当将BTBR T+ Itpr3tf/J（BTBR）小鼠置于铺有足够木屑垫料的测试笼中时，会表现出一种高度重复的同步挖掘动作，称为“尺蠖样运动”。该操作是对幼年期社会互动实验方案的改良，用于评估与自闭症谱系障碍相关的重复性运动刻板行为。
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本文内容
摘要
摘要
自闭症谱系障碍（Autism Spectrum Disorder, ASD）是一种行为定义的神经发育障碍，其特征为社交互动减少、沟通异常以及具有局限兴趣的重复性行为。由于该病的诊断基于临床标准，因此对于这种异质性障碍，理想的啮齿类动物模型应尽可能重现这些多样的行为特征。BTBR T+ Itpr3tfBTBR小鼠是自闭症谱系障碍（ASD）的一种成熟动物模型，表现出重复性行为（如过度理毛）以及认知灵活性缺陷。在社会互动与兴趣方面，幼年玩耍测试已被广泛应用于多种ASD啮齿类动物模型中。本文结果显示，当BTBR小鼠在铺有木屑垫料的幼年社会互动箱中进行测试时，会表现出一种重复性的同步挖掘动作。这种重复性运动行为被称为 "尺蠖运动，" 因其小鼠在水平穿越垫料时表现出的刻板运动特征而得名。进行尺蠖样运动的小鼠必须同步使用前肢和后肢来移动垫料，完成至少一次向内和一次向外的动作。尽管BTBR和C56BL/6J（B6）小鼠均表现出这种行为，但BTBR小鼠的尺蠖样运动持续时间更长、频率更高，且在放入垫料环境后开始尺蠖样运动的潜伏期更短。我们得出结论：这种新描述的行为可作为衡量自闭症谱系障碍（ASD）动物模型中重复性运动刻板行为的简便指标。
引言
尽管自闭症谱系障碍（ASD）的病理生理机制尚不明确，但其诊断依赖于三大类核心症状的存在：异常的社会互动、沟通能力受损以及重复/刻板行为1。大多数啮齿类动物模型无法在单个动物中同时再现这三种症状。因此，能够稳定模拟该疾病部分或全部特征的模型，对于开发有效的预防和治疗策略具有重要价值。BTBR小鼠模型正是能够表现出ASD全部三种特征的模型之一1,2。
结合超声波发声和社会接近实验，幼年期社会互动测试常用于表征儿童自闭症谱系障碍（ASD）的小鼠模型；这些测试可评估减少或异常的社会行为，而这些行为正是ASD的核心特征。除了幼年期社会互动测试外，还有多种其他测试被用于测量ASD动物模型中的刻板行为。例如，弹珠埋藏测试通过观察动物使用吻部和前爪移动垫料以覆盖物体的倾向，被认为可反映由厌恶刺激引发的强迫性刻板行为3,4。因此，挖掘测试已被应用于量化ASD动物模型以及不同啮齿类物种中的此类重复性行为3,5-7。挖掘行为被定义为吻部或爪子明显地、有目的地移动垫料材料的动作，被认为可能是重复性运动行为的一个敏感指标4。
本文报道了一种在BTBR品系小鼠中发现的新型挖掘行为，我们将其命名为“"尺蠖样运动"”。对这种新行为的表征可能为重复性运动行为提供一种可靠的测量指标，可用于进一步验证如自闭症谱系障碍（ASD）、亨廷顿病或强迫症行为等啮齿类动物模型8,9。我们将“"尺蠖样运动"”定义为：前肢和后肢至少发生一次同步向内移动，随后发生一次同步向外移动，从而导致垫料发生位移。该行为在多个方面不同于典型的挖掘行为。首先，尺蠖样运动通常表现为一系列连续发生的 episodes，而非单一孤立事件；相比之下，典型挖掘行为可表现为后肢或前肢单独的一次协调性动作3。此外，尺蠖样运动倾向于在饲养盒底部水平方向进行，而挖掘行为则通常发生在固定位置。最后，如下文所述，尺蠖样运动在BTBR近交系小鼠中频繁出现，但在B6对照品系中极为罕见；而典型的挖掘行为在B6和BTBR品系小鼠中均较为常见10。本研究中所述的尺蠖样运动检测流程是对标准幼年期社会互动实验方案1的改良。
鉴于大理石埋藏、挖掘和幼年期玩耍行为已被证实可用于测量自闭症谱系障碍（ASD）小鼠模型中的异常行为，尺蠖样移动行为补充了这些既往定义的刻板行为测量方法。特别是，尺蠖样移动行为为ASD中常见的低级运动刻板行为提供了有效的评估指标8,11。此外，这一新的尺蠖样移动实验方法可能为研究人员提供一种有价值的额外工具，用于分析与ASD等发育障碍相关的重复性运动行为。
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方案
所有操作均按照加拿大动物护理委员会的规定进行，并经卡尔加里大学动物护理委员会批准。
1. 动物准备
- 在测试前将小鼠隔离过夜（12 小时）。具体操作为：在测试前一天，将所有用于实验分析的 BTBR 和 B6 小鼠（P35-P40）单独放入笼中饲养。
- 在测试前 30 分钟，将已隔离的小鼠置于行为分析室内，使其适应新环境。
2. 仪器准备
- 将带有可拆卸盖子的 30 x 30 cm 有机玻璃箱放置于测试室内。将箱子置于桌面上，并将摄像机定位在底部 45° 角的位置；此摄像机位置可清晰观察到整个箱底及小鼠。使用红外背光以尽量减少箱壁反光造成的眩光。
- 使用具备高倍变焦功能和红外成像能力的摄像机，以优化低照度环境下的拍摄效果。将摄像机对准实验箱并放大图像，使小鼠在整个箱体范围内的活动均能被清晰捕捉。
- 用木屑垫料完全覆盖箱体底部（厚度约为 1 英寸）。
3 测试流程
- 将同品系小鼠对（BTBR - BTBR 或 B6 - B6）放入测试 enclosure 中。
- 关闭测试房间的灯光。
- 启动摄像机开始录像，然后离开房间，以避免实验人员对小鼠行为产生干扰。记录时长为 11 分钟。
- 录像结束后，重新进入测试房间，将小鼠放回其原始的饲养笼中。
- 丢弃木屑垫料，用 70% 乙醇彻底清洗整个测试箱，并在测试 enclosure 底部铺上新的木屑垫料。
- 对剩余的同品系配对小鼠重复整个操作流程，并将小鼠放回其原始的饲养笼中。
注意：为了验证尺蠖样运动数据的可靠性，可在后续几天使用不同的BTBR-BTBR和B6-B6配对组合重复该实验。这将确保所观察到的行为依赖于围栏中表现出尺蠖样运动的个体本身，而非其特定的配对伙伴。
4. 数据分析
- 尺蠖样运动定义为动物前肢和后肢同步地向内和向外移动，且至少发生一次向内移动及随后的向外移动，从而有效移动垫料。手动观看每段视频两次（每只小鼠一次），以确定在10分钟视频中尺蠖样运动的总持续时间、频率以及首次出现该行为的潜伏期。对尺蠖样运动的持续时间、频率和潜伏期的手动评分应依据以下定义：
尺蠖样运动持续时间：指每只小鼠进行尺蠖样运动行为所花费的总时间。为评估该指标，使用可启停的计时器。当小鼠开始尺蠖样运动时启动计时器，停止运动时停止计时器。若小鼠再次开始尺蠖样运动，则重新启动并再次停止计时器。在整个10分钟观察期间，每次小鼠出现尺蠖样运动均需重复启停计时器。最终得到的尺蠖样运动持续时间评分范围为0:00至10:00分钟。
尺蠖样运动频率：指小鼠在10分钟观察期内进行尺蠖样运动行为的次数。每当小鼠开始并结束一次尺蠖样运动，即计为一次。尺蠖样运动频率评分范围为0至∞。
尺蠖样运动潜伏期：指首次出现尺蠖样运动前经过的时间。视频开始时启动计时器（此时为0:00），当小鼠首次进行尺蠖样运动时停止计时器。若小鼠在整个观察期间未表现出尺蠖样运动，则其潜伏期记为10:00。在分析尺蠖样运动潜伏期时，所得评分范围为0:01至10:00分钟。对于在整个测试期间均未表现出尺蠖样运动的小鼠，应从样本群体中剔除，以确保结果仅针对表现出该行为的小鼠群体。 - 计算视频中每只小鼠尺蠖样运动的总频率和总持续时间。计算该对小鼠中第一只小鼠出现尺蠖样运动所需的时间，作为该对小鼠的尺蠖样运动潜伏期。这些参数基于先前关于小鼠重复挖掘行为的方法学研究6。
- 计算分析中各实验组（例如 BTBR 与 B6）的平均运动持续时间、频率和挖掘潜伏期。采用方差分析（ANOVA）或t检验对不同品系/实验组之间的数据进行比较。
注意：若该实验在第二天重复进行，应使用重复测量方差分析（repeated measures ANOVA），以确保排除后续试验效应或配对效应的影响。
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结果
本文所述的幼鼠玩耍测试改良版本可用于观察和分析一种被称为“尺蠖样运动”的新型重复性挖掘行为。BTBR小鼠表现出的尺蠖样运动远多于B6对照组小鼠。在典型的10分钟测试中，BTBR小鼠会持续表现出明显的尺蠖样运动行为（双前肢同步地向内和向外移动，试图拨开木屑垫料），持续时间约为5分钟，即观察时长的一半。此外，BTBR小鼠开始尺蠖样运动的潜伏期显著更短——通常在记录开始后的前10秒内即开始该行为。相比之下，对照组小鼠（B6）的平均潜伏期为4分钟，且实际表现出该行为的时间极短。这些结果与先前关于啮齿类动物重复性挖掘行为的研究数据相似3,6。
图1展示了测试程序的正确实验设置。图2显示了BTBR小鼠与对照B6品系小鼠的平均尺蠖样运动持续时间（A）、频率（B）以及发生尺蠖样运动的潜伏期（C）。各参数在两个品系之间均存在显著差异。在本研究报道的实验中，尺蠖样运动测试在为期2天的试验期内进行，第二天采用交替配...
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讨论
尺蠖样运动是一种研究刻板行为的新指标，可用于研究多种表现出刻板行为的疾病，例如自闭症谱系障碍（ASD）。通过改进的幼鼠社交互动实验方案获得可靠的尺蠖样运动数据，需严格遵循以下四个关键步骤：1）延长的隔离期对于尺蠖样运动测试至关重要，不得从实验方案中删除或缩短。此要求特指本文所述的成对小鼠测试条件。2）摄像机必须准确定位并聚焦，以确保在整个聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）实验箱内均可清晰观察到小鼠的全部活动。3）每对小鼠测试结束后，必须彻底清洁实验箱，以避免前一对小鼠留下的气味影响当前小鼠的行为表现。4）实验箱内的垫料必须充足（约1英寸厚），且必须使用木屑；当垫料过少或无垫料，或使用其他类型垫料时，小鼠不会表现出尺蠖样运动行为。
尽管本文未作描述，但我们观察到，在非隔离、群养的BTBR小鼠被单独（而非成对）置于类似的垫料饲养环境时，会出现尺蠖样运动行为。在这些条件下，BTBR小鼠仍会表现出尺蠖样运动，但其发生频率和持续时间较低，表明该行为可能是一种由社交焦虑诱发的刻板行为（数据未显示）。然而，由于已有研究未能稳定地证明BTBR小鼠与B6对照小鼠在焦虑水平上存在差异，因此焦虑可能...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Rose Tobias、Younghee Ahn和David N. Ruskin提供的技术、后勤支持与专业指导。本研究工作由阿尔伯塔儿童医院基金会和阿尔伯塔儿童医院研究所资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 30 cm × 30 cm 有机玻璃箱，带盖 | 可自行制作 | ||
| 红外相机 | Survshop（加拿大阿尔伯塔省卡尔加里） | Sony CCD Camera DP955V- 30’ 红外防护半球型相机 | 选择具有高分辨率和变焦功能的相机 |
| 数字视频录像机（DVR） | Supercircuits（美国德克萨斯州奥斯汀） | BLACK 企业级 4 通道 H.264 安防 DVR，带 DVD 刻录机 | 高数据存储容量 |
| 木屑 | 与垫料材料相同 |
参考文献
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重印与许可
