方法文章

抗癌金属配合物:合成及通过 MTT 法评估细胞毒性

DOI:

10.3791/50767

2013年11月10日

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

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本文描述了一种合成对空气敏感的钛和钒类抗癌药物的方法,并通过MTT法评估了这些药物对人癌细胞系的细胞毒性活性。

摘要

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钛(IV)和钒(V)配合物是高效的抗癌药物。这类配合物的合成面临的一个挑战是其易发生水解而不稳定,因此其制备必须在惰性气氛下进行。可通过MTT法评估这些配合物的抗癌活性。

MTT 检测是一种比色法活力检测,其原理是当 MTT 分子接触活细胞时,经酶促反应被还原为甲臜。该还原反应导致 MTT 分子发生颜色变化。通过测定相对于对照组的吸光度,可确定用不同浓度待测化合物处理后残留的活癌细胞百分比,从而反映该化合物的抗癌活性及其 IC50 值。由于具有准确性高、操作快速且相对简便的优点,MTT 检测在细胞毒性研究中被广泛应用。

本文介绍了一种详细的方案,用于合成对空气敏感的金属基药物并进行细胞活力检测,包括细胞培养板的制备、化合物与细胞的孵育、采用MTT法检测细胞活力,以及IC50值的确定。

引言

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化疗目前仍是临床上治疗多种癌症疾病的主要手段之一,因此全球开展了大量研究,旨在开发新型且更有效的抗癌药物。此类研究大多始于化学层面,即化合物的设计与合成,随后对其进行细胞毒性的生物学评价 体外细胞活力可通过多种检测方法进行评估,这些方法可提供有关细胞活性的信息1-2.

顺铂是一种铂类配合物,被广泛用作化疗药物,主要用于治疗睾丸癌和卵巢癌,被认为是一种高效的治疗手段3-4。然而,由于其作用范围较窄且具有严重的副作用,促使研究人员开展对其他高效过渡金属配合物的研究5-8。其中,钛(IV)和钒(V)配合物表现出较高的活性和较低的毒性,结果令人期待9-16。由于这些特性,钛(IV)配合物成为继顺铂之后首个进入临床试验的金属配合物;然而,由于制剂困难和水解不稳定性,其临床试验未能成功。因此,目前亟需开发出具有高抗癌活性且耐水性良好的新型金属配合物衍生物15,17-21

制备 Ti(IV) 和 V(V) 配合物的一个难点在于前体试剂的水解不稳定性;因此,必须维持惰性气氛。Ti(IV) 和 V(V) 化合物的制备需在手套箱中或通过施伦克线技术,在 N2 或 Ar 气氛条件下进行。

评估抗癌活性的常用方法之一是基于MTT(3-(4,....

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方案

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  1. 五价钒配合物的制备(图2);18 步骤1.1–1.4需在手套箱中进行;若无手套箱,可跳至替代步骤2(2.1–2.6)。
    1. 将0.42 mmol配体H2L溶于干燥的四氢呋喃(THF)中,并加入至含有等摩尔量VO(OiPr)3的THF搅拌溶液中。
    2. 室温下搅拌反应混合物15分钟,随后在真空下除去挥发性物质。
    3. 加入冷己烷,再在真空下除去。应定量获得深紫色粉末。
    4. 在Eppendorf管中称取8 mg所得化合物。跳至步骤3。
  2. 使用施兰克线(Schlenk line)制备五价钒配合物。
    1. 在干燥的带隔垫塞的施兰克烧瓶中,将0.42 mmol配体H2L溶于干燥THF,连接至施兰克线,交替施加真空/惰性气体(N2或Ar)环境;建议重复此过程三次,并在每次抽真空阶段保持2–5分钟。
    2. 通过隔垫用注射器加入干燥THF。
    3. 加入等摩尔量的VO(OiPr)3的THF溶液,该溶液需预先在另一干燥施兰克烧瓶中制备:将烧瓶接入施兰克线,建立惰性气氛 ,再用注射器将钒溶液转移至配体溶液中。
    4. 室温下搅拌反应混合物15分钟 ,随后在真空下除去挥发性物质;若产物不....

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结果

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复合物的制备基于已建立的方法18,28,其纯度可通过核磁共振(NMR)和元素分析进行评估。

通过MTT实验获得的数据用于评估化合物的细胞毒性18,21。首先,从所有其他吸光度值中减去空白对照组的吸光度值。其次,将四氢呋喃(THF)溶剂对照组的细胞活力设为100%,因为该组未添加任何抑制细胞生长的化合物。其余各组的数值均根据该对照组转换为相对细胞活力百分比。然后将所用浓度及计算得到的相对细胞活力百分比输入GraphPad Prism软件(或同等软件),采用可变斜率非线性回归四参数模型计算IC50值(图4表129

应在一系列浓度范围内进行测量,以生成具有均匀数据点分布的曲线图:每个平台区至少包含三个数据点,斜率部分也至少包含三个数据点(图3,图A)。若在高浓度或低浓度范围内的测量点不足(图3,图B),将影.......

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讨论

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本文所述方法结合了化学合成与生物细胞活力检测。在涉及活细胞的生物学实验中,必须在层流罩内操作并保持无菌条件,包括使用无菌有机溶剂。此外,对于水解不稳定的金属基药物,其制备与储存应在惰性气氛下进行,可采用手套箱或施兰克线(Schlenk line)技术。

在惰性气氛下进行实验时,技术方法的选择主要取决于是否具备手套箱。如果具备手套箱,则所有在室温条件下进行的合成反应均可非常方便地在其中完成。需要加热的合成反应通常在手套箱外进行,将反应体系转移至舒伦克瓶(Schlenk flask)中,并连接至舒伦克线(Schlenk line)。若无手套箱,所有操作也可通过精心选择的玻璃仪器在舒伦克线上完成,同时利用真空/惰性气体(N2 或 Ar)操作来维持干燥的气氛环境。

在细胞毒性评估过程中,需要在整个实验期间观察细胞的形态。实验开始前,健康贴壁细胞的培养基应保持澄清,污染的培养物会呈现浑浊状态。此外,在细胞与胰蛋白酶-EDTA孵育后,细胞应从培养瓶上脱落并悬浮于培养基中。如果大部分细胞仍贴附在培养瓶上,则应将培养瓶再.......

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披露

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作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

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资金由欧洲研究理事会根据欧洲共同体第七个框架计划(FP7/2007-2013)/ 欧洲研究理事会资助协议编号 [239603] 提供

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂/材料
胎牛血清(FBS)Biological Industries04-007-1A
分析纯正己烷Gadot830122313使用溶剂干燥系统干燥
HT-29 细胞系ATCCHTB-38
分析纯异丙醇Gadot830111370
L-谷氨酰胺Biological Industries03-020-1B
MTTSigma-AldrichM5655-1G
青霉素/链霉素抗生素Biological Industries03-031-1B
含酚红和L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基Sigma-AldrichR8758
不含酚红的RPMI培养基Biological Industries01-103-1A
分析纯四氢呋喃(THF)Gadot830156391使用溶剂干燥系统干燥
Ti(OiPr)4Sigma-Aldrich205273-500ML对湿气敏感
胰蛋白酶/EDTABiological Industries03-052-1B
VO(OiPr)3Sigma-Aldrich404926-10G对湿气敏感
仪器设备
12通道移液器 30–300 μlThermo Scientific
12通道移液器 5–50 μlFinnpipette
75 cm2 培养瓶NUNC156472
96孔板(平底,带盖)NUNC167008
CO2 培养箱BinderAPT.line C150
计数室Marienfeld-Superior650030
Eppendorf 管KARTELL
手套箱M. Braun
超净工作台ADS LAMINAIREOPTIMALE 12
酶标仪分光光度计Bio-TekEl-800
显微镜NikonEclipse TS100
移液器 20–200 μlFinnpipette
移液器 5–50 μlFinnpipette

参考文献

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$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. Update on in vitro cytotoxicity assays for drug development. Expert Opinion on Drug Discovery. 3, 655-669 (2008).
  2. Hatok, J., et al. In vitro assays for the evaluation of drug resistance in tumor ce....

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