可视化，以及作为时间的荧光蛋白氧化的荧光状态^15。观察记者本地化，化合物荧光显微镜是足够的。观察记者本地化的更高的放大倍率，在共聚焦显微镜下是最优的，生成的多个光纤段的最大凸起（ 图1）。共聚焦在果蝇胚胎的体内成像是由RA并发胚胎的PID起伏。 。可以用20X物镜来获得一个完整的视图胚胎，可以用40倍物镜获得伤口部位的特写视图。一顶视图，表皮的伤口记者本土化可以成像与10连续1μm光学部分。一种横向视图表皮伤口记者本土化可以成像与40连续1微米的光学部分。

使用标准遗传交叉方法中，有可能伤记者结合的基因突变。其中一个例子本文提出，是因为（以P元素插入产生无效等位基因）功能丧失和增益的功能- （无处不在的表达在所有细胞中产生的过表达）的突变体Flotillin-2（FLO-2）， FLO-2演示型Flo-2基因产物是必要的和足够的抑制DDC-GFP的定位卷绕记者^9（ 图2A和2B）。使用英里croinjection协议，它可以测试引入的化学溶液superactivates还是抑制伤口记者的本地化。化学伤员胚胎同时受伤和注射1:4的比例为1％甲苯胺蓝染料和增溶​​的化合物。甲苯胺蓝染料可用于增溶的化合物被注入到体腔内的视觉确认。控制胚胎受伤了断针含1:4的比例为1％甲苯胺蓝染色和溶质无化学。本文所提出的两个例子是过氧化氢 ​​（H _{2 O 2）}和甲基-β-环糊精（MβCD），因为这两种化学溶液是足够用来全局启动DDC-GFP的定位卷绕记者^9（ 图2C和2D） 。过氧化氢 ​​（H _{2 O 2）溶液}稀释于H _{2 O}至0.6米甲基-β-环糊精（MβCD）溶解于1米M氢氧化钠至3毫米。使用胚胎固定方案，它能够检测的卷绕响应基因的转录活化中的局部领域，围绕伤口部位。一个例子在本文提出的是在 RNA探针原位杂交检测DDC和辉成绩单^4,6,9（ 图3A和3B）。

图1。 DDC-GFP和PLE-DsRed的伤口记者本土化。明场和荧光图像中受伤的野生型胚胎（A） -顶视图DDC-GFP伤记者（B） -顶视图PLE-红色荧光蛋白创面记者。所有图像被收集在Leica SP2共聚焦显微镜，用20X物镜。箭头标示的网站伤口。在数据面板虚线S标记胚胎的轮廓。 点击这里查看大图 。

图2。 弗洛-2 {KG00210}突变体丧失功能的基因突变的背景和化学显微注射胚胎。明场和受伤Flotillin-2（FLO-2）突变胚胎的荧光图像的DDC-GFP的伤口记者本土化。（A）记者扩张活动在所有表皮细胞（B）获得性功能的Flo-2（犰狳-GAL4，UAS-FLO2）突变体，抑制报告基因活性的在所有表皮细胞（C）过氧化氢 ​​（H _{2 O 2}的氢）注射液，扩张的代表orter活动遍及所有的表皮细胞（D）甲基-β-环糊精（MβCD）溶液显微注射，扩张的报告基因活性的贯穿所有的表皮细胞。所有图像被收集在Leica SP2共聚焦显微镜，用20X物镜。箭头标示的网站伤口。在数据面板虚线标记胚胎的轮廓。 点击这里查看大图 。

图3。检测伤口反应基因的RNA转录本。 原位杂交和RNA检测在受伤的野生型胚胎荧光图像。DDC（A）和辉 （B）RNA转录积蓄在伤口部位。所有图片都是集电极特德在Leica SP2激光共聚焦显微镜，具有20X的目标。箭头标示的网站伤口。在数据面板虚线标记胚胎的轮廓。 点击这里查看大图 。

表1中。表皮伤口响应记者总结。四个伤口响应记者（DDC，PLE，MSN，KKV）的插入可在第二和第三染色体上两个。在周围穿刺损伤部位在野生型背景（ 如 "本地"型）表皮细胞的数量有限所有的伤口回应记者激活荧光基因（GFP或红色荧光蛋白）。DDC和MSN伤口回应记者要求对GRH激活fluorescen的穿刺损伤（ 如 "无"表现型）后，CE基因。所有伤口记者需要的Flo-2的穿刺伤害（ 如 "全球性"表现型）后的荧光基因的定位。 点击这里查看大图 。

Discussion

到外部线索立即转录调控响应允许细胞坐标的局部响应于细胞外刺激，其可以包括应力，损伤或感染。不当控制局部反应可能对相邻小区的破坏性影响，以及资源的浪费，以修复损伤。 果蝇胚胎提供了极好的系统，以在一个廉价的和易于维护的模型生物体进行基本的伤口愈合试验。在其他模式生物的研究和果蝇之间的合作潜力提供了一个独特的机会去探索许多生物学问题。

伤口记者的附加技术是突变体背景的基因组合，提供了用于测试的新的基因，以表皮伤口反应途径的活化的贡献的有效方法。我们有表皮伤口诱导的转录记者AVailable在2号^，3号染色体⁵两者。在这项研究中，我们使用无人机和表达¹⁶ GAL4系统。对于致死突变等位基因的研究，我们决定使用荧光平衡器染色体， 如Kruppel-GFP ¹⁷的遗传背景。我们已经分析了几种遗传背景（ 表1）伤口记者本土化。

该技术的一个可能的修改是结合显微注射和伤人。显微注射可以用来引入一个化学溶液注入胚胎。几种化学成分进 ​​行了测试，发现它们调节表皮伤口记者⁹的活性。同时伤人和显微注射的这个方法可以是有用的，以增加细胞在果蝇胚胎进行了回复伤信号，可直接用于监测基因表达的变化伤人¹⁸后的数。显微注射技术的应用前景将是测试新的化学品的表皮创伤反应的调节。

果蝇作为遗传学研究的模式系统提供了多种简单的协议，有效地解决复杂的问题。对果蝇技术的可行性最近的报告强调了使用血细胞迁移¹⁹和寄生蜂感染²⁰为手段，以进一步拓宽果蝇研究界的影响。除了 ​​创伤修复的研究， 果蝇提供了一个经典模型进行再生与成虫盘系统^21,22。在成虫盘再生的研究和穿刺/注射伤人合并的进展提供了一个很好的系统来发现组织修复以及保守的成分。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
酵母	Sigma Aldrich	51475
苹果汁	通用
琼脂	Fisher Scientific	50-824-297
漂白	通用
卤烃油，700 W	Sigma Aldrich	H8898
卤烃油，27 W	Sigma Aldrich	H8773
1-苯氧基-2-丙醇	Sigma Aldrich	484423
过氧化氢	Fisher Scientific	H324
甲基-β;-环糊精	Sigma Aldrich	C4555
甲苯胺蓝	Sigma Aldrich	89640
甲醛，16%	Polysciences， Inc	18814-20	有毒化学物质
庚烷	Fisher科学	H360-1	有毒化学品
甲醇	Fisher Scientific	A412-1	有毒化学品
10x PBS	Fisher Scientific	50-899-90013
0.5 M EGTA	Fisher Scientific	50-255-956
无 RNase H2O	Fisher Scientific	BP2819-100
果蝇 孵化器	Genessee Scientific	59-197
苍蝇笼	Genessee Scientific	59-100
胚胎收集管	Genessee Scientific	46-101
塑料培养皿	Fisher Scientific	50-202-037
双面胶带	通用
画笔	Generic
解剖针	Fisher Scientific	08-965A	尖锐物体
玻璃盖玻片	Thermo Scientific	3306	尖锐物体
显微镜载玻片	Scientific	4445	尖锐物体
解剖显微镜	蔡司	Stemi-2000
毛细管针	FHC	30-30-1	尖锐物体
拔针器	Narishige	PC10
显微注射针架	Narishige	MINJ4
显微作器	Narishige	MN151
倒置显微镜	Carl Zeiss	Primo-Vert
玻璃培养皿	Fisher Scientific	08-747A	尖锐物体
玻璃巴斯德移液器	FisherScientific	22-063-172	尖锐物体
转移灯泡	Fisher Scientific	03-448-25
Kimwipe	Fisher Scientific	06-666A
闪烁瓶	Fisher Scientific	03-337-7	尖锐物体
轨道摇床	Fisher Scientific	14-259-260
1.5 ml 管	Fisher Scientific	05-408-129
激光扫描共聚焦	徕卡	SP2
固定液	（5 ml）
16% 甲醛	2.5 ml		有毒化学物质
10x PBS	0.5 ml 0.5 ml
0.5 M EGTA	0.5 ml
RNase 不含 H2O	1.5 ml
卤烃油混合物	（10 ml）
卤烃油，700 W	5 ml
卤烃油，27 W	5 ml