电化学发光免疫法测定血清心肌肌球蛋白结合蛋白-C敏感而特异的定量方法

Summary

测量越来越复杂的生物样品中的生物标志物指导临床决策。我们描述一个高度敏感的方法同时测量心肌肌球蛋白结合蛋白C，肌酸激酶MB，心肌肌钙蛋白I与心肌梗死和健康对照组受试者的血清样本。

Abstract

生物标志物正变得越来越重要，在临床决策，以及基本的科学。诊断心肌梗死（MI）主要是由患者的血清或血浆中检测心肌特异性蛋白作为心肌损伤的指标。最近的研究表明心肌肌球蛋白结合蛋白C（cMyBP-C）MI后的血清中检测到，我们提出了它作为一种潜在的生物标志物的MI。生物标志物检测通常由传统夹心酶联免疫吸附试验。然而，该技术需要一个大的样品体积，有一个小的动态范围，并且可以测量在一个时间只有一个蛋白质。

在这里，我们示出了复用的免疫测定法，它可以同时测量三个心脏的蛋白质具有很高的灵敏度。测量cMyBP-C在uniplex或共同肌酸激酶MB和肌钙蛋白，我发现类似的敏感性。这种技术使用细观发现（MSD）的复用的方法，在96 - 孔的板，用于检测电致化学发光结合。虽然只有少量样品的要求，实现高灵敏度和大动态范围。使用这种技术，我们测量cMyBP-C，肌酸激酶MB，心肌肌钙蛋白I血清样品从16个科目与MI水平，并与16个对照组比较的结果。我们能够检测这些样品中的所有三个标记和发现所有三种生物标志物来增加心肌梗死后。因此，这种技术是适用于敏感的检测血清样品中的心脏生物标记物的。

Introduction

低量的蛋白质，在复杂生物样品，如血清，测量病人的管理，以及基础科​​学发展的临床重要性。比如，增加血清心脏生物标志物，如肌钙蛋白I，在临床的设置是一致的急性心肌梗死^（MI）1。为了检测血清样品中的蛋白质，标准的酶联免疫吸附试验（ELISA）法是最常用的技术，因为它具有高灵敏度和允许的被分析物的绝对定量。然而，传统的ELISA试剂盒，需要一个比较大的量的样品（一般为100微升），在生物体液中的一些具有高的背景信号，并且被限制为只有一个每²酶联免疫吸附分析物的测量。

最近，一种新的免疫分析技术被引入的情况下，许多这些缺点。此修改后的实验中，由MSD的开发，使用electrochemiluminescENCE（ECL）信号的检测，允许一个非常低的背景和敏感性的增加，能够使用小样本量。电致化学发光是根据记者分子钌（II）trisbipyridal，这是附加的检测抗体。记者分子发射光在620nm时的底部的96 -孔的板，它具有集成在其中³个碳电极的电刺激。另外，通过使用点涂，多个捕获抗体可以被涂覆到一个阱（最多10个96孔板上），允许单个样品中⁴种不同的蛋白质的同时定量。最近这种技术已被用来衡量促炎细胞因子的血清^5,6。从MSD多重板媲美其他多重检测平台^7。

我们使用MSD作为主要的试验平台，进一步开....

Protocol

1。 Uniplex cMyBP C含量

1. 前一天实验，大衣96以及MSD裸的标准板捕获抗体。对于-C cMyBP，使用的浓度为5微克/毫升稀释于磷酸盐缓冲盐水（PBS）30μl的体积的小鼠单克隆抗cMyBP-C抗体（明胶免费）。
2. 由于是疏水性的，吸液管的解决方案以及入下角，然后点击两侧的板块，传播的解决方案，在整个井。
3. 板封口板覆盖着，在4°C孵育O / N无晃动。
4. 卸下捕获抗体溶液，攻解掉在水槽上方，然后在一叠纸巾。板的非特异性结合是通过加入150微升的5％（重量/体积）的阻断剂（高档BSA）的PBS溶液，以每孔阻塞。
5. 密封板，在室温下孵育1小时，，一阵晃动在700转。
6. 在阻塞的步骤，准备的标准和amples。标准系列的起始浓度为2000纳克/毫升，以1％（W / V）阻滞剂A / PBS稀释重组cMyBP-C蛋白片段（氨基酸1 - 271）。然后连续阻滞剂在1％（W / V）的A / PBS稀释5倍。共有7标准+ 1空白（1％（W / V）阻滞剂A / PBS单独）使用。
7. 取出封闭溶液，并，洗板3倍与150微升的0.05％（体积/体积）Tween-20/PBS。每一次，取出洗净液反相板水槽上方。第三次洗涤步骤后，大力滑动板在水槽上方，并大力拍打板一层纸巾，直到完全干燥。这是关键的一步，孵化量小，任何剩余洗涤液，将大大稀释下孵化。
8. 吸取25微升样品和标准入井。密封板，并在RT下孵育....

Results

3复杂的检测的基本原理和工作流程示于图1，表1中记载的总体工作流程。 uniplex检测沿相同的原理工作的整个底部与捕获抗体以及涂覆除外。信号的检测是通过ECL的电信号被施加到井的底部。这反过来SULFO-TAG标签检测抗体的读缓冲区通过化学反应，将启动一个本地生产的光。这导致了低背景和高灵敏度的检测。在图2中的cMyBP-C在uniplex检测的标准曲线比较的cMyBP中的C 3-plex的测定。这两种检测方法表现出很高的灵敏度和高动态范围。检测水平和量化水平如表2所示，在两个uniplex 3复杂的检测是可比较的。 cTnI和CK-MB的检测水平是ALSö在图3和表2所示。运营商间的变化决定通过测量相同的样品（n = 2时，3个技术复制），由两个不同的运营商和变异被发现低（CV 8.5％）。与其他两个校准器的检测抗体的交叉反应性进行了研究孵育所有这三个校准器与单一的检测抗体（ 图4）的各标准曲线。只有低量CK-MB之间的校准和cT.......

Discussion

在这项研究中，我们表明多个心脏生物标记物的检测患者血清中的多重免疫测定法的适用性。这种技术有许多优点，比传统的ELISA。首先，使用ECL检测试剂盒中​​的，而不是比色检测。在ECL，电信号刺激当地生产的测量属性（光），从而解偶联信号的刺激事件，从而降低背景^14。这允许高灵敏度，可以看出在表2中。

复用不会导致检测的敏感度的降低，用于检测的cMyBP C，在图2和表2中可以看出。 cMyBP-C测量uniplex，表现出的敏感性和检测范围比较到cMyBP-C同时测定CK-MB和cTnI ^13。的同时测量大幅减少所需的样品量测量 -日ts罕见的生物样品中，工作时，以及减少的时间，它可以是一个关键因素，使用了运行多个uniplex检测。

正如任何免疫测定法，该法是高度依赖于所用的抗体的质量。的捕获和检测抗体的亲和性，特异性和亲和力测定¹⁵的灵敏度的主要决定因素。应该.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
试剂
MSD Read-Buffer T （4X） 含表面活性剂	Meso Scale Discovery	R92TC-2
吐温-20	阿科罗斯	9005-64-5
MSD Blocker A	Meso Scale Discovery	R93BA-1
磷酸盐缓冲盐水，10X	Fisher BioReagents	BP399-4	使用前过滤
球蛋白结合蛋白 C 抗体，小鼠单克隆抗体 （E7），不含明胶	Santa Cruz	SC-137180L	对于包被，抗体必须不含
板和设备
多阵列 96 孔标准板	Meso Scale Discovery	L15XA-3
带有 cMyBP-C、cTnI 和 CK-MB 中尺度发现的原型 3 重、四点、96 孔板		N452A-1
ThermaSeal Sealing Film	Life Science Products Inc. 公司	ST-3098
MSD SECTOR Imager 2400A	中观尺度发现
MTS 2/4 数字微量滴定摇床	IKA	3208001