本文描述了冷冻分析电子显微镜在生理学定义的生物样本中，以亚细胞分辨率对总钙含量及其分布进行定量测量的应用。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了利用电子探针显微分析（EPMA）技术对细胞内元素含量进行定量测量所适用的工具、技术和仪器。由于线粒体钙超载在神经退行性疾病中具有关键作用，本文特别关注线粒体内钙的检测。该方法基于在电子显微镜（EM）中，电子束与样品相互作用所产生的X射线分析。为了在电子显微镜样品中保持可扩散元素的天然分布状态，EPMA要求 "冷冻固定" 组织的快速冷冻，随后制备超薄冷冻切片。培养细胞或类器官切片培养物的快速冷冻分别通过浸入液态乙烷或撞击冷冻至低温金属块上进行。使用金刚石刀在干燥条件下切割名义厚度为80 nm的冷冻切片 ca-160 °C下，置于碳膜/皮奥洛膜包被的铜网上，使用专用冷冻样品 holder 将样品冷冻转移至冷冻电镜中。在 ≤-160 °C 条件下以低电子剂量进行初步观察和位置定位后，将冷冻水合的冷冻切片在 -100 °C 下冷冻干燥约 30 分钟。利用慢扫描 CCD 相机以低剂量条件记录干燥后冷冻切片的细胞器水平图像，并选取感兴趣的亚细胞区域用于后续分析。通过固定、聚焦、高强度电子束照射样品，由能量色散 X 射线（EDX）谱仪收集感兴趣区域（ROIs）发射的 X 射线信号，经配套电子系统处理后生成 X 射线能谱图，即 X 射线强度随能量变化的图谱。配套软件可进一步实现：1）根据特征峰识别各元素成分 "特征" 峰值能量和指纹特征；以及通过提取峰面积/背景进行的定量分析。本文最后给出了两个实例，说明了电子探针显微分析（EPMA）的典型应用：其中一个实例通过线粒体钙分析为兴奋性毒性损伤机制提供了关键见解，另一个实例则揭示了缺血抗性的基础机制。
引言
钙离子可以说是生物学中最为重要且多功能的细胞信号分子，在突触传递和基因表达等多种正常生理过程中发挥着关键作用。另一方面，钙离子在细胞死亡过程中同样具有重要作用。特别是，钙稳态失调是中风、帕金森病、阿尔茨海默病及其他神经退行性疾病中神经元损伤的关键因素3,5。因此，定量理解钙离子在细胞内的分布方式，以及生理或病理刺激后这种分布如何变化，具有极其重要的意义。这一目标的实现较为复杂，原因在于钙离子在两种物理状态之间动态分布——游离于溶液中或与底物结合——并且细胞内钙浓度在受到刺激后会发生跨越多个数量级的变化。
尽管已有多种先进方法可用于游离细胞内钙的分析，但对特定细胞内区室中总钙浓度的测定实际上仅限于一种方法，即电子探针显微分析（EPMA）。EPMA 是一种将X射线光谱仪与透射电子显微镜（TEM）联用的技术。TEM的电子枪将一个固定的亚微米级电子束聚焦于感兴趣的亚细胞区域，由电子轰击引发的元素特异性X射线被收集并进行分析（详见参考文献7,4的技术综述）。EPMA的优点包括单个细胞器水平的分辨率和亚毫摩尔级的检测灵敏度。然而在实际操作中，EPMA需要专门的低温技术及设备用于样品制备与分析。本文介绍了适用于采用EPMA测定细胞内钙含量的工具、技术和仪器。由于线粒体钙超载在神经退行性疾病中具有关键作用，线粒体内钙浓度尤其受到关注。
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方案
本文所述方法基于特定的仪器、工具和软件开发而成。由于各实验室可能采用不同的实验装置，因此在可能的情况下，该方法已进行了通用化处理。
1. 快速冷冻
下述分析方法完全依赖于低温技术，主要体现在两个方面：1）以定量保存细胞或组织中可扩散组分及化学元素在冻结瞬间的分布状态为目标，对细胞或组织进行"冷冻固定"；2）制备适用于透射电子显微镜（TEM）成像与分析的超薄冷冻切片。此处仅简要描述这些技术，而其他实验室若要重复本实验流程所需的具体细节已超出本文范围。感兴趣的读者可参考近期优秀的相关文献9,14。
注意：本节描述了液态乙烷的使用，液态乙烷高度易燃且可能爆炸；应采取适当预防措施。操作者还必须熟悉液氮（LN₂）的特性与安全操作规程。2）安全防护措施，包括防护实验服、护目镜和耐低温手套。注意：此处及全文中，所有工具（镊子、 等等。用于处理冷冻样本的器械必须在液氮中预冷2 使用前避免意外解冻。
载玻片上的培养细胞
- 通过在液氮中将气态乙烷冷却至 -160 °C 来制备冷冻固定装置2冷却的中心井。使用时加液至刻度线，并在不使用时用可旋转的铝盖盖住井口。
- 使用滤纸楔形片在实验所需的适当条件下吸去培养细胞塑料盖玻片上的液体，保留一层极薄的水膜。应从边缘开始吸液，避免接触组织；理想的残留液膜需通过反复试验确定，应尽可能薄，但不可过薄以致蒸发导致组织表面干燥。
- 用持镊夹住盖玻片边缘，迅速将其浸入液态乙烷中，可手动操作，也可使用重力驱动的推杆装置。
- 将冷冻的盖玻片放入附近盛有液氮的泡沫塑料碗中2，大到足以将所需数量的盖玻片放入长期储存容器中。铝制螺旋盖罐在液氮中不会卡死2 建议。
培养脑切片的快速冷冻
- 在解剖显微镜下观察并定位海马器官型脑片，保持其未受扰动且仍附着于培养膜插件的状态。使用黑色记号笔在脑片边缘附近的膜上标记定位点，并拍照记录。
- 在显微镜下继续操作，用刀片切出约 5 × 5 mm 的膜片小方块，每个方块中央包含一个脑片切片。操作过程中避免触碰切片或弯曲膜片。
- 安装膜支撑的脑片，底部垫以¼英寸的缓冲物 直径琼脂垫，置于定制的 专为冷冻超薄切片机（下文所述）设计的铝盘，通过气动方式将切片快速推向液氮以实现迅速冷冻2-通过定制的冷却蓝宝石块 "速冻" 设备
- 按照培养细胞所述方法转移至储存。
2. 冷冻切片
注意：成功制备超薄切片的干切条带虽然步骤直接且合乎逻辑，但需要经过训练、耐心以及大量练习。
- 使用配备冷冻附件的冷冻超薄切片机进行烘烤并冷却至 -135 °C
- 用预冷的锋利解剖刀将冷冻的盖玻片切成约 3 x 3 mm 的正方形。将带有培养物的一面朝上，嵌入黏性液体中 "冷冻胶" 乙醇与2-丙醇按1:6比例混合 11），在标准3 直径为 mm 的铝针，设计用于适配切片机的样品夹。避免将冷冻胶泄漏到培养表面。通过将冷冻箱温度降至 ≤ -160 °C 使冷冻胶固化。
- 对于冷冻脑切片，使用螺纹套环将圆盘牢固地固定在自制的样本夹头上。
- 修整冷冻样本的选定区域 - 例如 使用金刚石修块工具，将盖玻片碎片或切片上细胞密集区域或已识别区域修整为约 250 × 250 μm 的块面，并切至约 100 μm 深度。
- 切取薄片的干切条带于 约 -160 °C 下使用35°钻石冷冻刀进行切割，基本方法如参考文献所述4,9切割速度和刀具间隙角通过经验确定；合适的起始参数为0.4–0.6 mm/sec，间隙角为9°。名义厚度， 即 样品推进速度为80 nm，适用于水合切片，尽管实际切片厚度通常为理论值的1.5–2.0倍，主要由于压缩所致。为获得满意的切片效果，必须使用防静电装置。将电离探针置于距刀刃0.5–1 cm处，并调节输出功率，直至形成理想的连续切片条带。
- 使用环氧树脂将睫毛粘附到木制涂药棒上，制备睫毛探针。利用该探针从刀背拾取超薄切片，并将其转移至放置在折叠铟箔包膜上、位于刀后工作台处的载网表面。所述载网为100目可折叠铜网，其表面覆有经辉光放电处理的碳支持膜及皮奥洛型（pioloform）膜。将载网及包膜的上半部分折叠压合，用低温压片工具压紧。
- 将包裹好的载网转移至合适的载网盒中，并按步骤1.4所述存放在铝罐内。
3. 将样品冷冻转移至电子显微镜
本实验室用于电子探针显微分析（EPMA）的核心仪器是一台工作电压为120 kV的分析型电子显微镜，配备冷冻显微术功能，即具备洁净真空系统、样品区域防污染装置、2k × 2k高灵敏度数字相机以及冷冻转移样品台。使用前需检查显微镜在低倍和高倍模式下的对中状态和运行条件，并确认镜筒真空度良好，理想情况下≤10-7 托。必要时进行调校。
- 确认冷冻 holder 的杜瓦瓶组件真空隔热性能良好，必要时进行抽气。
- 在高真空条件下将冷冻 holder 冷却至其最低温度，至少达到 -160 °C，并断开连接 holder 与其控制箱的电缆。在取出 holder 前，将测角器顺时针倾斜 45°，以尽量减少液氮（LN2）溅出至操作人员和显微镜表面。
- 通过将台式冷冻工作站内置的隔热杯冷却至 ≤160 °C，完成准备工作。
- 迅速将冷却后的冷冻 holder 从显微镜转移至冷冻工作站，然后收回 holder 的防霜罩。
- 在液氮（LN2）环境中取出保存的载网夹心结构，并放置于冷冻工作站的工作台上。同时将一个用于固定 holder 样品井的固定环也放置在台面上。
- 打开铟封套，将其中的折叠载网转移至冷冻 holder 的样品井中。使用配套的扳手工具将固定环拧紧以固定载网，并关闭防霜罩。
- 迅速将冷冻 holder 从冷冻工作站中取出，插入显微镜的气闸中，并尽快完成抽气流程。插入过程中应尽量减少对镜筒真空的干扰。
- 将测角器恢复至 0° 倾斜角度，重新连接并通电控制箱，确认样品温度 ≤150 °C。
- 重新填充样品 holder 的杜瓦瓶，并等待真空和温度完全恢复。
4. 切片的目视观察
- 缩回样品 holder 的防霜罩以暴露样品，并开启电子束。
- 在低倍率（通常为 250X）和低照明条件下目视评估样品。如图 1所示，切片应薄而平整光滑，无折叠或重叠现象，平整且牢固附着于支持膜上，且通常不被载网栅条遮挡。
- 可选择性地对选定切片进行拍照。（注意：尽量减少电子束照射，因为冷冻水合切片极易受到电子束诱导损伤。）使用自动数字测角仪载物台记录选定切片的坐标。
5. 切片的冷冻干燥
- 通过提高样品台温度对切片进行冷冻干燥 约 -100 °C 下约 30 分钟
- 将样品架重新冷却至 -160 °C 或更低温度。
- 成像前，关闭冷冻 holder 控制单元并拔下控制器电缆，以避免因热循环和/或振动干扰导致图像漂移。
6. 细胞与细胞器的成像
冷冻干燥切片的结构图像在以下条件下获得 ca-160 °C下使用由适当软件控制的2k × 2k慢扫描CCD相机记录低剂量、零损失的数字图像。
- 将电子显微镜切换至高倍模式。
- 在高质量切片中选择并成像目标细胞及亚细胞区域（以 TIFF 格式保存，参见图 2），放大倍数约为 2,000X，切片位置应为先前已记录并保存的区域。（注意：干燥后的切片此时已显著增强韧性，不易破损，且对电子束损伤的敏感性降低。）
- 评估图像以选定用于 X 射线分析的兴趣区域（ROIs）。此步骤可选择离线进行，此时可关闭电子显微镜，并使样品恢复至室温。
7. X射线光谱的采集
可以使用多种商用或定制设计的X射线分析系统来记录X射线谱，这些系统至少包含一个能量色散X射线（EDX）探测器、配套的脉冲处理电子设备以及兼容的数据采集和显示软件。（本实验室所用系统的详细信息见表1。）
- 将EDX探测器插入镜筒（如有必要），撤回物镜光阑，并插入杂散辐射光阑并进行居中调整，以配置电镜用于X射线采集。调节冷冻样品杆至尽可能低的温度，以避免样品结霜污染，但温度至少应低于-100 °C。
- 将支架向探测器方向倾斜20°。
- 在宽场成像条件下，若需分析单个线粒体的基质，应选择一个用于分析的线粒体，将其移至视野中央并调焦。
- 进入点模式（在某些显微镜上仅需使用第二聚光镜对焦来会聚电子束），并增加电子束电流至 约 3 nA（使用法拉第杯或类似装置测量）聚焦至100 nm的光斑。
- 启动光谱采集软件，开始进行100秒的采集，采集过程可实时显示在显示器上。保存记录的光谱图2）。首选行业标准的EMSA格式。
- 关闭透射电子显微镜，并将多谱文件转移至（离线）分析工作站。
8. X射线光谱分析
定性分析
能谱（EDX）图谱（图2，插图）本质上是X射线强度相对于能量的x-y图。图谱包含所分析体积内元素组成的定性与定量信息：峰的"特征"能量可用于识别产生该峰的元素，而峰的强度则反映该元素的含量。特征峰叠加在一个缓慢变化的背景——即"连续谱"——之上。（图2的图例进一步讨论了EDX图谱的关键细节。）整个元素周期表中各元素峰群的能量由元素已知的电子结构决定，因此所有EDX软件均连接至一个数据库，可自动识别样品中的成分。在生理学背景下，适合EDX分析且具有普遍研究意义的元素包括Na（Kα峰位于1.04 keV）、P（2.01 keV）、K（3.31 keV）和Ca（3.69 keV）。
- 利用现有的软件数据库和峰匹配程序来识别谱图中的主要元素。在生物样本中，预期会检测到 Na、Mg、P、S、Cl、K、 和 Ca 的峰。（注意：最后两种元素的峰有重叠！）
定量分析
EDX 谱图的定量分析包括提取已识别峰的积分面积，并将该值转换为浓度。在生物学分析中，常用的方法是 Hall 峰/连续谱法4,7,10，该方法利用了连续谱强度（如上所述及图2所示）与分析体积内干质量成正比的特性。因此，将样品峰面积与连续谱面积的比值与已知成分标准样品谱图中的相同比值进行比较，即可确定目标细胞区室中的浓度。需要注意的是，该方法给出的浓度单位为摩尔每质量，通常表示为 mmol/kg 干重。这一单位较为特殊，在解释数据时可能需要进一步换算为其他常用单位，例如 mmol/L 湿重或 mmol/mg 蛋白质，具体换算方法见其他文献4,10。
- 提取原子序数 Z = 10–20（0.5–4.0 keV）范围内生物元素的峰面积（及误差估计） 即 Na、Mg、P、S、Cl、K 和 Ca，使用分析软件内置的其中一种拟合程序（见 表1，尤其是脚注4）。本实验室采用单形法或多元最小二乘法拟合。请注意，该拟合需特别注意解决K和Ca峰之间的重叠问题（参见 图2).
- 在1.45–1.61 keV范围内对连续谱进行积分。也可使用其他无干扰区域。
- 计算峰高/背景比值，然后通过与标准品比较确定浓度。在整个分析过程中传递误差。
- 使用标准的统计软件和公式来估算反映生物变异性的平均值。
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结果
脑细胞通常在缺血条件下因病理性神经递质释放而遭受兴奋性毒性损伤。电子探针显微分析（EPMA）对于揭示神经元线粒体在损伤机制中封存大量钙离子的能力至关重要。下图电子显微照片中 图3 展示经兴奋性毒性刺激暴露30分钟后快速冷冻的培养海马神经元的冷冻干燥冷冻切片中线粒体的形态100 μM NMDA）。大多数线粒体在结构上似乎受到损伤，表现为显著肿胀并含有细小的深色包涵体（红色箭头）。电子探针显微分析（EPMA）具有足够的分辨率，可对线粒体包涵体内部以及排除包涵体之外的基质区域进行元素分析图3，分别对应红色和蓝色光谱）显示，这些包涵体主要由钙和磷组成。这些包涵体的钙含量极高，约为 1,300 mmol/kg 干重，而 <1 mmol/kg 是静息线粒体的典型水平——这解释了其卓越的钙缓冲能力，以及为何该缓冲机制被过度激活会导致钙超载引发的细胞死亡11.
海马体是大脑中对学习和记忆至关重要的区域，也是缺血后主要的损伤部位。有趣且具有治疗意义的是，功能上 distinct 的 CA3 区域对缺血性损...
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讨论
基于电子显微镜的分析方法可实现对多种具有生物学意义的元素（包括 Na、K、P，尤其是 Ca）的检测、鉴定与定量。该分析可在亚细胞水平进行， 即，由于能够定位并鉴定从快速冷冻样品制备的冷冻超薄切片高质量图像中的目标结构，因而可实现细胞器内部的高分辨率观察。需要注意的是，即使在定量保存组织成分位置的情况下，也无需染色即可获得在结构质量上可与传统固定、树脂包埋样品相媲美的电子显微图像。
尽管结构扫描图像在低电子剂量下采集，但需要更高的剂量才能激发出足够计数率的X射线，以获得良好的统计结果。因此，适用于电子探针微区分析（EMPA）的显微镜必须能够形成高电流的聚焦电子束；将2–5 nA的电流聚焦至25–50 nm范围内，足以覆盖内质网池或突触囊泡等细胞器，此参数即可满足要求。这至少需要配备高亮度的六硼化镧电子枪。在此类仪器条件下，对于典型组织浓度为1–10 mmol/kg干重的钙，可在约100秒的实测时间内实现定量分析，标准误差为±0.1 mmol/kg。若非主要的钙X射线谱线与次要的钾谱线发生不幸重叠，钙分析的灵敏度将显著提高；该重叠使得钙信号积分过程中需进行解卷积处理，...
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披露
作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Christine A. Winters女士提供的出色技术支持。本工作由美国国立卫生研究院（NIH）国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）院内研究计划的基础神经科学项目（Z01 NS002610）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂/材料 | |||
| Thermanox 塑料盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | 72280 | |
| 培养插件 | BD Falcon | 353090 | 对于6孔板 |
| 冷冻针 | 徕卡显微系统 | 16701952 | 有凹槽的 |
| 木制涂抹棒 | EM Sciences | 72300 | |
| 折叠电镜载网 | Ted Pella | 4GC100/100 | 100目 |
| 铟箔 | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm 厚 |
| <强>仪器设备 | |||
| 冷冻载网制备装置 | 徕卡显微系统 | KF-80 | |
| Slam冷冻装置 | LifeCell | CF-100 | |
| 超薄切片机 | 徕卡显微系统 | UC6 | |
| 切片机用冷冻附件 | Leica Microsystems | FC6 | |
| 金刚石冷冻修块工具 | 硅藻 | Cryotrim 45 | |
| 金刚石冷冻刀 | 硅藻 | Cryo 35 | |
| 防静电装置 | 硅藻 | 豪夫静态绳 | |
| 冷冻电子显微镜 | 卡尔·蔡司显微镜 | EM912 Omega | |
| EM 冷冻样品杆 | Gatan | CT3500 | |
| 慢扫描CCD相机，2k x 2k | 特伦德尔（TRS） | Sharpeye | |
| 图像采集软件 | 奥林巴斯 SIS | iTEM 套件 | |
| ED X射线探测器 | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| 脉冲处理器 | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI背板卡 | 4pi 系统 | Spectral Engine II | |
| 台式计算机 | 苹果 | 任何与 OS9 兼容的型号 | |
| X射线分析软件 | NIST | DTSA，DTSA II | |
| 电子表格软件 | 微软 | Excel | |
|
参考文献
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