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在厌氧环境中培养与维持 Clostridium difficile

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DOI：

10.3791/50787

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2013年9月14日

 ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, Emory University School of Medicine

本文内容

摘要

Clostridium difficile 是一种专性厌氧的致病菌，可引起抗生素相关性腹泻（AAD）。本文介绍了分离、培养和保藏 C. difficile 营养细胞及芽孢的方法。这些技术需要使用厌氧室，且需定期维护，以确保为 C. difficile 的最佳培养提供适宜条件。

摘要

艰难梭菌 是一种革兰氏阳性、厌氧、产孢的细菌，主要导致抗生素相关性腹泻（AAD），并是一种重要的医院获得性病原体。 艰难梭菌 以极难分离和培养著称，且对环境中即使很低水平的氧气也极为敏感。本文介绍了从样本中分离 C. difficile 从粪便样本中分离并随后培养 C. difficile 用于制备长期保存的甘油菌种的方法已给出。文中还描述了在实验室中制备和计数孢子悬液的技术，适用于包括显微镜观察和动物研究在内的多种下游应用。这些技术需要使用厌氧工作站，以维持稳定的厌氧环境，确保艰难梭菌最佳生长所需的适宜条件 C. difficile 生长。我们提供了在不引起显著氧气污染的前提下将材料移入和移出厌氧舱的操作方案，以及为维持适宜的厌氧环境以实现高效且稳定的 C. difficile 培养

引言

艰难梭菌 是一种革兰氏阳性、可形成孢子的细菌，为专性厌氧菌，可导致人和动物发生潜在致命的胃肠道感染。该菌于1935年首次被描述，当时作为一种在新生儿粪便样本中发现的共生生物1, C. difficile 后来被证实是与抗生素治疗相关的假膜性结肠炎的致病因子2. C. difficile 感染（CDI）通常发生在抗生素治疗之后，抗生素会破坏正常的结肠菌群，从而为艰难梭菌的定植创造生态位 C. difficile 生长繁殖2. C. difficile 通过粪-口途径以休眠芽孢的形式传播，随后在胃肠道内萌发，产生能够生成多种毒素的营养细胞，引发严重疾病和结肠炎3. 艰难梭菌感染常对常规治疗产生耐药性，且这些感染常反复发作4因此，艰难梭菌感染（CDI）在美国造成的医疗费用高达48亿美元。5-7.

C. difficile 即使在极低氧气浓度的环境中也极为敏感。为了使 C. difficile 能够在环境中长期存活并实现从宿主到宿主的有效传播，形成代谢不活跃的芽孢至关重要8。由于在实验室中对 C. difficile 的培养和操作需要严格控制的无氧环境，这些技术必须使用厌氧工作站。厌氧工作站的应用已显著提高了专性厌氧菌的回收率和分离效率9-11，并使得多种分子生物学技术能够在无氧条件下进行。

除了 C. difficile 外，此处所述的厌氧工作站的使用与维护方法也适用于其他专性厌氧菌，例如其他梭菌属物种（如 C. perfringens）、其他胃肠道菌种（如 Bacteroides 属物种12）以及牙周病原菌（如 Peptostreptococcus 属物种13）。

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方案

注意：C. difficile 是一种可引起胃肠道疾病的动物和人类病原体。涉及 C. difficile 的实验必须在适当的生物安全条件下进行（BSL-2）。

1. 厌氧培养箱的使用与维护

C. difficile 是一种严格厌氧菌，对大气中即使很低浓度的氧气也极为敏感。因此，对其进行成功操作需要一个受控的厌氧环境。使用厌氧培养箱（图1A）可提供最稳定的环境，是有效培养C. difficile及其他厌氧菌的理想条件14。在此环境中，可稳定维持含有混合气体（5% CO2、10% H2、85% N2）的大气。

为将物品引入厌氧舱且不造成显著的氧气污染，必须使用气闸舱（图1B）。该装置作为气体交换通道，可自动、半手动或手动运行。气闸舱具有两扇门：一扇通向气闸舱外部，另一扇通向厌氧舱内部。根据型号不同，气闸舱可能配备第三扇门，可用于连接相邻的厌氧舱，从而节省单独配置气闸舱的成本。除非正在将物品移入或移出舱体，否则两扇门应始终关闭，以避免氧气污染。气闸舱正面设有电源开关和一个包含四个按钮的控制面板。气体管路和真空泵软管连接于气闸舱后部，靠近用于设备完全手动操作的开关面板处。建议在用混合气体（5% CO2、10% H2、85% N2）填充交换舱之前，先使用氮气（N2）进行两次 purge 循环，以减少进入厌氧舱的氧气量。此外，切勿将任一舱门开启时间超过物品进出所必需的时间，并应仔细规划实验以减少物品进出厌氧舱的频率。以下概述了乙烯基厌氧舱的不同操作程序。在执行这些操作规程前，请确保其与随舱提供的制造商说明兼容。

  1. 自动模式
    此模式可编程且可自定义，完全由气闸舱自动执行。如需对气闸舱进行编程，请参考制造商的说明。推荐用于常规进入厌氧舱的程序包括：使用氮气进行两次抽真空-充气循环，随后用与厌氧舱内气氛相近的混合气体重新填充气闸舱。在每次抽真空循环中，标准出厂程序建议将真空度抽至 20 inHg，并用气体冲洗至 1 inHg。
    1. 确保内侧气闸门完全关闭。
    2. 打开外侧气闸门。
    3. 将物品放入气闸舱并关闭外侧气闸门。若放入液体，应将瓶盖拧松约半圈，以确保高效的气体交换。密封包装和容器应在开始循环前打开；否则可能导致塑料器皿和容器变形或损坏。为维持无菌状态，仅需将包装打开至足以实现有效气体交换的程度即可。
    4. 按下“开始”按钮。
    5. 等待气闸舱完成整个程序，直至显示屏显示“Anaerobic”（厌氧）。
    6. 打开内侧气闸门。
    7. 将物品移入厌氧舱内。
    8. 关闭内侧门。
  2. 半手动模式
    此模式可用于将物品移入或移出厌氧舱，且在需要对厌氧舱内部气体进行循环置换时必须使用。
    1. 确保内侧气闸门完全关闭。
    2. 打开外侧气闸门。
    3. 将物品放入气闸舱并关闭外侧气闸门。若放入液体，应将瓶盖拧松约半圈，以确保高效的气体交换。密封包装（如接种环和96孔板）必须在开始循环前打开。
    4. 按下“菜单”（Menu）按钮。
    5. 按下“开始”（Start）按钮。此时气闸舱将显示各按钮的功能，且在完成此步骤前不会响应其他操作：
      • 上箭头：启动真空泵。
      • 下箭头：启动氮气（冲洗）气流。
      • 开始：启动混合气体气流。
      • 菜单：返回默认显示界面。
    6. 按下“上”（Up）按钮，从气闸舱中抽气，直至显示屏读数为 20 inHg。
    7. 按下“下”（Down）按钮，向气闸舱中充入氮气，直至显示屏读数低于 1 inHg。注意不要超过此值，否则会在气闸舱内产生正压，可能影响其结构完整性。
    8. 重复步骤 6 和 7，完成第二次冲洗循环。
    9. 按下“上”（Up）按钮，抽真空至显示屏读数为 20 inHg。
    10. 按下“开始”（Start）按钮，向气闸舱中充入混合气体，直至显示屏读数低于 1 inHg。
    11. 打开内侧气闸门。
    12. 将物品移入厌氧舱内。
    13. 关闭内侧门。
  3. 手动模式
    当自动或半手动模式无法工作，或气闸舱断电时，可使用此模式。此模式在气闸舱通电时无法使用，因此难以准确判断气闸舱内的压力。由于抽真空时间和气体冲洗时间分别取决于真空泵和气体的流速，因此必须在气闸舱内使用压力表来监测压力，以降低人员受伤和设备损坏的风险。
    1. 确保内侧气闸门完全关闭。
    2. 打开外侧气闸门。
    3. 将物品（包括压力表）放入气闸舱，并关闭外侧气闸门。若放入液体，应将瓶盖拧松约半圈，以确保高效的气体交换。密封包装（如接种环和96孔板）必须在开始循环前打开。
    4. 找到位于气闸舱背面标有“Manual Control Switches”（手动控制开关）的三个开关，它们分别标记为：
      • To Vacuum（抽真空）
      • Nitrogen（氮气）
      • Gas Mix（混合气体）
    5. 拨动“To Vacuum”（抽真空）拨动开关，直至压力表读数约为 20 inHg。
    6. 拨动“Nitrogen”（氮气）拨动开关，直至压力表读数约为 1 inHg。
    7. 再次拨动“To Vacuum”（抽真空）拨动开关，直至压力表读数约为 20 inHg。
    8. 再次拨动“Nitrogen”（氮气）拨动开关，直至压力表读数约为 1 inHg。
    9. 第三次拨动“To Vacuum”（抽真空）拨动开关，直至压力表读数约为 20 inHg。
    10. 拨动“Gas Mix”（混合气体）拨动开关，直至压力表读数约为 1 inHg。
    11. 打开内侧气闸门。
    12. 将物品移入厌氧舱内。
    13. 关闭内侧门。

2. 从粪便样本中培养、计数和保存 C. difficile

本方案旨在回收 C. difficile 从含有芽孢的粪便样本中分离艰难梭菌，并将分离的菌落作为营养细胞或芽孢以甘油冻存液的形式进行长期保存。此外，本实验方案也可用于定量测定 C. difficile 存在于粪便样本中（例如 来自动物研究）。为了选择性且差异性地富集 C. difficile，使用牛磺胆酸盐-头孢西丁-环丝氨酸-果糖琼脂（TCCFA）抑制正常粪便菌群的生长15-16环丝氨酸对革兰氏阴性菌具有抑菌作用，而头孢西丁则更广泛地抑制革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌的生长，但以下例外： C. difficile 以及大多数肠球菌菌株。培养基中可添加pH指示剂中性红，因为果糖发酵会导致pH降低，从而使颜色由红/橙色变为黄色。为有效回收芽孢 C. difficile 作为营养细胞，使用胆盐牛磺胆酸钠诱导萌发17-18。因为 C. difficile 形成芽孢，可对样本进行酒精或加热处理以减少或消除营养细胞，限制杂菌群的生长，从而提高分离效率 C. difficile 复苏19如上所述，使用前必须在厌氧环境中预先还原所有平板至少1-2小时，以确保去除残留氧气。在厌氧舱内使用前将平板进行风干，可减少冷凝现象。液体培养基的还原可能需要长达24小时，具体时间取决于所用容器的体积及气液接触面积。

开始之前，应将以下物品放入厌氧工作站：

  • 粪便样本
  • 无菌拭子
  • 无菌接种环
  • 1× PBS（见材料）
  • TCCFA 平板（见材料）
  • BHIS（含酵母提取物的脑心浸液培养基）平板和液体培养基（见材料）
  • 50% 甘油（已灭菌）
  • 10% L-半胱氨酸（已灭菌）
  • 冷冻储存管

*或者，可将分离的菌落涂布于BHIS琼脂平板上，随后刮下并重悬于含15%甘油的BHIS液体培养基中，于-80°C长期保存。**需要注意的是，革兰染色法不能有效用于直接从粪便样本中鉴定C. difficile23；必须首先将C. difficile从粪便中存在的其他菌群中分离出来。

  1. 将粪便样本重悬于1×PBS中（可在有氧条件下进行），并通过涡旋确保粪便样本在1×PBS中充分重悬。若需对粪便中的艰难梭菌（C. difficile）进行计数，应在加入1×PBS前称量粪便样本的质量。
  2. 用1×PBS对重悬后的粪便样本进行系列稀释，以用于分离或计数每克粪便中的菌落形成单位（CFU）。
  3. 采用无菌操作技术，取每种系列稀释液100 μl接种至TCCFA平板上。
  4. 使用一系列无菌接种环，将接种物划线以获得单个分离菌落，或均匀涂布于TCCFA平板表面以进行菌落计数。
  5. 将平板置于厌氧条件下，37 °C培养48小时。根据菌落扁平、不规则、呈磨砂玻璃样的特征，可在24小时内初步检测并识别艰难梭菌（C. difficile）菌落15，但48小时后的鉴定和计数结果更为准确。
  6. 使用无菌接种环，将疑似艰难梭菌（C. difficile）的菌落转接至预先还原的含0.03% L-半胱氨酸的BHIS琼脂平板上20。挑取单个菌落，使用新的无菌接种环按四区划线法进行划线，以获得单个分离菌落。或者，在有氧条件下对各稀释度的艰难梭菌（C. difficile）菌落进行计数，并计算每克粪便样本中的菌落形成单位数量。
  7. 通过革兰染色确认艰难梭菌（C. difficile）的鉴定结果。革兰染色后，艰难梭菌（C. difficile）呈紫色杆状，部分细胞可能含有末端芽孢。通过聚合酶链式反应（PCR）检测编码毒素B的基因可进一步确认产毒株的艰难梭菌（C. difficile）21，而多位点序列分型（MLST）可用于未知菌株及非产毒株艰难梭菌（C. difficile）的鉴定与准确分型22。
  8. 为在-80 °C保存艰难梭菌（C. difficile）菌种，使用无菌接种环从BHIS琼脂平板上挑取单个分离菌落，并将其重悬于10 ml含0.03% L-半胱氨酸的预先还原的BHIS液体培养基中。*
  9. 在37 °C厌氧条件下过夜培养，直至培养物变浑浊。
  10. 向1.8 ml冻存管中加入333 μl 50%甘油和666 μl艰难梭菌（C. difficile）培养物，制备成含15%甘油的分离菌株冻存液。
  11. 拧紧冻存管盖，充分混匀后立即将菌种从厌氧舱中取出，并置于-80 °C冰箱中长期保存。

3. 从冻存甘油菌种中培养 C. difficile

本实验方案用于从 -80 °C 保存的甘油菌种中复苏 C. difficile。由于反复冻融可能杀死营养细胞，因此必须始终将甘油菌种保持在冷冻状态。我们不建议使用干冰在厌氧舱内外转移菌株，因为干冰挥发会改变舱内环境。建议使用冷冻冷却架在运输过程中保持甘油菌种的冷冻状态。出于不同的选择性和鉴别目的，培养 C. difficile 常用三种培养基。如前所述，TCCFA 对 C. difficile 具有选择性，并含有作为萌发剂的牛磺胆酸钠。添加酵母提取物的脑心浸液（BHIS）是一种常用的富集型非选择性培养基，可支持多种微生物的生长（图 2A）24。通常在 BHIS 中添加 L-半胱氨酸作为还原剂20。最后，在培养基中添加血液（图 2B）比 TCCFA 更有利于高效产孢，并可在长波紫外光（UV）下观察到 C. difficile 所特有的淡绿色或黄绿色荧光15（图 2C）。从芽孢菌种培养 C. difficile 时，必须注意在培养基中添加牛磺胆酸钠以确保芽孢萌发。

开始之前，应将以下物品放入厌氧培养箱中：

  • 冻存甘油菌种（置于冷却架中）
  • 无菌接种环
  • TCCFA 或 BHIS 平板（见材料部分）
  • BHIS 液体培养基（见材料部分）
  • 50% 甘油（已灭菌）
  • 冻存管
  1. 将冻存的 C. difficile 甘油菌种置于冷却架中，该冷却架应预先在 -80 °C 条件下保存，以防止菌种融化。
  2. 将装有冻存甘油菌种的干冰带入厌氧培养箱中。
  3. 采用无菌操作技术，用无菌接种环取少量菌种接种于平板上，并在平板的一个象限内划线。
  4. 将平板旋转 90°，使用新的无菌接种环继续在第二个象限内划线。
  5. 重复上述操作，依次完成第三和第四象限的划线，以确保获得单菌落。
  6. 立即将冻存甘油菌种从厌氧培养箱中取出，并放回 -80 °C 保存。
  7. 将平板置于 37 °C 厌氧条件下过夜培养。过夜生长后应可观察到单个分离的菌落。

4. 从 C. difficile 中纯化芽孢

由于芽孢形成是艰难梭菌在富氧环境中存活以及有效传播疾病所必需的8，因此通常需要制备芽孢悬液，用于包括显微镜检查和动物实验在内的多种下游应用。需要注意的是，为确保计数结果的可重复性，芽孢计数必须进行多次重复。此外，在连续稀释过程中反复吹打数次，可减少因芽孢易黏附于塑料器皿表面而造成的损失。

C. difficile 的产孢过程不如其他产孢菌种迅速或均一。为优化芽孢的产生与回收，建议使用产孢培养基（SMC）17,25 或 70:30 培养基26。其他常用培养基包括 BHIS，该培养基需培养 4–5 天后方可观察到有效产孢27；以及 Clospore 液体培养基，在培养 72 小时后可产生高滴度的芽孢（每毫升 107–108 个芽孢）。其他方案中使用冰冻水而非 1× PBS20；然而，等渗溶液的使用可减少芽孢之间的聚集以及芽孢在塑料表面的黏附。此外，部分研究人员采用蔗糖梯度进一步纯化芽孢，以彻底去除营养细胞和碎片29。

开始之前，应将以下物品放入厌氧工作站：

  • 无菌接种环
  • BHIS、SMC 和/或 70:30 平板（见材料部分）
  • BHIS 肉汤（见材料部分）
  • 1× PBS，过滤除菌（见材料部分）
  1. 将冻存的甘油菌种接种于预先还原的 BHIS 平板上，在 37 °C 厌氧条件下过夜培养。
  2. 在多个预先还原的 SMC 或 70:30 平板上重新划线，并在 37 °C 厌氧条件下培养 24–48 小时。可通过相差显微镜观察孢子形成情况：孢子呈亮相，而营养细胞和母细胞呈暗相。*作为替代方法，可在培养 24–48 小时后从 70:30 液体培养基中纯化孢子，每毫升可获得 105–106 个孢子，具体产量取决于所用菌株。
  3. 使用无菌接种环刮取平板上的菌体，并将菌体重悬于 10 ml 无菌 1× PBS 中。
  4. 弃去平板，将孢子悬液移出厌氧舱。在 3,000 × g 离心 15 分钟以收集菌体，随后用 1× PBS 洗涤两次，每次均需充分重悬菌体沉淀。
  5. 在 4 °C 下孵育过夜，以促进营养细胞和母细胞的裂解。
  6. 在 70 °C 下孵育 20 分钟，以杀死任何残留的营养细胞。
  7. 为测定每毫升的菌落形成单位（CFU），将各孢子悬液用 1× PBS 进行系列稀释后，涂布于含 0.1% 牛磺胆酸钠的 BHIS 培养基上。至少培养 24 小时后计数菌落。
  8. 孢子可在 1× PBS 中长期保存于室温或 4 °C。若保存于 4 °C，使用前可在 55 °C 加热 15 分钟，以恢复其高效的萌发能力。

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结果

在 BHIS 和哥伦比亚厌氧羊血琼脂培养基上培养的 C. difficile 示例见图2。C. difficile 在两种培养基上均形成不规则、扁平且具有磨砂玻璃样外观的菌落。此处，一种对红霉素敏感的 C. difficile 临床分离株 630E30 在 BHIS 琼脂（一种富集型非选择性培养基）上于 37 °C 培养 24 小时后生长（图2A）。在白光下观察，哥伦比亚厌氧羊血琼脂上的菌落形态与 BHIS 上的相似（图2B）；然而，使用该培养基还可通过长波紫外光（UV）检测 C. difficile 所表现出的淡绿色或黄绿色荧光15（图2C）。TCCFA 琼脂上的 C. difficile 菌落形态与 BHIS 琼脂上的生长情况类似。由于 TCCFA 培养基中含有两种抗生素，因此需培养 48 小时后方可进行菌落计数。

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讨论

本文所述方法可从多种粪便样本（包括人、小鼠和仓鼠）中简便快速地分离出 C. difficile，并可制备甘油或芽孢冻存液，实现 C. difficile 的长期保存。C. difficile 是一种较难培养的微生物，但通过严格维持厌氧环境并应用无菌操作技术，可实现其良好生长并减少污染。

厌氧室：注意事项与维护

厌氧培养箱有两种类型：刚性培养箱和乙烯基培养箱。刚性培养箱通常由铝或刚性聚合物（例如 聚甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸材料）制成，可耐受腐蚀性化学品。刚性培养箱可改装为无手套式操作，且不易被刺穿；然而，漏气点难以检测和定位，且在使用过程中需要某种方法来补偿气体置换带来的影响。聚合物材质的培养箱通常配备仅用于吹扫的传递舱，其运行成本可能更高。综合考虑严格大气环境的维持、成本、灵活性、实验室空间需求以及维护便捷性，推荐使用乙烯基厌氧培养箱（Coy Laboratory Products，图1A）。该厌氧培养箱由一个乙烯基手套操作箱构...

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致谢

我们感谢Coy Laboratories慷慨提供厌氧舱的照片。本研究工作得到了美国国立卫生研究院基金DK087763（S.M. M.）以及STEP/HHMI课程开发奖学金（A.N. E.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蛋白胨2号BD212120
Na2高倍视野4FisherS373
KH2PO4FisherBP362
NaClFisherS27
MgSO₄4 （无水）FisherM65
D-果糖FisherL96
牛磺胆酸钠SigmaT4009
D-环丝氨酸SigmaC6880
头孢西丁FlukaC4786
脑心浸液培养基BD237300
蛋白胨BD211684
（NH4)2SO4SigmaA5132
Tris 碱FisherBP152
琼脂BD214010
L-半胱氨酸SigmaC7755
BactoPeptoneBD211684
哥伦比亚羊血琼脂FisherL21928
NaClFisherS27
KClFisherP217
甘油FisherBP2291
无菌接种环Fisher22363596
无菌拭子Fisher1495990
Coy Vinyl 厌氧室及配件Coy Laboratory Products, Inc客户指定这些物品根据实验室需求定制订购
材料
TCCFA 琼脂

蛋白胨 2 号（Difco）40 g
Na2高倍视野4 5 g
KH2PO4 1 g
NaCl 2 g
MgSO₄4 （无水）0.1 g
果糖 6 g
琼脂 20 g

用去离子水定容至 1 L，121 ℃高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。

高压灭菌后，加入：
10 ml 10% (w/v) 牛磺胆酸钠，滤膜除菌（溶于水；终浓度为 0.1%）
25 ml 10 mg/ml D-环丝氨酸，过滤除菌（溶于水；终浓度 250） μg/ml
1.6 ml 10 mg/ml 头孢西丁，滤膜除菌（溶于水；终浓度 16 μg/ml

BHIS 培养基

脑心浸液 37 g
酵母提取物 5 g

对于平板，加入 15 g 琼脂，用去离子水定容至 1 L，121 ℃ 高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。

可选（高压灭菌后添加）：

3 ml 10% (w/v) L-半胱氨酸（溶于水；终浓度为 0.03%）
10 ml 10% (w/v) 牛磺胆酸钠（溶于水；终浓度为 0.1%）

SMC 芽孢形成培养基

BactoPeptone 90 g
蛋白胨 5 g
(NH4)2SO4 1 g
Tris 碱 1.5 g
琼脂 15 g

用去离子水定容至 1 L，121 ℃ 高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。

可选（高压灭菌后添加）：
3 ml 10% (w/v) L-半胱氨酸（溶于水；终浓度为 0.03%）

70:30 培养基

BactoPeptone 63 g
蛋白胨 3.5 g
脑心浸液 11.1 g
酵母提取物 1.5 g
（NH4)2SO4 0.7 g
Tris 碱 1.06 g

对于平板，加入 15 g 琼脂，用去离子水定容至 1 L，于 121 ℃高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。高压灭菌后，加入 3 ml 10% (w/v) L-半胱氨酸（终浓度为 0.03%）。

血琼脂

使用预制的哥伦比亚厌氧羊血琼脂平板（Fisher Scientific，L21928）35 建议采用。

1×磷酸盐缓冲液（PBS）

NaCl 8.01 g
KCl 0.2 g
Na2高倍视野4 1.44 g
KH2PO4 0.27 g

用去离子水定容至1 L，用HCl调节pH至7.4。使用前过滤除菌。

参考文献

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