研究相互作用 金黄色葡萄球菌 通过流式细胞术和延时显微镜检测中性粒细胞

摘要

我们介绍了利用流式细胞术和荧光显微镜研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的PSMs及其他毒素对中性粒细胞影响的方法。

摘要

我们介绍了研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生和分泌的酚溶性调节蛋白（PSMs）及其他毒素对中性粒细胞作用的方法。为了研究PSMs对中性粒细胞的影响，我们通过密度梯度离心法分离新鲜的中性粒细胞。这些中性粒细胞被加载一种在钙离子动员时可产生荧光的染料。PSMs激活中性粒细胞后，会引发细胞内游离钙离子浓度迅速而短暂的升高。在流式细胞术实验中，可通过检测预先加载的染料荧光信号来监测游离Ca²⁺浓度升高所引发的快速钙动员过程。利用该方法，我们可以确定激活中性粒细胞所需的PSM浓度，并评估特异性或广谱性抑制剂对中性粒细胞激活的影响。

为了研究 PSM 在细胞内空间的表达情况，我们构建了 PSMα 操纵子启动子与 GFP 的报告融合体。当这些 S. aureus 报告菌株被中性粒细胞吞噬后，可通过荧光显微镜观察到其表达的诱导。

引言

中性粒细胞（PMNs）是专职的吞噬细胞，在先天免疫应答中对抗病原体发挥关键作用 金黄色葡萄球菌 ¹宿主与微生物之间持续的斗争导致了双方的军备竞赛。近年来，社区相关性（CA）耐甲氧西林 S. aureus 已出现一些似乎能高效逃避中性粒细胞杀伤的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） ^2,3CA-MRSA 过度产生酚可溶性调节蛋白（PSMs）与更高毒力相关 ^4,5人类中性粒细胞可通过FPR2识别这些PSM，从而激活该G蛋白偶联受体 ⁶。其中一个最早发生的事件是细胞内钙（Ca²⁺钙²⁺ 作为多种中性粒细胞效应功能（包括脱颗粒和吞噬作用）的第二信使 ⁷。因此 Ca²⁺ 是评估PSMs激活中性粒细胞功能活性的非常敏感的指标。为研究PSMs对中性粒细胞的作用，需分离新鲜的中性粒细胞，并加载一种在钙离子动员时可产生荧光的染料。通过流式细胞术实验，可检测这种快速的钙离子动员过程。利用该方法，能够研究毒性物质及其他组分对中性粒细胞的直接作用，并确定其发挥活性的最低浓度。对我们而言，该方法是研究多种由微生物产生的蛋白质对中性粒细胞影响的有力工具。 S. aureus 参与免疫逃逸的蛋白，例如FPR2抑制蛋白（FLIPr） ⁸, FLIPr样 ⁷和趋化抑制蛋白 金黄色葡萄球菌 (CHIPS) ⁹所有这些蛋白质均通过结合识别激动剂的受体，抑制中性粒细胞中的钙动员。

最近，我们的研究团队已报道，PSM 可被血清脂蛋白在功能上抑制¹⁰。这些脂蛋白在血液和人体组织中大量存在，表明 PSM 主要在细胞内环境中发挥其功能。钙动员实验的建立使我们能够精确测量血清脂蛋白对 PSM 激活中性粒细胞的影响，极低浓度血清即可产生显著抑制作用，证实了这一点。

由于PSM在血清中会受到功能抑制，我们推测PSM可能作为细胞内毒素发挥重要作用。因此，我们试图明确PSM在被吞噬后的功能。为了研究PSM在细胞内空间的表达情况，我们构建了将psmα操纵子启动子与GFP融合的报告系统。当这些S. aureus报告菌株被中性粒细胞吞噬后，可通过荧光显微镜观察到其表达被诱导¹⁰。显然，该技术可用于研究S. aureus或其他病原体在被吞噬后大量基因的表达情况。由于S. aureus在细胞内生态位中存活对于逃逸先天免疫系统至关重要^{11 10 12}，因此研究在此生态位中被激活的基因功能，对于理解其致病机制具有重要意义。

方案

1. 通过密度梯度离心法从人血液中分离中性粒细胞

1. 采集5管9 ml肝素抗凝的静脉血。
2. 制备双层Ficoll密度梯度（每5管血液需制备4个梯度），步骤如下：在50 ml离心管中加入12 ml密度为1.119 g/ml的Ficoll溶液，然后小心地在其上方叠加10 ml密度为1.077 g/ml的Ficoll溶液。
3. 用等体积的PBS稀释血液。
4. 将稀释后的血液小心地铺在双层Ficoll梯度上，每层梯度加20–25 ml。
5. 在22 °C条件下，以396 × g离心20分钟，使用水平转子，不启用刹车。
6. 配制含0.05%人血清白蛋白的冷RPMI培养基（RPMI-HSA）。同时准备9 ml无菌去离子H₂O。将RPMI-HSA和H₂O均预冷于冰上。
7. 使用真空泵吸除含有血浆（黄色）和PBMC的上层Ficoll层，以及下层白色Ficoll层（使用无菌吸头连接移液器操作）。
8. 用小型塑料移液管收集中性粒细胞（PMNs）至50 ml离心管中（每2个梯度的PMN组分收集至1管），并立即置于冰上。
9. 加入冷RPMI-HSA至终体积50 ml，于4 °C以249 × g离心10分钟。
10. 使用真空泵吸除上清液，轻轻涡旋沉淀（含红细胞和PMNs）。
11. 加入9 ml无菌去离子H₂O并启动计时器。精确30秒后，立即加入1 ml 10倍浓度的PBS以终止高渗休克。注意：30秒时间极为关键。
12. 加入冷RPMI-HSA至终体积50 ml，于4 °C以249 × g离心10分钟。
13. 使用真空泵吸除上清液，将PMN沉淀用确定体积（1–2 ml）的RPMI-HSA重悬并收集至1个离心管中。
14. 测定细胞数量，并调整细胞浓度至1×10⁷ 个细胞/ml。根据供体不同，每9 ml血液可分离获得的PMN产量通常介于5×10⁶ 至3×10⁷ 个之间。

2. 人中性粒细胞钙离子动员的流式细胞术检测

1. 加载细胞（5 × 10⁶ 细胞/ml）与2 μM Fluo-3-AM在RPMI-HSA中混合，于室温下缓慢振荡孵育20分钟（例如使用摇床），避光操作。
2. 同时，准备一系列稀释液（例如 刺激物在最终浓度的10倍浓度下使用（3倍稀释）。本方案中使用PSMα3；但任何作用于中性粒细胞的GPCR刺激物均适用。
3. 在 RPMI-HSA 中配制 10 倍浓度的受体抑制剂。当抑制剂作用于刺激物时（例如 HDL 与 PSMα3）将25 μl刺激物与等体积的抑制剂在室温下预孵育10分钟。
4. 加入 10 ml RPMI-HSA 洗涤细胞，室温下以 249 × g 离心。将细胞重悬至 5 × 10⁶ cells/ml
5. 实验前，将细胞稀释至2x10⁶ 细胞/ml 的 RPMI-HSA 中，并向每支流式管中加入 200 μl 细胞悬液。稀释后的中性粒细胞非常脆弱，在此浓度下放置过久会导致自发激活；剧烈振荡或移液操作同样会引发激活。
6. 将管子连接到流式细胞仪，等待3秒后开始采集。经过固定时间后（例如 8秒后，取下管子，迅速向样品中加入50 μl刺激物。立即将管子重新装回样品架并继续采集数据。
7. 从最低浓度开始，以最高浓度结束刺激。每次运行后，使用 RPMI-HSA 定期清洗流式细胞仪针头。
8. 使用流式细胞术分析软件分析数据。比较刺激物添加前后的平均荧光信号，并利用适当的阳性和阴性对照，计算每种测定稀释度下的激活强度。

或者，当抑制剂作用于受体时，可先将细胞与抑制剂预孵育。

3. 中性粒细胞吞噬后细菌GFP表达的荧光显微镜分析

1. 在肉汤培养基中过夜培养含有目标报告基因构建体的S. aureus菌株（如需维持报告质粒，则加入抗生素）。本实验中使用含有PSMα-GFP报告基因构建体的MW2菌株¹⁰，在50 ml塑料管中加入5 ml LB培养基进行培养。
2. 为清除过夜表达产生的全部GFP，将培养物稀释至OD₆₆₀为0.01，培养至OD₆₆₀达到0.1。再将该培养物按1:30比例重新稀释，监测其生长直至OD₆₆₀达到0.1。通过离心收集细菌，并用DPBS洗涤一次。用原体积1/10的缓冲液重悬，使菌液OD₆₆₀达到1.0，约相当于5.10⁸ CFU/ml。
3. 在1.5 ml微量离心管中，将细菌（1.10⁷/ml）与新鲜分离的中性粒细胞（PMNs，1.10⁶/ml）按10:1比例混合于RPMI-HSA中，并加入混合人血清至终浓度10%。在37 °C条件下于摇床上振荡10分钟，以诱导吞噬作用。将载有细菌的PMNs稀释至5.10⁵ PMNs/ml，取250 μl加入8孔腔室载玻片的一个孔中。
4. 在显微镜下观察含有细菌的PMNs。建议使用配备40X/0.85 NA物镜的倒置显微镜，并置于黑暗环境培养舱内，以维持稳定的37 °C环境。通过相机每隔5–10分钟在明场和GFP荧光通道中对多个预设位置采集图像，以实时追踪GFP的表达情况。

结果

用于评估人中性粒细胞钙离子动员的流式细胞术检测

将中性粒细胞与一系列浓度的合成PSMα3共同孵育，通过钙流测定发现其可迅速激活中性粒细胞，表现为FL-1信号增强。图1显示，合成PSMα3预先与0.01%、0.1%或1%人血清孵育后，诱导钙流的能力显著受到抑制。

利用荧光显微镜分析中性粒细胞吞噬后细菌中GFP的表达

含有PSMα-GFP报告构建体的细菌在被吞噬后1至2小时开始发出绿色荧光¹⁰，表明PSMα启动子已启动表达。中性粒细胞外的细菌不产生荧光，或仅在胞外细菌形成致密的微菌落后才出现荧光（图2）。这些数据表明，当细菌被中性粒细胞（PMNs）吞噬后，PSMα的表达迅速被激活。

讨论

在本文所述方法中，某些步骤非常关键。我们将在此强调这些步骤。

通过密度梯度离心法分离中性粒细胞时，重要的是在离心过程中及离心结束后均不得扰动各层。使用塑料移液管吸取中性粒细胞时，注意在细胞层内不要挤压吸球，以免液体排出扰动各层。此外，在渗透休克及离心步骤后，应肉眼检查中性粒细胞沉淀。如果沉淀仍呈红色，说明红细胞裂解不够充分，需再重复一次裂解步骤。若此情况频繁发生，可将去离子 H₂O 的孵育时间延长最多五秒，以实现更彻底的红细胞裂解。

对于钙动员方法而言，使用新鲜分离的中性粒细胞至关重要。通常，冷藏保存时间过长的细胞反应会减弱。这些细胞可能已经发生激活，导致所添加刺激物的作用效果降低，或者已经死亡而完全不产生反应。中性粒细胞出现明显聚集是细胞不再新鲜的标志，应予以弃用。

在显微镜实验设置中，有几个关键因素需要注意。为了能够观察到细菌内部绿色荧光蛋白（GFP）的增加，必须通过多次稀释步骤并在目标基因表达水平极低或完全不表达的条件下进行培养，从而将原...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	密度 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	密度 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	含 25 mM HEPES 和 L-谷氨酰胺
Leica TCS SP5 显微镜	Leica Microsystems, 荷兰	TCS SP5	物镜：HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	测量过程中必须能够取出并重新放回试管