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一种将高传递率附加体阵列快速整合到 C. elegans 基因组的实验方案

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DOI：

10.3791/50773

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2013年12月9日

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1Université Claude Bernard Lyon, 2Centre de Génétique et de Physiologie Moléculaires et Cellulaires, CNRS UMR 5534

本文内容

摘要

本方案描述了一种利用紫外线（UV）照射将转基因染色体外阵列整合到Caenorhabditis elegans基因组中的快速且耗材少的方法。此外，该方案特别适用于能够以较高速率传递染色体外阵列的转基因品系。

摘要

将DNA显微注射到Caenorhabditis elegans合胞体性腺的细胞质中，是建立转基因品系的主要技术，这类品系对染色体外阵列的遗传具有部分性和可变性的传递率。此外，转基因动物为嵌合体，且在数量可变的细胞中表达转基因。通过使用紫外线（UV）照射，可将染色体外阵列整合进C. elegans基因组，从而建立非嵌合的转基因品系，实现转基因100%的遗传传递率。为此，需对经UV照射的转基因动物的F1后代进行筛选，以获得携带转基因杂合整合的个体，这类个体可将转基因以约75%的孟德尔遗传比例传递给F2代。该方法的一个挑战在于，需区分在整合前（X%转基因个体）和整合后（≥75%转基因F2个体）群体中转基因的传递比例。因此，该方法要求选择在未整合状态下转基因个体比例显著低于75%孟德尔分离比的转基因品系。通常，优先选用染色体外阵列向后代传递率≤60%的未整合转基因品系进行整合，而高传递率品系的转基因整合较为困难。本文表明，当使用高传递率的转基因品系（≥80%）时，染色体外阵列整合进基因组的效率得以提高。本方案描述的方法便于在对高传递率染色体外阵列的转基因线虫进行UV照射后，快速筛选出多个独立的、具有转基因纯合整合的品系。此外，该方法操作简便、耗材少。能够快速构建多个表达特定整合转基因的不同品系，对于研究基因表达模式与调控、蛋白质定位、过表达，以及亚细胞标记物的开发具有重要意义。

引言

转基因技术在 C. elegans 中被广泛应用于多种研究目的。通常通过将DNA注射到合胞体雌雄同体的性腺中来构建转基因品系1,2。携带目标转基因的DNA会与编码共注射标记物的质粒共同注射1,3,4。共注射标记物是已建立的转基因，可导致荧光蛋白的表达，或产生特定的行为或形态表型5,4。注射的DNA会重排并形成多拷贝的染色体外阵列，因此目标转基因与共注射标记物可共同遗传。通过在注射动物的F2代中筛选共注射标记物所诱导的表型（荧光或特定表型），即可获得转基因品系1。由于染色体外阵列向后代的传递率存在部分性和变异性，转基因品系在遗传上并不稳定。根据品系不同，后代中继承染色体外阵列的个体比例为10%-100%（100%极为罕见）。此外，转基因动物具有嵌合性，即转基因仅在部分细胞中表达。这种嵌合性可能与向后代传递染色体外阵列的效率相关。事实上，在生殖系和体细胞中，染色体外阵列在细胞分裂过程中的分离情况决定了其传递率。为解决这一问题，一种方法是将转基因整合到基因组中。传统上，转基因整合到染色体中的方法依赖于对携带染色体外阵列的转基因线虫进行辐照（紫外线或γ射线）3。具体而言，选取50-100只处于L4幼虫期的雌雄同体动物进行辐照处理。在F1代中，挑选200-800只转基因个体，并分别接种于培养板上进行单独培养。根据孟德尔分离定律，基因组中携带杂合整合转基因的F1个体，其后代中应有1/2为整合阵列杂合子，1/4为整合阵列纯合子，1/4未整合该阵列（图1）。因此，通过观察共注射标记物的表达情况，在F2代培养板中筛选转基因后代比例≥75%的品系。约有1/3被选为整合候选者的F2个体可视为整合阵列纯合子，其F3后代应全部为纯合子。因此，从每个选定的培养板中分别挑选三至八只F2转基因个体进行单独培养，并筛选出后代100%为转基因的培养板。随后，再分别培养八只F3个体，以确认转基因的遗传率达到100%。

该方法的主要缺点是

  1. 需要对数百个F1代培养板进行目视筛选，以获得≥75%转基因F2后代，但由于非整合型染色体外阵列的传递率具有可变性和不可预测性，该过程十分耗时。或者，为避免筛选大量F1代培养板，可在P0代动物经辐照后进行若干次后续的饥饿处理步骤；随后挑选100只转基因动物，并筛选其后代是否达到100%转基因率3。
  2. 该方法不适用于染色体外阵列传递率高于60%的品系，因为难以将该传递率与75%区分开来。
  3. 由于仅能使用传递率相对较低的品系，因此需要处理大量经辐照的转基因P0代动物，并观察大量的F1和F2代个体，这一过程极为耗时，且需要使用大量培养板。

照射线虫可能会在DNA中诱导产生双链断裂，而染色体外阵列在DNA修复过程中整合到染色体中。因此，成功获得辐射介导整合的概率很可能与携带染色体外阵列的生殖系细胞数量成正比。如文献2所述，高传递率的品系可能比低传递率品系含有更多的转基因DNA阵列，因而表现出更高数量的携带染色体外阵列的生殖系细胞。因此，我们推测，在传递率较高的品系中，转基因可能比在传递率较低的品系中更容易整合。然而，标准方案排除了整合高传递频率转基因的可能性，因为携带非整合型染色体外阵列的转基因动物所占比例很难与携带转基因杂合整合的F1代动物后代中的比例相区分（图1）。

本文表明，对于特定的转基因，经紫外线（UV）照射后获得的整合株系数量取决于非整合阵列初始的遗传传递率。我们提出了一种改进的通过紫外线照射介导转基因整合的实验方案，该方法尤其适用于转基因阵列高传递率的株系。

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方案

1. 转基因线虫培养（实验前） 整合

转基因品系的构建方法如文献1所述。这些品系通常包含一个共注射标记质粒，该质粒可在特定发育阶段导致荧光蛋白的表达，或产生特定的行为或形态表型1,3。本整合方案适用于表达荧光或非荧光共注射标记的菌株。在下述示例中，所使用的菌株带有荧光共注射标记。

  1. 准备培养皿：
    1. 准备约500个60 mm 的大培养皿，每皿无菌倒入10 ml线虫生长培养基（NGM）6,7。
    2. 按照标准操作流程6,7，向每皿接种0.3 ml过夜培养的Escherichia coli OP50菌液。
  2. 评估待整合转基因品系的遗传传递率：
    1. 针对每个转基因品系，在荧光体视显微镜下使用线虫挑取工具，挑选十个带有荧光的成年雌性成虫，分别转移到十个独立的培养皿中7。
    2. 将线虫置于15–25 °C（根据遗传背景而定）的线虫培养箱中培养，使其繁殖后代。
    3. 每天观察子代，确定共注射标记基因在哪个发育阶段表达且最易于观察。目前常用的共注射标记基因大多在L4幼虫期或成虫期表达。
    4. 通过在荧光体视显微镜下观察，统计具有荧光的子代比例，评估其遗传传递率。
  3. 选择用于转基因整合的品系：
    1. 选择遗传传递率尽可能高的转基因品系（理想情况下≥80%）。
  4. 获得处于L4幼虫期同步化的转基因线虫群体用于整合：
    1. 将30个带有荧光的成年雌性成虫分别挑至五个培养皿中（每皿六只）。
    2. 在15 °C下让线虫产卵3–4小时。
    3. 确认每皿至少有30枚卵后，移除成虫。
    4. 将线虫置于15–25 °C的线虫培养箱中继续培养，直至子代发育至L4幼虫期（15 °C下约需96小时，或25 °C下约需36小时）。

2. 转基因线虫的紫外照射与恢复

  1. 线虫辐照：
    1. 挑选30-100条荧光转基因L4期线虫，分别转移到不同的培养板上（每板15-20条）。
    2. 将培养板去盖后放入紫外交联仪中，以0.012 J/cm2剂量辐照线虫。需注意不同品系对紫外线的敏感性存在差异，且结果可能因所使用的紫外辐照仪不同而有所变化。可尝试0.010-0.015 J/cm2范围内的剂量。
  2. 辐照后线虫恢复：
    1. 将含有辐照后线虫的培养板置于15 °C过夜，以进行恢复。
    2. 检查存活线虫的数量。在我们的实验条件下，约80-90%的存活率表明辐照效果良好。
    3. 将辐照后的线虫在15-25 °C下继续培养，直至其子代发育至可观察共注射标记表达的阶段，具体阶段依据步骤1.2中所确定的条件。

3. 转基因整合株系的分离

  1. 选择F1代动物：
    1. 将150-200只带有荧光的F1代动物分别转移到独立的培养板上。对于转基因传递率较高的品系（≥80%），100只F1代动物已足够。
    2. 将这些F1代培养板置于15-25 °C条件下培养，直至其子代发育至适合观察荧光F2代动物的阶段。
    3. 弃去所有出现以下情况的F1代培养板：i) 无子代产生，表明该F1代动物不育或已死亡；或 ii) 无荧光或仅有极少数荧光F2代动物，表明该F1代动物未按预期频率传递转基因。此步骤操作迅速，相较于标准方案中需估算荧光F2代线虫比例以筛选出荧光子代≥75%的F1代培养板的方法，具有明显优势（表1）。
  2. 选择F2代动物：
    1. 从每个选定的F1代培养板中挑取四只带有荧光的转基因F2代动物。当使用荧光转基因（例如mCherry8、gfp9或dsRed10）时，应挑选荧光信号较强的F2代线虫，因为这可能表明这些个体对整合的转基因阵列呈纯合状态。注意在挑取F2代动物时，必须避免带入卵或幼虫，以防在下一步中出现假阴性结果。
    2. 将F2代动物在15-25 °C条件下培养。
  3. 整合型转基因品系的分离与验证：
    1. 对F2代培养板进行筛选，寻找F3代线虫全部呈荧光的培养板。该筛选过程较快，因为只要发现一只非荧光线虫，即可丢弃该培养板。一个对整合转基因呈纯合状态的F2代动物将产生100%呈荧光的纯合子代。
    2. 从选定的培养板中挑取八只荧光F3代动物，以确认转基因的100%遗传率。理论上，此步骤挑取一只动物即可。然而，为避免因辐射随机诱导影响线虫生理功能的重要基因突变而导致选到不育或健康状况不佳的个体，挑取八只荧光F3代动物可能是必要的。
    3. 如有可能，应保留多个独立的整合型转基因品系，i.e. 来自不同F1代动物的品系。

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结果

使用标准方案和改进方案对两个以相似频率（约50-60%）传递染色体外阵列的转基因品系进行了整合实验（表1）。标准方案在对91只转基因L4期动物进行紫外照射后，获得了三个独立的整合品系；而改进方案在对30只转基因L4期动物进行紫外照射后，获得了一个整合品系。这表明两种方案的整合效率相似（每30只经照射的L4期动物可获得一个整合品系）。然而，我们不能排除在整合同一转基因的情况下，其中一种方案可能比另一种更高效的可能性。两种方案的主要区别在于：在改进方法中，所有F1代平板中只要出现荧光后代即被选中，而不论其F2代荧光个体所占比例；而在标准方法中，则需对F1代平板进行目视筛选，仅选择F2代转基因后代比例≥75%的平板。这一筛选步骤极为耗时，特别是当初始传递率接近75%时尤为明显。在改进方案中，只需从每个携带转基因F2代个体的F1代平板中挑取四只F2代线虫，并筛选F3代中转基因后代比例为100%的平板，该过程可快速完成。此外，与标准方案相比，改进方案减少了所需分析的F2和F3代个体数量。总体而言，改进方案在获得每个整合品系所需的时间和培养板数量方面均得到了优化。

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讨论

本文所述方案提供了一种将染色体外转基因阵列高效整合到 C. elegans 基因组中的方法。利用多个传递相同转基因 Pdyc-1::dyc-1::gfp（pKG45）但传递率不同的非整合品系（10–15%、50–60% 和 >80%），我们证明了经紫外线照射后获得的整合品系数目依赖于非整合品系初始的传递水平（表 2）。因此，在传递率较高的品系中更易于实现转基因的整合。

整合的转基因在多种研究中具有重要意义，包括与基因调控和基因表达模式相关的研究。整合的转基因也是建立荧光亚细胞标记物的有用工具。在进行转基因整合时，分离多个独立品系可能至关重要。许多研究需要将转基因导入不同的遗传背景中。然而，转基因可能插入到目标基因附近的染色体位置，或产生可能导致特定遗传背景下出现非预期表型的突变。因此，建立一种简便快速的方法来获得多个独立的整合品系具有重要价值。

染色体外阵列通常由多个转基因拷贝组成，将其整合到基因组中可实现相应转基因的过表达。过表达特定转基因的品系是...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

作者感谢Claire Lecroisey和Laurent Ségalat构建了非整合型Pdyc-1::dyc-1::gfp；Pmyo-2::dsRed和Pmyo-3::gfp转基因品系。我们感谢Andy Fire惠赠Pmyo-2::dsRed质粒，以及Pamela Hoppe惠赠Pmyo-3::gfp质粒。本研究由法国国家科学研究中心（CNRS）和里昂克劳德·贝尔纳大学资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
琼脂Prolabo20768.292用于 NGM（线虫生长培养基）的制备 (6,7)
氯化钠Chimie-Plus40045用于 NGM 培养基的制备
蛋白胨BD211820用于 NGM 培养基的制备
KH2PO4Roth3904-1用于 NGM 培养基的制备
K2HPO4Prolabo26930.293用于 NGM 培养基的制备
MgSO4RothP027.2用于 NGM 培养基的制备
CaCl2Prolabo22317.297用于 NGM 培养基的制备
胆固醇Rectapur用于 NGM 培养基的制备
LB 肉汤SigmaL3022用于 OP50 菌株的培养
设备
紫外交联仪Fischer Scientific波长 254 nm
SteREO Discovery V8 体视显微镜Carl Zeiss, Inc.
培养皿，60 mmCMLBPS55E6
铂金丝，0.25 mmAlfa Aesar7440-06-4用于制作挑取线虫的接种针 (7)

参考文献

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