采用改良套管技术的小鼠颈部心脏移植模型

摘要

小鼠颈部心脏移植模型非常适合用于免疫学以及缺血再灌注损伤的研究。我们采用了一种无缝线套管技术对该手术方法进行了改良，并利用该技术成功完成了1000多例移植手术。

本文提供了该技术的更多细节，以补充视频内容。

摘要

小鼠模型在研究中具有特殊意义，因为可获得大量单克隆抗体以及商业化的近交系和基因敲除品系，可用于开展机制性的体内研究。尽管采用缝合技术的心脏移植模型最早在大鼠中成功建立，但由于显微外科手术的技术复杂性，该方法始终未能成功转化为在小鼠中广泛应用的等效模型。相比之下，最初也在大鼠中开发的无缝合套管技术，已成功被改进并应用于小鼠^1-3。该再血管化技术主要包括两个关键步骤：I）将受体血管外翻套入聚乙烯套管上；II）将供体血管套入已外翻的受体血管，并用环形结扎固定。该方法可确保血管内皮层的连续性，手术时间短，并具有极高的通畅率⁴。

采用这种血管吻合技术，我们完成了超过1,000例颈部心脏移植，总体成功率达到95%。动脉供血通过吻合颈总动脉与近端主动脉弓实现，使移植心脏获得逆行灌注。静脉引流则通过将移植物的肺动脉与受体的颈外静脉进行吻合完成⁵。

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引言

心脏移植是治疗各种终末期心脏病患者的首选疗法。随着外科技术的进步、感染预防措施的更加有效以及新型免疫抑制方案的应用，器官移植的预后已显著改善⁶。然而，近年来移植物的长期存活率并未得到显著提高⁷。以移植性动脉硬化为特征的慢性排斥反应仍是影响移植物长期存活的主要障碍^8-11。

小鼠异位心脏移植模型为研究急性及慢性排斥反应过程中的免疫学机制提供了重要且有效的工具^12-15。

迄今为止，最常见的移植模型仍是采用缝合技术的腹部小鼠心脏移植。供体心脏的升主动脉与受体的腹主动脉吻合，肺动脉与受体的下腔静脉吻合。缝合模型的许多显微外科操作难点源于血管尺寸较小，需进行缝合^16,17。

与缝合模型不同，心脏被放置在受体的颈部区域，其中外部颈静脉与肺动脉吻合，而供体的颈总动脉与主动脉吻合。

采用套管技术建立颈部心脏移植模型的原理在于构建一种动物模型，该模型仅需基本的显微外科技能即可实现较高的手术成功率，从而有利于该模型的广泛应用。与缝合模型相比，该方法的主要优势在于吻合相关并发症（如出血和血栓形成）的发生率显著降低¹⁸。

方案

动物饲养在无特定病原体的屏障设施中。所有动物的护理均符合国家医学研究协会制定的《实验室动物护理原则》以及国家科学院编写的、美国国立卫生研究院出版的《实验室动物护理与使用指南》（NIH出版物编号86-23，1985年修订版）。所有实验均获得奥地利教育、科学和文化部的批准。

1. 受体准备

1. 通过肌肉注射给予受体动物赛拉嗪（5 mg/kg 体重）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）进行麻醉。
2. 去除动物颈部外侧的所有毛发，并使用氯己定对术区进行三次擦拭消毒。
3. 将小鼠仰卧位放置于手术区域。
4. 接着，从颈静脉切口至右侧下颌角做一皮肤切口。
5. 随后，钝性分离右侧颈外静脉（EJV），并在结扎线之间切断其分支。
6. 然后在结扎线之间切断颈外静脉，注意保留足够长度，以便将近端残端外翻套入套管主体上。
7. 接下来切除右侧下颌下腺叶。
8. 进行静脉吻合时，将颈外静脉近端穿过聚乙烯套管，用微型夹子将其固定在套管手柄上。
9. 移除血管末端的结扎线，将管腔外翻覆盖在套管上，并用8-0丝线环固定（图1a）。
10. 随后使用双极电凝切断右侧胸锁乳突肌，以暴露颈总动脉。
11. 接下来游离颈总动脉，并在两结扎线之间切断血管。
12. 接下来游离颈总动脉，并在两结扎线之间切断血管。
13. 将血管远端穿过套管，并用动脉夹固定。
14. 移除血管末端的结扎线，使用血管扩张器扩张管腔。接着，参照颈外静脉的操作，将动脉外翻覆盖在套管上，并用8-0丝线环固定。

2. 心脏获取

1. 通过肌肉注射赛拉嗪（5 mg/kg 体重）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）对供体小鼠进行麻醉。随后去除动物腹部区域的所有毛发。使用氯己定对术区进行三次擦拭消毒。然后将小鼠仰卧位放置于手术区域，操作如前所述。
2. 沿腹部正中线做切口，用棉签将内脏向左牵拉，以暴露下腔静脉（IVC）。
3. 向下腔静脉（IVC）注射 400 μl 的 1:4 肝素-生理盐水溶液，以实现肝素化。
4. 行胸骨切开术，将前胸壁向上翻折，以暴露心脏。
5. 随后，移除胸腺，并在左、右上腔静脉处做排气切口。
6. 接着，通过在头臂干水平处以 27 G 针头插管主动脉弓，逆行灌注 4° Celsius HTK 溶液。
7. 使用 8-0 丝线结扎下腔静脉和上腔静脉，并在结扎线远端将其切断。
8. 随后，在先前插管水平处切断主动脉弓，并游离肺动脉干，尽可能向远端切断。
9. 之后，用粗线结扎肺静脉，并在结扎线远端将其切断。
10. 最后，将心脏从供体部位取出，并保存于 4° Celsius HTK 溶液中（图 1b）。

3. 植入

1. 将心脏移植物以倒置位置置于受体颈部区域（图1c）。
2. 接着将心脏的肺动脉干拉过受体的静脉套管结构，并用丝线环固定（图1d）。
3. 以相同方式完成移植物主动脉与受体动物外翻动脉之间的吻合（图1e）。
4. 随后先移除静脉夹，再移除动脉夹。心脏在1–2分钟内恢复灌注并开始搏动。再灌注期间，用温热（35°C）的生理盐水湿润心脏。
5. 最后用6-0连续缝线关闭手术切口（图1e）。

4. 术后护理、终点

1. 术后可给予最多 0.3 ml 生理盐水腹腔注射，以补充液体。
2. 将动物置于加热灯下，直至从麻醉中苏醒。
3. 苏醒后，将动物送回饲养设施，并可自由摄取食物和水。
4. 为减轻术后前 7 天内的疼痛，给予卡洛芬（4 mg/kg，每 12 小时一次，皮下注射）。此外，术后立即给予布托啡诺（0.1 mg/kg），每 12 小时一次，持续 5 天。
5. 每周测量每只受体动物的体重（g），以评估营养摄入是否充足。若发现体重较手术当日下降超过 10–15%，或出现精神萎靡、行动障碍或严重弓背等表现，应在达到临床终点前采用终末剂量异氟烷吸入法处死动物。心脏发生排斥后也应立即处死动物。

结果

图2显示了BALB/c供体心脏移植物在完全MHC不匹配的C57BL/6受体中移植后的代表性存活数据。移植物在移植后第7 ± 1天被排斥。对移植的同种异体移植物进行指腹触诊是一种灵敏的方法，可用于检测移植物排斥反应随时间变化的过程。本系列实验中所有同系心移植均长期存活（>150天）。

图1：术中图像。（a） 受体准备期间的手术区域。（b） 获取后的心脏移植物。（c） 将心脏移植物倒置于受体颈部区域。（d+e） 植入前的供...

讨论

血管化异体移植物的排斥反应涉及多种不同步骤，仅通过以下方法评估时存在明显不足 体外 模型。受体致敏、次级淋巴器官中的抗原加工，以及免疫活性细胞的分化与增殖等现象得到了更深入的表征 体内因此，动物模型是转化研究的理想工具¹⁶小鼠模型在基础移植和免疫学研究中仍被视为金标准，因为目前已有大量转基因和基因敲除小鼠品系可供使用，且大量免疫学和诊断工具是专门为小鼠开发的。¹⁸小鼠颈部心脏移植模型为研究缺血再灌注损伤、免疫抑制、急性和慢性排斥反应以及耐受诱导等相关问题和开展机制研究提供了独特的工具^{1-3, 17, 22}.

1973年，Corry 等首次描述了采用缝合技术的小鼠腹部心脏移植模型¹⁹。然而，由于小血管缝合吻合的技术难度较高，限制了该模型的广泛应用。

1991年，Matsuura et al. 在小鼠中引入了使用无缝合套管技术的颈部心脏移植模型¹⁶。自...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Yasargil 7毫米微型永久性动脉瘤夹	Aesculap	FE720K
微型血管夹	S & T	B1 00396 V
显微剪刀	FST	14075-11
血管扩张器	S & T	D-5a.2 00125
显微镊	FST	Dumont 11271- 30
动脉瘤夹夹持器	S & T	CAF-4 00072
微型血管夹	S & T	B1 00396 V