在厌氧环境中培养与维持 Clostridium difficile

摘要

Clostridium difficile 是一种专性厌氧的致病菌，可引起抗生素相关性腹泻（AAD）。本文介绍了分离、培养和保藏 C. difficile 营养细胞及芽孢的方法。这些技术需要使用厌氧室，且需定期维护，以确保为 C. difficile 的最佳培养提供适宜条件。

摘要

艰难梭菌 是一种革兰氏阳性、厌氧、产孢的细菌，主要导致抗生素相关性腹泻（AAD），并是一种重要的医院获得性病原体。 艰难梭菌 以极难分离和培养著称，且对环境中即使很低水平的氧气也极为敏感。本文介绍了从样本中分离 C. difficile 从粪便样本中分离并随后培养 C. difficile 用于制备长期保存的甘油菌种的方法已给出。文中还描述了在实验室中制备和计数孢子悬液的技术，适用于包括显微镜观察和动物研究在内的多种下游应用。这些技术需要使用厌氧工作站，以维持稳定的厌氧环境，确保艰难梭菌最佳生长所需的适宜条件 C. difficile 生长。我们提供了在不引起显著氧气污染的前提下将材料移入和移出厌氧舱的操作方案，以及为维持适宜的厌氧环境以实现高效且稳定的 C. difficile 培养

引言

艰难梭菌 是一种革兰氏阳性、可形成孢子的细菌，为专性厌氧菌，可导致人和动物发生潜在致命的胃肠道感染。该菌于1935年首次被描述，当时作为一种在新生儿粪便样本中发现的共生生物¹, C. difficile 后来被证实是与抗生素治疗相关的假膜性结肠炎的致病因子². C. difficile 感染（CDI）通常发生在抗生素治疗之后，抗生素会破坏正常的结肠菌群，从而为艰难梭菌的定植创造生态位 C. difficile 生长繁殖². C. difficile 通过粪-口途径以休眠芽孢的形式传播，随后在胃肠道内萌发，产生能够生成多种毒素的营养细胞，引发严重疾病和结肠炎³. 艰难梭菌感染常对常规治疗产生耐药性，且这些感染常反复发作⁴因此，艰难梭菌感染（CDI）在美国造成的医疗费用高达48亿美元。^5-7.

C. difficile 即使在极低氧气浓度的环境中也极为敏感。为了使 C. difficile 能够在环境中长期存活并实现从宿主到宿主的有效传播，形成代谢不活跃的芽孢至关重要⁸。由于在实验室中对 C. difficile 的培养和操作需要严格控制的无氧环境，这些技术必须使用厌氧工作站。厌氧工....

方案

注意：C. difficile 是一种可引起胃肠道疾病的动物和人类病原体。涉及 C. difficile 的实验必须在适当的生物安全条件下进行（BSL-2）。

1. 厌氧培养箱的使用与维护

C. difficile 是一种严格厌氧菌，对大气中即使很低浓度的氧气也极为敏感。因此，对其进行成功操作需要一个受控的厌氧环境。使用厌氧培养箱（图1A）可提供最稳定的环境，是有效培养C. difficile及其他厌氧菌的理想条件¹⁴。在此环境中，可稳定维持含有混合气体（5% CO₂、10% H₂、85% N₂）的大气。

为将物品引入厌氧舱且不造成显著的氧气污染，必须使用气闸舱（图1B）。该装置作为气体交换通道，可自动、半手动或手动运行。气闸舱具有两扇门：一扇通向气闸舱外部，另一扇通向厌氧舱内部。根据型号不同，气闸舱可能配备第三扇门，可用于连接相邻的厌氧舱，从而节省单独配置气闸舱的成本。除非正在将物品移入或移出舱体，否则两扇门应始终关闭，以避免氧气污染。气闸舱正面设有电源开关和一个包含四个按钮的控制面板。气体管路和真空泵软管连接于气闸舱后部，靠近用于设备完全手....

结果

在 BHIS 和哥伦比亚厌氧羊血琼脂培养基上培养的 C. difficile 示例见图2。C. difficile 在两种培养基上均形成不规则、扁平且具有磨砂玻璃样外观的菌落。此处，一种对红霉素敏感的 C. difficile 临床分离株 630E³⁰ 在 BHIS 琼脂（一种富集型非选择性培养基）上于 37 °C 培养 24 小时后生长（图2A）。在白光下观察，哥伦比亚厌氧羊血琼脂上的菌落形态与 BHIS 上的相似（图2B）；然而，使用该培养基还可通过长波紫外光（UV）检测 C. difficile 所表现出的淡绿色或黄绿色荧光¹⁵（图2C）。TCCFA 琼脂上的 C. difficile 菌落形态与 BHIS 琼脂上的生长情况类似。由于 TCCFA 培养基中含有两种抗生素，因此需培养 48 小时后方可进行菌落计数。

讨论

本文所述方法可从多种粪便样本（包括人、小鼠和仓鼠）中简便快速地分离出 C. difficile，并可制备甘油或芽孢冻存液，实现 C. difficile 的长期保存。C. difficile 是一种较难培养的微生物，但通过严格维持厌氧环境并应用无菌操作技术，可实现其良好生长并减少污染。

厌氧室：注意事项与维护

厌氧培养箱有两种类型：刚性培养箱和乙烯基培养箱。刚性培养箱通常由铝或刚性聚合物（例如 聚甲基丙烯酸甲酯或丙烯酸材料）制成，可耐受腐蚀性化学品。刚性培养箱可改装为无手套式操作，且不易被刺穿；然而，漏气点难以检测和定位，且在使用过程中需要某种方法来补偿气体置换带来的影响。聚合物材质的培养箱通常配备仅用于吹扫的传递舱，其运行成本可能更高。综合考虑严格大气环境的维持、成本、灵活性、实验室空间需求以及维护便捷性，推荐使用乙烯基厌氧培养箱（Coy Laboratory Products，图1A）。该厌氧培养箱由一个乙烯基手套操作箱构.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蛋白胨2号	BD	212120
Na2高倍视野4	Fisher	S373
KH2PO4	Fisher	BP362
NaCl	Fisher	S27
MgSO₄4 （无水）	Fisher	M65
D-果糖	Fisher	L96
牛磺胆酸钠	Sigma	T4009
D-环丝氨酸	Sigma	C6880
头孢西丁	Fluka	C4786
脑心浸液培养基	BD	237300
蛋白胨	BD	211684
（NH4)2SO4	Sigma	A5132
Tris 碱	Fisher	BP152
琼脂	BD	214010
L-半胱氨酸	Sigma	C7755
BactoPeptone	BD	211684
哥伦比亚羊血琼脂	Fisher	L21928
NaCl	Fisher	S27
KCl	Fisher	P217
甘油	Fisher	BP2291
无菌接种环	Fisher	22363596
无菌拭子	Fisher	1495990
Coy Vinyl 厌氧室及配件	Coy Laboratory Products, Inc	客户指定	这些物品根据实验室需求定制订购
材料
TCCFA 琼脂 蛋白胨 2 号（Difco）40 g Na2高倍视野4 5 g KH2PO4 1 g NaCl 2 g MgSO₄4 （无水）0.1 g 果糖 6 g 琼脂 20 g 用去离子水定容至 1 L，121 ℃高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。 高压灭菌后，加入： 10 ml 10% (w/v) 牛磺胆酸钠，滤膜除菌（溶于水；终浓度为 0.1%） 25 ml 10 mg/ml D-环丝氨酸，过滤除菌（溶于水；终浓度 250） μg/ml 1.6 ml 10 mg/ml 头孢西丁，滤膜除菌（溶于水；终浓度 16 μg/ml BHIS 培养基 脑心浸液 37 g 酵母提取物 5 g 对于平板，加入 15 g 琼脂，用去离子水定容至 1 L，121 ℃ 高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。 可选（高压灭菌后添加）： 3 ml 10% (w/v) L-半胱氨酸（溶于水；终浓度为 0.03%） 10 ml 10% (w/v) 牛磺胆酸钠（溶于水；终浓度为 0.1%） SMC 芽孢形成培养基 BactoPeptone 90 g 蛋白胨 5 g (NH4)2SO4 1 g Tris 碱 1.5 g 琼脂 15 g 用去离子水定容至 1 L，121 ℃ 高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。 可选（高压灭菌后添加）： 3 ml 10% (w/v) L-半胱氨酸（溶于水；终浓度为 0.03%） 70:30 培养基 BactoPeptone 63 g 蛋白胨 3.5 g 脑心浸液 11.1 g 酵母提取物 1.5 g （NH4)2SO4 0.7 g Tris 碱 1.06 g 对于平板，加入 15 g 琼脂，用去离子水定容至 1 L，于 121 ℃高压灭菌 °C 下灭菌 20 分钟。高压灭菌后，加入 3 ml 10% (w/v) L-半胱氨酸（终浓度为 0.03%）。 血琼脂 使用预制的哥伦比亚厌氧羊血琼脂平板（Fisher Scientific，L21928）35 建议采用。 1×磷酸盐缓冲液（PBS） NaCl 8.01 g KCl 0.2 g Na2高倍视野4 1.44 g KH2PO4 0.27 g 用去离子水定容至1 L，用HCl调节pH至7.4。使用前过滤除菌。