我们展示了一种简单的多重PCR检测方法，用于快速筛查和分型耐甲氧西林Staphylococcus aureus的葡萄球菌染色体盒mec（SCCmec）I-V型，并提供了一些关键步骤和操作细节，以帮助各实验室成功建立该检测方法。
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摘要
摘要
葡萄球菌染色体盒 mec （鳞状细胞癌，SCC）mec) 分型是了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行病学特征及克隆菌株相关性的重要分子工具 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA），尤其是社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA-MRSA）在全球范围内不断暴发流行。传统的PCR分型方法对SCCmec 通过靶向并识别单个 mec 和 CCR 基因复合体类型，但需要使用多组引物和进行多次独立的PCR实验。我们设计并发表了一种简单的多重PCR检测方法，用于快速筛查主要的SCCmec 类型及 I 至 V 亚型，并在获得新的序列信息后对其进行了更新。该简单的检测方法针对单个 SCCmec 在单次反应中可检测多种类型，结果易于解读，已在世界范围内广泛应用。然而，由于该检测方法较为复杂，且反应中包含大量引物，因此在将其引入不同实验室时可能面临一定困难。为促进MRSA SCC检测方法的建立mec 检测，本文演示了如何建立我们的多重 PCR 检测，并讨论了确保该检测成功的一些关键步骤和操作细节。
引言
耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）已将其基因组中获得并整合了一个21-67 kb的可移动遗传元件，称为葡萄球菌染色体盒 mec （鳞状细胞癌，SCC）mec) 携带甲氧西林耐药性（mecA基因及其他抗生素耐药决定因子 1鳞状细胞癌（SCC）mec 其特征在于存在末端直接重复序列和反向重复序列，这是两个必需的遗传组分（ mec 基因复合物和 ccr 基因复合体）以及J区（图1）。 mec 基因复合体由IS组成431mec, mecA以及完整或截短的调控基因组 mecR1 和 mecI，而 ccr 基因复合体编码重组酶（ccr/ccrAB介导SCC整合的）mec 进入受体染色体及其从受体染色体上的切除 1. 近期两种新型 mec 耐药基因（mecB 和 mecC）被描述，它们与 mecA 基因 2其余的鳞状细胞癌mec 该元件由位于其间的J区（J1、J2和J3）组成 mec 和 ccr 复合物并包含多个基因或假基因。存在多个类别 mec 复合物（如 A、B、C、D 和 E）及同种异型 ccr 复合物（如1-8）的描述。这些复合物类别与同种异型的不同组合产生多种SCCmec 类型。根据SCC的指南mec 国际葡萄球菌染色体盒元件分类工作组（IWG-SCC）的命名法与分类，SCCmec 元素根据其性质被分为不同类型 mec 和 ccr 基因复合体，并根据其 J 区域 DNA 的差异进一步分为亚型 1. MRSA 克隆通常通过整合 SCC 来定义mec 将分型信息与基于基因/基因组序列的分型方法所提供的信息相结合，例如多位点序列分型（ST）和/或金黄色葡萄球菌蛋白A基因（spa）分型（例如 ST8-t008-MRSA-IVa）。因此，SCCmec 分型是了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）流行病学特征及克隆菌株相关性的重要分子工具，尤其是在全球范围内社区相关性MRSA（CA-MRSA）暴发日益增多的背景下。
传统的PCR分型方法通过靶向和鉴定独立的mec和ccr基因复合体类型对SCCmec进行分类，但需要使用大量（20至30组）引物以及多个独立的PCR实验。例如，Okuma 等在检测SCCmec I-IVb时使用了21条引物和多个单靶标PCR反应3。随后，Kondo 等开发了一种更为完整的检测方法，用于鉴定ccr、mec以及J区的主要差异，但该方法同样需要大量引物和多个PCR反应4。为了简化SCCmec分型，研究人员开发了多重PCR（M-PCR）检测方法，使样本可在单个PCR反应中完成处理。De Lencastre及其同事开发了一种M-PCR方法，用于快速筛查SCCmec I-IV型，并后续更新以涵盖SCCmec I-V型，另设一种独立的M-PCR用于鉴定SCCmec IV亚型5,6,7。然而，这些检测方法解释结果较为困难，需进行两次反应才能完成SCCmec IV亚型的分类，且会产生多个无法分型的亚型。为改进SCCmec分型效果，我们设计并发表了一种简单的多重PCR检测方法，可用于快速筛查主要的SCCmec I至V型及其亚型8，并在获得新的序列信息后进行了更新9。该简易检测方法可在单个反应中靶向不同的SCCmec类型，结果易于解读，已在世界范围内被广泛使用（Scopus数据库统计337次；更新于2013年1月30日）。自原始论文发表以来，我们收到来自多个研究团队的大量请求，寻求协助建立该检测方法作为其内部MRSA SCCmec分型流程的一部分。由于该检测方法技术要求较高，且反应中包含大量引物，各实验室在引入该方法时可能存在一定困难。为促进MRSA SCCmec分型检测的建立，本文将演示如何设置我们的M-PCR用于SCCmec分型，并讨论若干关键步骤和操作细节，以确保该方法的成功实施。
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方案
这些操作应在经认证的生物安全二级实验室中进行。应始终佩戴适当的手部防护装备和实验服等个人防护装备。
1. 样品制备
- 需要使用新鲜的MRSA过夜培养平板。在进行PCR的前一天，用无菌接种棒挑取单个MRSA菌落，在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上划取浓密的菌线。多个样品可划在同一块平板上。于37 °C培养过夜。
- 向1.5 ml微量离心管中加入75 μl无菌蒸馏水。用无菌接种棒从过夜浓密菌线上蘸取少量细菌，将其在无菌水中轻轻搅动，制成混浊的悬浮液（图2）。对所有样品重复此步骤。
- 将离心管置于设定为95 °C的干式加热块中孵育10分钟，以裂解细菌并释放DNA。
注意：如果细菌溶液浓度过低或过高，PCR效率会降低。同样，如果温度高于95 °C或孵育时间超过10分钟，PCR效率也会降低。
- 从加热块中取出样品，在室温下静置 5 分钟。
- 将样品以 13,000 rpm 离心 1 分钟，形成含有细胞碎片的沉淀和含有 DNA 的澄清上清液。样品可于 -20 °C 保存，以备后续使用。
注意：如果使用预先制备并冷冻的样品，需将微量离心管从冰箱中取出，在室温下静置至完全解冻。若沉淀物已被扰动，请重新离心样品。
注意：采用其他任何方法制备的基因组DNA，包括chelex提取法10或柱提取法（QIAmp DNA Mini Kit, Qiagen），也可接受。
2. PCR 准备
注意：每次 PCR 实验都应包含对照样品，且至少应涵盖 I 型、II 型、IIA 型、III 型、IVa 型、IVb 型、IVc 型、IVd 型、IVE 型和 V 型。因此，在配制预混液时，应额外增加 10 个样品的数量。对照用 DNA 可预先制备，并长期保存在冷冻条件下。
- 从 -20 °C 冰箱中取出 PCR 试剂，包括不含 MgCl2 的 10x PCR 缓冲液、50 mM MgCl2、dNTPs 和引物，在洁净的 PCR 操作台（不允许有细菌或 DNA 污染）上室温解冻。此时可准备并标记 0.2 ml 的 PCR 管。
若需配制新的引物或 dNTP 储存液，可按以下步骤操作：- 用无菌去离子水将浓缩的引物原液稀释至 10 μM 的工作液。引物原液及工作液可于 -20 °C 冻存，供日后使用。
- 将市售的 dNTP 原液稀释为每种 dNTP 含量为 2 μM 的工作液。为减少 dNTP 反复冻融次数，可预先配制每种 dNTP 为 10 μM 的储存液，分装为 50 μl 每份至 0.5 ml 离心管中，于 -20 °C 保存。使用时取出一管 10 μM 储存液，加入 200 μl 无菌去离子水稀释至每种 dNTP 为 2 μM。
- 待试剂完全解冻后，短暂涡旋混匀，然后按照 表 1 所示比例混合。必须使用铂金 Taq DNA 聚合酶（而非普通 Taq 酶），因为该选择已被证实会影响反应的成功率。通常先配制总混合液（master mix），短暂涡旋混匀后，分装至各 PCR 管中。
- 盖紧所有 PCR 管，转移至常规工作台。用移液器向每管 PCR 反应体系中加入 2 μl 前步制备的细菌样品上清液作为模板。
- 将 PCR 管转移至专用扩增区域，放入热循环仪中，按以下程序运行：94 °C 预变性 5 分钟，随后进行 10 个循环（94 °C 45 秒、65 °C 45 秒、72 °C 1.5 分钟）；再进行 25 个循环（94 °C 45 秒、52 °C 45 秒、72 °C 2 分钟），最后在 72 °C 延伸 10 分钟，然后在 4 °C 保存。
3. 琼脂糖凝胶电泳
（详见 Lee, P.Y. et al., J. Vis. Exp. (62), e3923, doi:10.3791/3923 (2012) 的更多细节）11。
建议使用专用的凝胶电泳区域。PCR产物在含有0.5×TBE缓冲液（110 mM Tris；90 mM 硼酸；2.5 mM EDTA；pH 8.3）的2.5%琼脂糖凝胶上进行电泳。
- 称取 2.5 g 琼脂糖，加入盛有 100 ml 0.5x TBE 缓冲液的玻璃锥形瓶中。用塑料薄膜封口，放入微波炉中加热至完全溶解。由于 2.5% 的凝胶容易迅速沸腾溢出，因此需间歇停止微波炉并定期旋转混匀溶液。
- 将琼脂糖溶液在冷水下旋转冷却至可安全触摸，或在实验台上静置 5 分钟冷却。将冷却后的琼脂糖倒入制胶板中。
- 从 PCR 梯度扩增仪中取出反应管，向每个样品中加入 2 μl 6x DNA 上样缓冲液（40% 甘油 / 0.25% 溴酚蓝），混匀。每孔上样 5–10 μl 样品。根据预期条带大小，选用 1 Kb+ 或 100 bp DNA 分子量标记物是合适的。
- 可在倒胶前将溴化乙锭（EtBr）加入琼脂糖溶液中，或在电泳完成后将凝胶置于含 EtBr 的染色液中染色。将制好的凝胶放入含 0.5 μg/ml 溴化乙锭的蒸馏水溶液中，轻轻摇动染色 10 分钟。随后将凝胶转移至干净容器中，用蒸馏水漂洗脱色 10 分钟。
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结果
这种改进的多重聚合酶链式反应（M-PCR）能够确定（分类）I至V型SCCmec，以及SCCmec IV的主要亚型。该检测方法针对SCCmec I、II、III、IVa、IVb、IVc、IVd、IVE和V中独特且特异的基因座，同时检测mecA基因。对SCCmec VI和VIII的初步鉴定也是可能的，但需要进一步检测以确认。图3展示了代表性的SCCmec I至VI及VIII结构，以及各靶标在元件中的位置。
I 型特异性引物（红色）靶向 SCCmec I 的 J1 区域中的 orf E008（菌株 NCTC10442；AB033763），而 II 型引物（深绿色）特异性靶向所有已报道的 SCCmec II 和 SCCmec VIII 中 J2 区域存在的 orf NO43（菌株 N315；D86934）。III 型（紫色）、IVa 型（深蓝色）、IVb 型（浅绿色）和 IVd 型（桃色）均为各自...
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讨论
本文所述的多重PCR检测方法为对葡萄球菌中SCCmec I-V型及其主要亚型进行分类，同时区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），提供了一种简单、可靠的检测手段。该检测方法稳定，可在单个PCR反应中便捷完成，结果易于解读。然而，该方法也存在局限性：其仅针对每种SCCmec型中的特定基因座进行检测，无法提供全面的ccr和mec复合体分型，因此不能被视为金标准。尽管如此，大量验证实验已证实，该方法仍是开展MRSA相关科学研究与流行病学调查的一项有价值的分子工具。
由于该检测方法较为复杂，且反应中包含大量引物，因此在将该检测方法引入不同实验室时可能会遇到困难。每个实验室都有其独特的条件和影响因素，例如引物浓度或纯度，以及PCR仪和PCR组分的差异，这些都可能影响检测结果。因此，在各自实验室中建立并优化该检测方法至关重要。然而，采取以下几个步骤将有助于成功实施。
样本和模板制备是任何PCR反应中的关键步骤，因此影响本PCR...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 T. Ito、K. Hiramatsu、R. Daum、H. de Lencastre 和 D. Coleman 慷慨赠送本研究所使用的一些参考菌株。本工作部分得到了阿尔伯塔卫生服务-卡尔加里/卡尔加里实验室服务/卡尔加里大学抗菌药物耐药性中心（CAR）的经费支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白酶大豆琼脂 | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| 无菌蒸馏水 | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq：包含10x PCR缓冲液和50 mM MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| 琼脂糖 | Life Technologies | 16500-500 | |
| 甘油 | Life Technologies | 15514-011 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb+ DNA ladder | Life Technologies | 10787-026 | |
| 溴化乙锭 | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| 接种环 | VWR | CA10805-018 | |
| PCR管 | Diamed | AD0210-FCN (新货号: DIATEC420-1250) | |
| 离心机 | Eppendorf | 5417c | |
| 加热金属块 | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| PCR仪 | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| 水平式浸没型凝胶电泳槽（含凝胶模具） | BioRad | 170-4469 | |
| 电源 | BioRad | 164-5050 | |
| 摇床振荡器 | VWR | 40000-300 | |
| 分子成像凝胶成像系统 | BioRad | 1708170 |
参考文献
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al. Guidelines for Reporting Novel mecA Gene Homologues. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 56 (10), 4997-4999 (2012).
- Okuma, K., Iwakawa, K., Turnidge, J. D., Grubb, W. B., Bell, J. M., O'Brien, F. G., et al. Dissemination of new methicillin-resistant Staphylococcus aureus clones in the community. Journal of Clinical Microbiology. 40 (11), 4289-4294 (2002).
- Kondo, Y., Ito, T., Ma, X. X., Watanabe, S., Kreiswirth, B. N., Etienne, J., et al. Combination of multiplex PCRs for staphylococcal cassette chromosome mec type assignment: rapid identification system for mec, ccr, and major differences in junkyard regions. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (1), 264-274 (2007).
- Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for rapid identification of structural types and variants of the mec element in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (7), 2155-2161 (2002).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Update to the multiplex PCR strategy for assignment of mec element types in Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 51 (9), 3374-3377 (2007).
- Milheirico, C., Oliveira, D. C., de Lencastre, H. Multiplex PCR strategy for subtyping the staphylococcal cassette chromosome mec type IV in methicillin-resistant Staphylococcus aureus: 'SCCmec IV multiplex'. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 60 (1), 42-48 (2007).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Louie, T., Conly, J. M. Novel multiplex PCR assay for characterization and concomitant subtyping of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Journal of Clinical Microbiology. 43 (10), 5026-5033 (2005).
- Zhang, K., McClure, J. A., Conly, J. M. Enhanced multiplex PCR assay for typing of staphylococcal cassette chromosome mec types I to V in methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Molecular and Cellular Probes. 26 (5), 218-221 (2012).
- de Lamballerie, X., Zandotti, C., Vignoli, C., Bollet, C., de Micco, P. A one-step microbial DNA extraction method using "Chelex 100" suitable for gene amplification. Research in Microbiology. 143 (8), 785-790 (1992).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J. Vis. Exp. (62), e3923(2012).
- McClure, J. A., Conly, J. M., Elsayed, S., Zhang, K. Multiplex PCR assay to facilitate identification of the recently described Staphylococcal cassette chromosome mec type VIII. Molecular and Cellular Probes. 24 (4), 229-232 (2010).
- Zhang, K., McClure, J. A., Elsayed, S., Conly, J. M. Novel staphylococcal cassette chromosome mec type, tentatively designated type VIII, harboring class A mec and type 4 ccr gene complexes in a Canadian epidemic strain of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (2), 531-540 (2009).
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重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
