一种通过电化学发光免疫分析法测定血清心脏肌球蛋白结合蛋白-C的高灵敏度和高特异性定量方法

摘要

在复杂的生物样本中检测生物标志物正日益指导临床决策。本文介绍一种高灵敏度的方法，可同时检测心肌梗死患者和健康对照者血清样本中的心肌肌球蛋白结合蛋白-C、肌酸激酶同工酶MB以及心肌肌钙蛋白I。

摘要

生物标志物在临床决策和基础科学研究中正变得越来越重要。心肌梗死（MI）的诊断主要依赖于检测患者血清或血浆中的心肌特异性蛋白，以作为心肌损伤的指标。我们近期已证实，心肌肌球蛋白结合蛋白-C（cMyBP-C）在心肌梗死后可在血清中被检测到，因此我们提出其作为心肌梗死的潜在生物标志物。生物标志物的检测通常采用传统的夹心法酶联免疫吸附测定（ELISA）。然而，该技术需要较大的样本量，动态范围较小，且每次只能检测一种蛋白质。

本文展示了一种多重免疫测定方法，可同时高灵敏度地检测三种心脏蛋白。单独检测cMyBP-C，或与肌酸激酶同工酶MB及心肌肌钙蛋白I联合检测，均表现出相当的灵敏度。该技术结合了Meso Scale Discovery（MSD）的96孔板多重检测平台与电化学发光检测法。该方法仅需少量样本体积，即可实现高灵敏度和宽动态范围。利用该技术，我们检测了16名心肌梗死（MI）患者血清样本中cMyBP-C、肌酸激酶同工酶MB和心肌肌钙蛋白I的水平，并与16名对照受试者的结果进行了比较。我们能够在这些样本中成功检测到全部三种标志物，并发现三种生物标志物在心肌梗死后均升高。因此，该技术适用于血清样本中心脏生物标志物的高灵敏度检测。

引言

在临床患者管理和基础科学研究中，对血清等复杂生物样本中微量蛋白质的检测正变得越来越重要。例如，在临床环境中，血清中心脏生物标志物（如肌钙蛋白I）水平的升高与急性心肌梗死（MI）相符¹。为了检测血清样本中的蛋白质，标准的酶联免疫吸附测定法（ELISA）是最常用的技术，因其具有高灵敏度，并可实现对分析物的绝对定量。然而，传统的ELISA需要相对较多的样本量（通常为100 μl），在某些生物液体中背景信号较高，且每次ELISA仅能检测一种分析物²。

最近，一种新的免疫测定技术被引入，可克服上述诸多缺点。这种由MSD开发的改良检测方法采用电化学发光（ECL）进行信号检测，具有极低的背景信号和更高的灵敏度，因而能够使用极小的样本体积。电化学发光基于报告分子三联吡啶钌（II），该分子被标记在检测抗体上。当对96孔板底部施加电刺激时，该报告分子在620 nm处发出光信号，而孔板底部集成了碳电极³。此外，通过点阵包被技术，可在同一孔内包被多种捕获抗体（在96孔板上最多可达10种），从而实现单个样本中多种蛋白质的同步定量⁴。该技术最近已被用于检测血清中的促炎性细胞因子谱^5,6。MSD的多重检测板与其他多重检测平台相比具有显著优势⁷。

以MSD作为主要检测平台，我们进一步开发了一种定制的三重检测板，可同时定量心脏肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）、肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）和心脏肌钙蛋白I（cTnI）的水平，并将结果与cMyBP-C的单重检测进行比较。CK-MB和cTnI是心肌梗死（MI）公认的生物标志物。然而，这些生物标志物的升高也可能由非MI的其他病理状况引起，例如心肌炎或肾功能衰竭⁸。这提示有必要增加额外的生物标志物以提高MI诊断的特异性。我们近期已证实cMyBP-C也是MI的潜在生物标志物⁹。cMyBP-C是一种与粗肌丝相关的蛋白，在心脏中表达^10-12，但在骨骼肌或平滑肌中不表达。因此，循环系统中cMyBP-C水平的升高是心肌损伤的特异性指标¹³。

在本研究中，我们比较了单重检测cMyBP-C与使用定制的三重检测法对MI患者血清中cMyBP-C、CK-MB和cTnI水平的测定。未来，该特征性技术或可用于急诊室中以胸痛就诊的患者诊断心肌梗死（MI）。

芝加哥洛约拉大学的机构审查委员会（IRB）批准了本研究使用去标识的人类样本及免疫测定方法（LU# 20392）。

方案

1. 单重 cMyBP-C 检测

1. 实验前一天，用捕获抗体包被96孔MSD裸标准板。对于cMyBP-C，使用30 μl小鼠单克隆抗cMyBP-C抗体（无明胶）溶液，以5 μg/ml的浓度用磷酸盐缓冲液（PBS）稀释后进行包被。
2. 由于孔壁具有疏水性，应将溶液移液至孔的底部角落，然后轻敲板子的侧边，使溶液覆盖整个孔表面。
3. 用板封膜封板后，在4 °C下避光孵育过夜（O/N），不振荡。
4. 通过将板倒置在水槽上方轻敲，去除捕获抗体溶液，随后在纸巾堆上轻拍以吸干残留液体。每孔加入150 μl含5%（w/v）阻断剂A（高纯度BSA）的PBS溶液，以封闭板上的非特异性结合位点。
5. 封板后，在室温（RT）下以700 rpm振荡孵育1小时。
6. 在封闭的同时，准备标准品和样品。将重组cMyBP-C蛋白片段（氨基酸1–271）用含1%（w/v）阻断剂A的PBS溶液稀释至起始浓度2,000 ng/ml，作为标准品起始液；然后在含1%（w/v）阻断剂A的PBS中按5倍系列稀释。共使用7个标准品浓度加1个空白对照（仅含1%（w/v）阻断剂A/PBS）。
7. 去除封闭液后，每孔用150 μl含0.05%（v/v）Tween-20的PBS洗板3次。每次洗板时，将板倒置在水槽上方倾去洗涤液。第三次洗涤后，用力在水槽上方甩板，并在纸巾层上用力拍打直至完全干燥。此步骤至关重要，因后续孵育体积较小，残留洗涤液会显著稀释下一孵育步骤的试剂。
8. 向各孔中加入25 μl标准品或样品溶液，封板后在室温下以700 rpm振荡孵育1小时。
9. 将检测抗体溶液用含1%阻断剂A的PBS稀释至1 μg/ml后使用。检测抗体为定制的cMyBP-C抗体（表位为氨基酸2–14），已标记MSD SULFO-TAG。MSD提供SULFO-TAG标记试剂盒，可方便地对任意抗体进行标记。
10. 重复步骤1.4中所述的洗涤步骤。
11. 每孔加入25 μl检测抗体溶液，封板后在设定为700 rpm的板式振荡器上室温孵育1小时。
12. 在孵育期间，运行MSD提供的演示板（带LED灯的板）以确认Sector Imager及软件功能正常（参见试剂部分）。同时，将MSD提供的读板缓冲液按1:4稀释：将5 ml 4x读板缓冲液加入15 ml去离子水中。
13. 重复步骤1.4中所述的洗涤步骤。
14. 使用多通道移液器向每孔加入150 μl读板缓冲液。注意避免产生气泡（反向移液是一种合适的方法）。加入读板缓冲液后，立即在Sector Imager中扫描该板。

2. 三重 cMyBP-C、CK-MB 和 cTnI 检测

1. 使用前，将96孔3重检测板和稀释液在室温下平衡至室温。该板由MSD预先包被针对cMyBP-C、CK-MB和cTnI的捕获抗体。
2. 向每孔中加入25 μl的1%（w/v）阻断剂A/PBS。轻敲板的侧面，确保溶液完全覆盖整个孔壁。
3. 用封板膜密封板孔，将板置于板式振荡器上，以700 rpm振荡30分钟。
4. 在此期间，准备各校准品的系列稀释液。由于每孔含有三种捕获抗体，因此在使用前需将三种校准品混合并进行连续稀释。将重组cMyBP-C、CK-MB（MSD）和cTnI（MSD）共同溶于1%（w/v）阻断剂A/PBS中，配制成含2,000 ng/ml cMyBP-C、100 ng/ml CK-MB和25 ng/ml cTnI的混合样品（样品A）。
5. 每个标准品至少准备100 μl的终体积。为完成标准曲线系列，以5倍比例对样品进行连续稀释。取25 μl样品A加入100 μl 1%（w/v）阻断剂A/PBS中制备样品B；再取25 μl样品B加入100 μl 1%（w/v）阻断剂A/PBS中制备样品C，依此类推。本研究使用了来自16名心肌梗死患者和16名对照个体的人血清样本，用于检测cMyBP-C、CK-MB和cTnI水平。这些样本以1%（w/v）阻断剂A/PBS进行2倍稀释。
6. 向3重检测板各孔中已存在的25 μl溶液中加入25 μl标准品或稀释后的样本。务必同时设置空白对照孔（仅含稀释液）。为建立检测方法，样本应设置技术重复三份；其他情况下，重复两份已足够。
7. 再次密封板孔（封板膜可重复使用），在室温下置于板式振荡器上以700 rpm孵育2小时。
8. 在孵育即将结束前，准备检测抗体溶液。所用稀释液为含1%（w/v）阻断剂A的PBS。将三种SULFO标记的检测抗体共同稀释至每种终浓度为1 μg/ml。检测抗体通常以50倍浓缩液形式提供。
9. 对于完整的96孔板，共需2,700 μl稀释后的检测抗体溶液（包含移液误差）。将每种检测抗体各54 μl加入2,538 μl 1%（w/v）阻断剂A/PBS中。
10. 孵育2小时后，在水槽上方用力甩动板以去除孔内液体。用含0.05% Tween-20的PBS洗板3次，每次150 μl。使用多通道移液器向每孔加入25 μl检测抗体溶液，并轻敲板的侧面，确保溶液完全覆盖整个孔壁。
11. 密封板孔，在700 rpm振荡条件下孵育1小时。
12. 在孵育期间，运行MSD的演示板（带LED灯的板）以确认Sector成像仪及软件功能正常。同时，将MSD提供的读板缓冲液进行稀释：将5 ml 4倍浓缩读板缓冲液加入15 ml蒸馏水中。
13. 重复步骤2.8中所述的洗涤步骤。
14. 使用多通道移液器向每孔加入150 μl读板缓冲液。避免产生气泡至关重要（反向移液是一种合适的方法）。加入读板缓冲液后，立即在Sector成像仪中扫描该板。

结果

3-重检测的基本原理和工作流程如图1所示，整体工作流程在表1中进行了描述。单重检测遵循相同原理，唯一的区别是整个孔底包被一种捕获抗体。信号检测通过电化学发光（ECL）实现，即在孔底部施加电信号，从而引发读取缓冲液与检测抗体上的SULFO-TAG标记发生化学反应，局部产生光信号。这一机制使检测具有背景信号低、灵敏度高的特点。在图2中，比较了单重检测与3-重检测中cMyBP-C的标准曲线。两种检测均表现出极高的灵敏度和宽广的动态范围。检测限和定量限如表2所示，在单重和3-重检测中具有可比性。cTnI和CK-MB的检测限也在图3和表2中展示。通过两名不同操作者对相同样本（n = 2，3次技术重复）进行检测，评估了操作者间变异性，结果显示变异性较低（CV为8.5%）。通过将三种校准品各自的单个标准曲线分别与单一检测抗体孵育，研究了检测抗体与其他两种校准品之间的交叉反应性（图4）。结果显示，CK-MB校准品与cT...

讨论

在本研究中，我们展示了多重免疫分析法在检测患者血清中多种心脏生物标志物方面的适用性。该技术相较于传统的ELISA具有多项优势。首先，试剂盒采用电化学发光（ECL）而非比色法进行检测。在ECL中，电信号刺激局部产生待测信号（光），从而将刺激事件与信号读出分离，降低了背景干扰¹⁴。因此可实现高灵敏度，如表2所示。

多重检测该指标不会导致cMyBP-C检测灵敏度的下降，这一点可以从图2和表2中看出。单重检测所测得的cMyBP-C灵敏度和检测范围与同时检测CK-MB和cTnI¹³时测得的cMyBP-C相当。同时检测可显著减少检测所需的样本体积，在处理稀有生物样本时这一点尤为关键，同时也减少了运行多个单重检测所需的时间。

与任何免疫测定一样，该检测结果高度依赖于所用抗体的质量。捕获抗体和检测抗体的亲和力、特异性和亲合力是决定检测灵敏度的主要因素¹⁵。应尝试不同的抗体组合，...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
含表面活性剂的MSD Read-Buffer T (4X)	Meso Scale Discovery	R92TC-2
Tween-20	Acros	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
磷酸盐缓冲液，10X	Fisher BioReagents	BP399-4	使用前过滤
肌球蛋白结合蛋白C抗体，小鼠单克隆（E7），无明胶	Santa Cruz	SC-137180L	用于包被时，抗体必须不含明胶
耗材与设备
Multi-Array 96孔标准板	Meso Scale Discovery	L15XA-3
一种原型3重检测、四点式96孔板，含cMyBP-C、cTnI和CK-MB	Meso Scale Discovery	N452A-1
ThermaSeal封板膜	Life Science Products Inc.	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	Meso Scale Discovery
MTS 2/4数字微孔板振荡器	IKA	3208001