研究相互作用 金黄色葡萄球菌 通过流式细胞术和延时显微镜检测中性粒细胞

摘要

我们介绍了利用流式细胞术和荧光显微镜研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分泌的PSMs及其他毒素对中性粒细胞影响的方法。

摘要

我们介绍了研究金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）产生和分泌的酚溶性调节蛋白（PSMs）及其他毒素对中性粒细胞作用的方法。为了研究PSMs对中性粒细胞的影响，我们通过密度梯度离心法分离新鲜的中性粒细胞。这些中性粒细胞被加载一种在钙离子动员时可产生荧光的染料。PSMs激活中性粒细胞后，会引发细胞内游离钙离子浓度迅速而短暂的升高。在流式细胞术实验中，可通过检测预先加载的染料荧光信号来监测游离Ca²⁺浓度升高所引发的快速钙动员过程。利用该方法，我们可以确定激活中性粒细胞所需的PSM浓度，并评估特异性或广谱性抑制剂对中性粒细胞激活的影响。

为了研究 PSM 在细胞内空间的表达情况，我们构建了 PSMα 操纵子启动子与 GFP 的报告融合体。当这些 S. aureus 报告菌株被中性粒细胞吞噬后，可通过荧光显微镜观察到其表达的诱导。

引言

中性粒细胞（PMNs）是专职的吞噬细胞，在先天免疫应答中对抗病原体发挥关键作用 金黄色葡萄球菌 ¹宿主与微生物之间持续的斗争导致了双方的军备竞赛。近年来，社区相关性（CA）耐甲氧西林 S. aureus 已出现一些似乎能高效逃避中性粒细胞杀伤的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA） ^2,3CA-MRSA 过度产生酚可溶性调节蛋白（PSMs）与更高毒力相关 ^4,5人类中性粒细胞可通过FPR2识别这些PSM，从而激活该G蛋白偶联受体 ⁶。其中一个最早发生的事件是细胞内钙（Ca²⁺钙²⁺ 作为多种中性粒细胞效应功能（包括脱颗粒和吞噬作用）的第二信使 ⁷。因此 Ca²⁺ 是评估PSMs激活中性粒细胞功能活性的非常敏感的指标。为研究PSMs对中性粒细胞的作用，需分离新鲜的中性粒细胞，并加载一种在钙离子动员时可产生荧光的染料。通过流式细胞术实验，可检测这种快速的钙离子动员过程。利用该方法，能够研究毒性物质及其他组分对中性粒细胞的直接作用，并确定其发挥活性的最低浓度。对我们而言，该方法是研究多种由微生物产生的蛋白质对中性粒细胞影响的有力工具。 S. aureus 参与免疫逃逸的蛋白，例如FPR2抑制蛋白（FLIPr） ⁸, FLIPr样 ⁷和趋化抑制蛋白 金黄色葡萄球菌....

方案

1. 通过密度梯度离心法从人血液中分离中性粒细胞

1. 采集5管9 ml肝素抗凝的静脉血。
2. 制备双层Ficoll密度梯度（每5管血液需制备4个梯度），步骤如下：在50 ml离心管中加入12 ml密度为1.119 g/ml的Ficoll溶液，然后小心地在其上方叠加10 ml密度为1.077 g/ml的Ficoll溶液。
3. 用等体积的PBS稀释血液。
4. 将稀释后的血液小心地铺在双层Ficoll梯度上，每层梯度加20–25 ml。
5. 在22 °C条件下，以396 × g离心20分钟，使用水平转子，不启用刹车。
6. 配制含0.05%人血清白蛋白的冷RPMI培养基（RPMI-HSA）。同时准备9 ml无菌去离子H₂O。将RPMI-HSA和H₂O均预冷于冰上。
7. 使用真空泵吸除含有血浆（黄色）和PBMC的上层Ficoll层，以及下层白色Ficoll层（使用无菌吸头连接移液器操作）。
8. 用小型塑料移液管收集中性粒细胞（PMNs）至50 ml离心管中（每2个梯度的PMN组分收集至1管），并立即置于冰上。
9. 加入冷RPMI-HSA至终体积50 ml，于4 °C以249 × g离心10分钟。
10. 使用真空泵吸除上清液，轻轻涡旋沉淀（含红细胞和PMNs）。
11. 加入9 ml无菌去离子H₂O并启动计....

结果

用于评估人中性粒细胞钙离子动员的流式细胞术检测

将中性粒细胞与一系列浓度的合成PSMα3共同孵育，通过钙流测定发现其可迅速激活中性粒细胞，表现为FL-1信号增强。图1显示，合成PSMα3预先与0.01%、0.1%或1%人血清孵育后，诱导钙流的能力显著受到抑制。

利用荧光显微镜分析中性粒细胞吞噬后细菌中GFP的表达

含有PSMα-GFP报告构建体的细菌在被吞噬后1至2小时开始发出绿色荧光¹⁰，表明PSMα启动子已启动表达。中性粒细胞外的细菌不产生荧光，或仅在胞外细菌形成致密的微菌落后才出现荧光（图2）。这些数据表明，当细菌被中性粒细胞（PMNs）吞噬后，PSMα的表达迅速被激活。

讨论

在本文所述方法中，某些步骤非常关键。我们将在此强调这些步骤。

通过密度梯度离心法分离中性粒细胞时，重要的是在离心过程中及离心结束后均不得扰动各层。使用塑料移液管吸取中性粒细胞时，注意在细胞层内不要挤压吸球，以免液体排出扰动各层。此外，在渗透休克及离心步骤后，应肉眼检查中性粒细胞沉淀。如果沉淀仍呈红色，说明红细胞裂解不够充分，需再重复一次裂解步骤。若此情况频繁发生，可将去离子 H₂O 的孵育时间延长最多五秒，以实现更彻底的红细胞裂解。

对于钙动员方法而言，使用新鲜分离的中性粒细胞至关重要。通常，冷藏保存时间过长的细胞反应会减弱。这些细胞可能已经发生激活，导致所添加刺激物的作用效果降低，或者已经死亡而完全不产生反应。中性粒细胞出现明显聚集是细胞不再新鲜的标志，应予以弃用。

在显微镜实验设置中，有几个关键因素需要注意。为了能够观察到细菌内部绿色荧光蛋白（GFP）的增加，必须通过多次稀释步骤并在目标基因表达水平极低或完全不表达的条件下进行培养，从而将原.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Fluo-3, AM	Molecular Probes / Life Technologies	F-1241
Ficoll-Paque	GE Healthcare	17-5442-03	密度 1.077 g/ml
Histopaque	Sigma	11191	密度 1.119 g/ml
RPMI 1640	Gibco, Life Technologies	52400-025	含 25 mM HEPES 和 L-谷氨酰胺
Leica TCS SP5 显微镜	Leica Microsystems, 荷兰	TCS SP5	物镜：HCX PL APO 40x/0.85
FACSCalibur	BD Biosciences	FACSCalibur	测量过程中必须能够取出并重新放回试管