抗癌金属配合物：合成及通过 MTT 法评估细胞毒性

摘要

本文描述了一种合成对空气敏感的钛和钒类抗癌药物的方法，并通过MTT法评估了这些药物对人癌细胞系的细胞毒性活性。

摘要

钛(IV)和钒(V)配合物是高效的抗癌药物。这类配合物的合成面临的一个挑战是其易发生水解而不稳定，因此其制备必须在惰性气氛下进行。可通过MTT法评估这些配合物的抗癌活性。

MTT 检测是一种比色法活力检测，其原理是当 MTT 分子接触活细胞时，经酶促反应被还原为甲臜。该还原反应导致 MTT 分子发生颜色变化。通过测定相对于对照组的吸光度，可确定用不同浓度待测化合物处理后残留的活癌细胞百分比，从而反映该化合物的抗癌活性及其 IC₅₀ 值。由于具有准确性高、操作快速且相对简便的优点，MTT 检测在细胞毒性研究中被广泛应用。

本文介绍了一种详细的方案，用于合成对空气敏感的金属基药物并进行细胞活力检测，包括细胞培养板的制备、化合物与细胞的孵育、采用MTT法检测细胞活力，以及IC₅₀值的确定。

引言

化疗目前仍是临床上治疗多种癌症疾病的主要手段之一，因此全球开展了大量研究，旨在开发新型且更有效的抗癌药物。此类研究大多始于化学层面，即化合物的设计与合成，随后对其进行细胞毒性的生物学评价 体外细胞活力可通过多种检测方法进行评估，这些方法可提供有关细胞活性的信息^1-2.

顺铂是一种铂类配合物，被广泛用作化疗药物，主要用于治疗睾丸癌和卵巢癌，被认为是一种高效的治疗手段^3-4。然而，由于其作用范围较窄且具有严重的副作用，促使研究人员开展对其他高效过渡金属配合物的研究^5-8。其中，钛(IV)和钒(V)配合物表现出较高的活性和较低的毒性，结果令人期待^9-16。由于这些特性，钛(IV)配合物成为继顺铂之后首个进入临床试验的金属配合物；然而，由于制剂困难和水解不稳定性，其临床试验未能成功。因此，目前亟需开发出具有高抗癌活性且耐水性良好的新型金属配合物衍生物^15,17-21。

制备 Ti(IV) 和 V(V) 配合物的一个难点在于前体试剂的水解不稳定性；因此，必须维持惰性气氛。Ti(IV) 和 V(V) 化合物的制备需在手套箱中或通过施伦克线技术，在 N₂ 或 Ar 气氛条件下进行。

评估抗癌活性的常用方法之一是基于MTT（3-(4,5-二甲基噻唑基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐）法。该方法是一种比色法细胞活力检测，由Mosmann于1983年首次提出²²。该方法已被广泛研究和表征，在评估新型细胞毒性化合物的有效性时被认为具有高度效率，因其具备精确性高、操作快速以及适用于多种细胞系的优点。该细胞活力检测的原理是MTT分子在接触活细胞时发生颜色变化。通过测定吸光度（其值与活细胞数量成正比），并与未经处理的对照组进行比较，可评估待测化合物对细胞增殖的抑制能力。

MTT比色法以96孔板形式进行²³。 在加入待测药物前，细胞可能需要在孔板中预先孵育。预孵育时间根据细胞系特性可从0至24小时不等。通常根据药物活性，细胞暴露于药物的时间为24至96小时。随后将MTT溶液加入处理后的细胞中，在活细胞内多种线粒体和胞质酶的作用下，黄色的MTT被还原为紫色的甲臜（图1）²⁴。死亡细胞或红细胞（代谢失活细胞）、脾细胞（静息细胞）以及刀豆蛋白A刺激的淋巴细胞（活化细胞）均不能还原MTT分子²²。与MTT共同孵育3至4小时后，甲臜形成沉淀。甲臜的生成在孵育0.5小时后即开始，但为获得最佳结果，建议细胞与MTT孵育至少3小时²²。随后移除培养基，并用有机溶剂溶解甲臜，首选异丙醇²⁵，尽管也可使用DMSO²⁶。彻底去除培养基对获得准确结果至关重要，因为培养基中广泛存在的酚红以及沉淀的蛋白质可能干扰吸光度测定²⁵。当甲臜溶液达到均匀状态后，使用酶标仪分光光度计测定其吸光度。在每孔200至50,000个细胞范围内，550 nm处的吸光度与细胞数量成正比，因此可检测极少量的细胞²²。该吸光度值反映药物处理后存活细胞的数量，并与未接受药物处理的对照组细胞吸光度进行比较。通过适当的软件分析结果，可获得IC₅₀（抑制浓度；50%）值及其基于多次重复测量的统计误差。

MTT 法因其准确性和相对简便性，被广泛用于细胞毒性研究中筛选新的抗癌化合物。然而，在使用依赖于酶促反应的 MTT 法时，必须考虑到各种酶抑制剂可能影响 MTT 的还原过程，从而导致假阳性或假阴性结果²⁷。此外，MTT 法无法提供有关药物细胞毒性作用分子机制的任何信息²。

方案

1. 五价钒配合物的制备（图2）；¹⁸ 步骤1.1–1.4需在手套箱中进行；若无手套箱，可跳至替代步骤2（2.1–2.6）。
   1. 将0.42 mmol配体H₂L溶于干燥的四氢呋喃（THF）中，并加入至含有等摩尔量VO(OiPr)₃的THF搅拌溶液中。
   2. 室温下搅拌反应混合物15分钟，随后在真空下除去挥发性物质。
   3. 加入冷己烷，再在真空下除去。应定量获得深紫色粉末。
   4. 在Eppendorf管中称取8 mg所得化合物。跳至步骤3。
2. 使用施兰克线（Schlenk line）制备五价钒配合物。
   1. 在干燥的带隔垫塞的施兰克烧瓶中，将0.42 mmol配体H₂L溶于干燥THF，连接至施兰克线，交替施加真空/惰性气体（N₂或Ar）环境；建议重复此过程三次，并在每次抽真空阶段保持2–5分钟。
   2. 通过隔垫用注射器加入干燥THF。
   3. 加入等摩尔量的VO(OiPr)₃的THF溶液，该溶液需预先在另一干燥施兰克烧瓶中制备：将烧瓶接入施兰克线，建立惰性气氛 ，再用注射器将钒溶液转移至配体溶液中。
   4. 室温下搅拌反应混合物15分钟 ，随后在真空下除去挥发性物质；若产物不稳定，可在惰性气氛下进行施兰克式蒸馏；使用惰性气体气流连接已预先干燥的玻璃仪器。
   5. 加入冷己烷，再在真空下除去。应定量获得深紫色粉末。
   6. 在Eppendorf管中称取8 mg所得化合物。
3. 四价钛配合物的制备（图2）；²⁸ 步骤3.1–3.3需在手套箱中进行；若无手套箱，可参照使用施兰克线的钒类似物替代步骤（步骤 2）进行调整。
   1. 将0.35 mmol配体H₂L溶于干燥THF中，并加入至含有等摩尔量Ti(OiPr)₄的THF搅拌溶液中。
   2. 室温下搅拌反应混合物2小时。在真空下除去挥发性物质，得到黄色产物，收率为定量。
   3. 在Eppendorf管中称取8 mg所得化合物。
4. HT-29细胞96孔板的制备
   1. 在75 cm²培养瓶中，使用含1%青霉素/链霉素抗生素、1% L-谷氨酰胺和10%胎牛血清（FBS）的RPMI-1640培养基，在37 °C、5% CO₂条件下培养HT-29细胞。
   2. 当HT-29细胞达到最大汇合度（90–100%，每3–4天未传代）时，弃去培养基。用1 ml胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.05%）溶液洗涤并弃去。
   3. 加入1 ml胰蛋白酶（0.25%）/EDTA（0.05%）溶液，孵育5分钟。
   4. 使HT-29细胞从培养瓶脱落，加入10 ml培养基以终止胰蛋白酶活性。将5 ml细胞悬液转移至离心管中。
   5. 用移液器吸取少量细胞悬液滴入计数室。计数室包含5 × 5个方格。
   6. 使用显微镜计数5个代表性方格中的细胞数：四个角的方格和中央的一个方格。
   7. 估算细胞总数。将5个代表性方格中的细胞数相加后除以20。
   8. 用0.6除以步骤4.7的结果。所得数值即为每块板所需的细胞悬液量。该计算对应于每板含0.6 × 10⁶个细胞（每孔9,000个细胞）的情况。
   9. 用移液器吸取每板所需的细胞悬液量（按步骤4.8计算），并加入13.2 ml培养基（每孔200 μl × 66孔）。
   10. 使用11通道移液器将混合液加入96孔板（每孔200 μl，共6行，总计66孔）。每行应留出一孔作为空白对照。
   11. 将板在37 °C、5% CO₂条件下孵育24小时，使细胞贴壁。
5. 化合物的加入
   1. 向按步骤1.4（或2.6）或3.3称取的每种化合物8 mg中加入200 μl（或根据所需浓度范围调整体积）干燥THF。同样称取8 mg配体H₂L。
   2. 将每种化合物溶液进一步稀释：在9个不同的Eppendorf管中各加入60 μl THF。
   3. 用移液器从步骤5.1的母液中吸取60 μl加入第一个Eppendorf管，重悬后转移60 μl至下一管，依此类推，直至获得10个不同浓度（包括步骤5.1中的原始母液）。
   4. 将每种THF稀释液20 μl与180 μl培养基混合。
   5. 制备仅含THF的对照溶液：每次测量中，将20 μl THF与180 μl培养基混合。
   6. 向已含有200 μl上述细胞培养液的每孔中加入10 μl所得溶液（包括THF对照），使化合物终浓度最高达200 mg/L（可根据化合物活性调整浓度范围）。
   7. 根据化合物溶解度，最高浓度下可能出现少量沉淀。
   8. 每种化合物的测量重复3次（同一化合物在板上占3行）；每行包含：10个不同浓度的化合物处理孔、1个仅含溶剂处理细胞的对照孔和1个无细胞的空白对照孔。
   9. 将加样后的板在37 °C、5% CO₂气氛下孵育3天。
6. 使用MTT法测定细胞毒性
   1. 将1 g MTT粉末加入200 ml不含酚红的RPMI-1640培养基中，配制MTT溶液。储备液可分装至15 ml离心管中，于-20 °C保存。
   2. 使用11通道移液器向每孔加入20 μl MTT溶液（步骤4.10中无细胞的空白对照孔除外），再孵育3小时。
   3. 弃去每孔中的培养基溶液。
   4. 向每孔加入200 μl异丙醇以溶解甲臜。振荡0.5小时，直至溶液均匀。
   5. 使用酶标仪分光光度计测定上述溶液200 μl在550 nm处的吸光度。
   6. 在不同日期重复每项测量（每项包含3次重复，见步骤5.8），共进行3天。
   7. 通过从测定值中减去空白对照吸光度，再除以THF溶剂对照的吸光度，乘以100%，计算细胞存活率百分比。
   8. 使用GraphPad Prism软件（或等效软件）计算IC₅₀值。
   9. 报告的IC₅₀值为至少三个不同实验日所得IC₅₀值的平均值，误差值为标准差。

结果

复合物的制备基于已建立的方法^18,28，其纯度可通过核磁共振（NMR）和元素分析进行评估。

通过MTT实验获得的数据用于评估化合物的细胞毒性^18,21。首先，从所有其他数值中减去空白对照组的吸光度值。其次，将THF溶剂对照组的值设为100%存活率，因为未添加任何抑制细胞生长的化合物。其余各组数值均根据该对照组换算为相对存活率百分比。然后将所用浓度及计算得到的相对存活率百分比输入GraphPad Prism软件（或同类软件），采用可变斜率非线性回归模型（四参数）计算IC₅₀值（图4，表1）²⁹。

应在一系列浓度范围内进行测量，以生成具有均匀数据点分布的曲线图：每个平台区至少包含三个数据点，斜率区也至少包含三个数据点（图3，图A）。若在高浓度或低浓度范围内的测量点不足（图3，图B），将影响用于确定IC_...

讨论

本文所述方法结合了化学合成与生物细胞活力检测。在涉及活细胞的生物学实验中，必须在层流罩内操作并保持无菌条件，包括使用无菌有机溶剂。此外，对于水解不稳定的金属基药物，其制备与储存应在惰性气氛下进行，可采用手套箱或施兰克线（Schlenk line）技术。

在惰性气氛下进行实验时，技术方法的选择主要取决于是否具备手套箱。如果具备手套箱，则所有在室温条件下进行的合成反应均可非常方便地在其中完成。需要加热的合成反应通常在手套箱外进行，将反应体系转移至舒伦克瓶（Schlenk flask）中，并连接至舒伦克线（Schlenk line）。若无手套箱，所有操作也可通过精心选择的玻璃仪器在舒伦克线上完成，同时利用真空/惰性气体（N₂ 或 Ar）操作来维持干燥的气氛环境。

在细胞毒性评估过程中，需要在整个实验期间观察细胞的形态。实验开始前，健康贴壁细胞的培养基应保持澄清，污染的培养物会呈现浑浊状态。此外，在细胞与胰蛋白酶-EDTA孵育后，细胞应从培养瓶上脱落并悬浮于培养基中。如果大部分细胞仍贴附在培养瓶上，则应将培养瓶再...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/材料
胎牛血清（FBS）	Biological Industries	04-007-1A
分析纯正己烷	Gadot	830122313	使用溶剂干燥系统干燥
HT-29 细胞系	ATCC	HTB-38
分析纯异丙醇	Gadot	830111370
L-谷氨酰胺	Biological Industries	03-020-1B
MTT	Sigma-Aldrich	M5655-1G
青霉素/链霉素抗生素	Biological Industries	03-031-1B
含酚红和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基	Sigma-Aldrich	R8758
不含酚红的RPMI培养基	Biological Industries	01-103-1A
分析纯四氢呋喃（THF）	Gadot	830156391	使用溶剂干燥系统干燥
Ti(OiPr)4	Sigma-Aldrich	205273-500ML	对湿气敏感
胰蛋白酶/EDTA	Biological Industries	03-052-1B
VO(OiPr)3	Sigma-Aldrich	404926-10G	对湿气敏感
仪器设备
12通道移液器 30–300 μl	Thermo Scientific
12通道移液器 5–50 μl	Finnpipette
75 cm2 培养瓶	NUNC	156472
96孔板（平底，带盖）	NUNC	167008
CO2 培养箱	Binder	APT.line C150
计数室	Marienfeld-Superior	650030
Eppendorf 管	KARTELL
手套箱	M. Braun
超净工作台	ADS LAMINAIRE	OPTIMALE 12
酶标仪分光光度计	Bio-Tek	El-800
显微镜	Nikon	Eclipse TS100
移液器 20–200 μl	Finnpipette
移液器 5–50 μl	Finnpipette