我们展示了一种简单的多重PCR检测方法，用于快速筛查和分型耐甲氧西林Staphylococcus aureus的葡萄球菌染色体盒mec（SCCmec）I-V型，并提供了一些关键步骤和操作细节，以帮助各实验室成功建立该检测方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
勘误通知
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
摘要
摘要
葡萄球菌染色体盒 mec （鳞状细胞癌，SCC）mec) 分型是了解耐甲氧西林金黄色葡萄球菌流行病学特征及克隆菌株相关性的重要分子工具 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA），尤其是社区相关性耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（CA-MRSA）在全球范围内不断暴发流行。传统的PCR分型方法对SCCmec 通过靶向并识别单个 mec 和 CCR 基因复合体类型，但需要使用多组引物和进行多次独立的PCR实验。我们设计并发表了一种简单的多重PCR检测方法，用于快速筛查主要的SCCmec 类型及 I 至 V 亚型，并在获得新的序列信息后对其进行了更新。该简单的检测方法针对单个 SCCmec 在单次反应中可检测多种类型，结果易于解读，已在世界范围内广泛应用。然而，由于该检测方法较为复杂，且反应中包含大量引物，因此在将其引入不同实验室时可能面临一定困难。为促进MRSA SCC检测方法的建立mec 检测，本文演示了如何建立我们的多重 PCR 检测，并讨论了确保该检测成功的一些关键步骤和操作细节。
引言
耐甲氧西林 金黄色葡萄球菌 （耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）已将其基因组中获得并整合了一个21-67 kb的可移动遗传元件，称为葡萄球菌染色体盒 mec （鳞状细胞癌，SCC）mec) 携带甲氧西林耐药性（mecA基因及其他抗生素耐药决定因子 1鳞状细胞癌（SCC）mec 其特征在于存在末端直接重复序列和反向重复序列，这是两个必需的遗传组分（ mec 基因复合物和 ccr 基因复合体）以及J区（图1）。 mec 基因复合体由IS组成431mec, mecA以及完整或截短的调控基因组 mecR1 和 mecI，而 ccr 基因复合体编码重组酶（ccr/ccrAB介导SCC整合的）mec 进入受体染色体及其从受体染色体上的切除 1. 近期两种新型 mec 耐药基因（mecB 和 mecC）被描述，它们与 mecA 基因 2其余的鳞状细胞癌mec 该元件由位于其间的J区（J1、J2和J3）组成 mec 和 ccr 复合物并包含多个基因或假基因。存在多个类别 mec
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
这些操作应在经认证的生物安全二级实验室中进行。应始终佩戴适当的手部防护装备和实验服等个人防护装备。
1. 样品制备
- 需要使用新鲜的MRSA过夜培养平板。在进行PCR的前一天，用无菌接种棒挑取单个MRSA菌落，在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA）平板上划取浓密的菌线。多个样品可划在同一块平板上。于37 °C培养过夜。
- 向1.5 ml微量离心管中加入75 μl无菌蒸馏水。用无菌接种棒从过夜浓密菌线上蘸取少量细菌，将其在无菌水中轻轻搅动，制成混浊的悬浮液（图2）。对所有样品重复此步骤。
- 将离心管置于设定为95 °C的干式加热块中孵育10分钟，以裂解细菌并释放DNA。
注意：如果细菌溶液浓度过低或过高，PCR效率会降低。同样，如果温度高于95 °C或孵育时间超过10分钟，PCR效率也会降低。
- 从加热块中取出样品，在室温下静置 5 分钟。
- 将样品以 13,000 rpm 离心 1 分钟，形成含有细胞碎片的沉淀和含有 DNA 的澄清上清液。样品可于 -20 °C 保存，以备后续使用。
注意：如果使用预先制备并冷冻的样品，需将微量离心管从冰箱中取出，在室温下静置至完全解冻。若沉淀物已被扰动，请重新....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
这种改进的多重聚合酶链式反应（M-PCR）能够确定（分类）I至V型SCCmec，以及SCCmec IV的主要亚型。该检测方法针对SCCmec I、II、III、IVa、IVb、IVc、IVd、IVE和V中独特且特异的基因座，同时检测mecA基因。对SCCmec VI和VIII的初步鉴定也是可能的，但需要进一步检测以确认。图3展示了代表性的SCCmec I至VI及VIII结构，以及各靶标在元件中的位置。
I 型特异性引物（红色）靶向 SCCmec I 的 J1 区域中的 orf E008（菌株 NCTC10442；AB033763），而 II 型引物（深绿色）特异性靶向所有已报道的 SCCmec II 和 SCCmec VIII 中 J2 区域存在的 orf NO43（菌株 N315；D86934）。III 型（紫色）、IVa 型（深蓝色）、IVb 型（浅绿色）和 IVd 型（桃色）均为各自.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
本文所述的多重PCR检测方法为对葡萄球菌中SCCmec I-V型及其主要亚型进行分类，同时区分耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）与甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA），提供了一种简单、可靠的检测手段。该检测方法稳定，可在单个PCR反应中便捷完成，结果易于解读。然而，该方法也存在局限性：其仅针对每种SCCmec型中的特定基因座进行检测，无法提供全面的ccr和mec复合体分型，因此不能被视为金标准。尽管如此，大量验证实验已证实，该方法仍是开展MRSA相关科学研究与流行病学调查的一项有价值的分子工具。
由于该检测方法较为复杂，且反应中包含大量引物，因此在将该检测方法引入不同实验室时可能会遇到困难。每个实验室都有其独特的条件和影响因素，例如引物浓度或纯度，以及PCR仪和PCR组分的差异，这些都可能影响检测结果。因此，在各自实验室中建立并优化该检测方法至关重要。然而，采取以下几个步骤将有助于成功实施。
样本和模板制备是任何PCR反应中的关键步骤，因此影响本PCR.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
我们感谢 T. Ito、K. Hiramatsu、R. Daum、H. de Lencastre 和 D. Coleman 慷慨赠送本研究所使用的一些参考菌株。本工作部分得到了阿尔伯塔卫生服务-卡尔加里/卡尔加里实验室服务/卡尔加里大学抗菌药物耐药性中心（CAR）的经费支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白酶大豆琼脂 | Fisher (BD) | CA90002-700 (236920) | |
| 无菌蒸馏水 | Life Technologies | 10977-015 | |
| Platinum Taq：包含10x PCR缓冲液和50 mM MgCl2 | Life Technologies | 10966-034 | |
| 100 mM dNTP | Life Technologies | 10297-018 | |
| Tris碱 | Sigma-Aldrich | T6066 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B7901 | |
| EDTA | Life Technologies | 15576-028 | |
| 琼脂糖 | Life Technologies | 16500-500 | |
| 甘油 | Life Technologies | 15514-011 | |
| 溴酚蓝 | Sigma-Aldrich | B8026 | |
| 1Kb+ DNA ladder | Life Technologies | 10787-026 | |
| 溴化乙锭 | Sigma-Aldrich | E7637 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | VWR (Axygen Scientific) | 10011-700 | |
| 接种环 | VWR | CA10805-018 | |
| PCR管 | Diamed | AD0210-FCN (新货号: DIATEC420-1250) | |
| 离心机 | Eppendorf | 5417c | |
| 加热金属块 | VWR | 13259-030 / 13259-286 | |
| PCR仪 | Applied Biosystems (2720) | 4359659 | |
| 水平式浸没型凝胶电泳槽（含凝胶模具） | BioRad | 170-4469 | |
| 电源 | BioRad | 164-5050 | |
| 摇床振荡器 | VWR | 40000-300 | |
| 分子成像凝胶成像系统 | BioRad | 1708170 |
参考文献
- IWG-SCC. Classification of staphylococcal cassette chromosome mec (SCCmec): guidelines for reporting novel SCCmec elements. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 53 (12), 4961-4967 (2009).
- Ito, T., Hiramatsu, K., Tomasz, A., de Lencastre, H., Perreten, V., Holden, M., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
勘误
Formal Correction: Erratum: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus
Posted by JoVE Editors on 3/19/2019. Citeable Link.
An erratum was issued for: Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus. There was a typo in Table 1.
In Table 1, the Oligonucleotide sequence for Type III-F5 was updated from:
TTCTCATTGATGCTGAAGCC
To:
GAAACTAGTTATTTCCAACGG
