磷酸钙沉淀法是一种方便且经济的转染培养细胞的方法。经过优化，该方法也可用于原代神经元等难转染细胞的转染。本文中，我们详细描述了海马神经元与星形胶质细胞共培养体系中磷酸钙转染的实验方案。
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摘要
摘要
磷酸钙沉淀法是一种方便且经济的转染培养细胞的方法。经过优化，该方法也可用于原代神经元等难转染细胞的转染。本文中，我们详细描述了海马神经元与星形胶质细胞共培养体系中磷酸钙转染的实验方案。
引言
原代神经元是最难转染的细胞类型之一，因为它们处于终末分化状态（有丝分裂后），并且对微环境变化极为敏感。目前有四种常用的方法可用于在这些细胞中表达外源基因和短发夹RNA（shRNA）1。每种方法都有其优缺点。例如，电穿孔通常需在新分离的神经元上进行2，因为细胞必须转移至电穿孔杯中才能完成转染。病毒感染通常可实现很高的转染效率3，但操作更繁琐，且对实验人员存在较高风险。市面上有多种基于脂质介导的转染试剂，其在神经元中的转染效果各不相同，且细胞毒性程度也存在差异。
磷酸钙转染是一种将外源基因导入神经元的简便且经济的方法。该方法最初由 Graham 和 Van Der Eb（1973 年）用于将腺病毒 DNA 导入哺乳动物细胞4。转染过程是将氯化钙与重组 DNA 在磷酸盐缓冲液中混合，从而形成 DNA/磷酸钙沉淀物。当这些沉淀物逐渐滴加到细胞单层上时，会黏附于细胞表面，通过内吞作用被细胞摄取，最终进入细胞核5。该过程可导致外源基因在靶细胞中的表达。磷酸钙转染的典型效率范围为 0.5–5%6–8。然而，通过仔细优化并一致地执行实验方案，转染效率可达近 50%。本文中，我们详细描述了对原代海马神经元进行磷酸钙转染的实验方案，这些神经元以夹心式共培养方式与星形胶质细胞共同培养9。
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方案
1. 准备大鼠星形胶质细胞培养物以制备条件培养基及星形胶质细胞-神经元共培养体系。
- 制备解剖缓冲液（BSS，配方见表1），并在使用前于4 °C保存。
- 将新生大鼠幼崽（P0-P2）置于500 ml烧杯中，用异氟烷进行麻醉。
- 当幼崽完全不动时，用70%乙醇喷洒并断头。
- 取出脑组织。
- 用Dumont #5镊子牢固夹住头部，使用精细剪刀沿中线切开皮肤和颅骨。
- 将颅骨向两侧翻开以暴露脑组织，并将脑组织转移至盛有冷BSS的培养皿中。
- 在解剖显微镜下分离大脑半球与间脑及脑干。用一对镊子固定组织，另一对镊子轻轻牵拉，小心去除所有脑膜。
- 将所有半球组织收集至一个60 mm培养皿中。使用小剪刀尽可能将组织剪碎，然后将剪碎的组织转移至50 ml锥形管中。
- 向脑组织中加入1.5 ml 1% DNase I、1.5 ml 2.5% 胰蛋白酶和12 ml BSS（总体积为15 ml）。在37 °C摇水浴中孵育15分钟。为确保充分混匀，每5分钟手动轻轻摇动试管一次。
- 将上清液通过70 μm细胞滤器过滤至新的50 ml锥形管中。向此上清液中加入3 ml胎牛血清（FBS）。
- 向剩余的组织块中加入13.5 ml BSS和1.5 ml 2.5% 胰蛋白酶，再次在摇水浴中孵育15分钟....
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结果
当转染的各个参数在不同实验之间得到优化并严格控制时，可以获得高达50%的转染效率。图1展示了在DIV4时用GFP转染的一片神经元区域。该视野中共有28个神经元，其中16个被成功转染，转染效率超过50%。对同一盖玻片上其他视野的抽样观察显示，总体转染效率约为50%（数据未显示）。在星形胶质细胞共培养体系中，神经元在转染后仍保持健康并正常发育。图2展示了转染PSD-95-GFP质粒10天后（即DIV15）的一个海马神经元。该神经元已发育出大量成熟的蘑菇状树突棘，表明神经元状态良好。本方案具有高转染效率和低细胞毒性，是研究原代海马神经元基因功能的有力工具。此外，该方案还可有望被改进用于转染脑内其他类型的神经元以及其他难转染的细胞类型。
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讨论
要实现稳定且成功的转染，有几个关键参数需要严格控制10,11。对于磷酸钙转染而言，最关键的参数是2x HBS的pH值，我们实验中通常控制在7.10–7.15之间。我们建议配制三批pH值相差0.05的储备液，以消除不同pH计之间的测量差异。或者，也可使用Clontech哺乳动物转染试剂盒提供的2x HBS，其转染效率稳定且良好。需要注意的是，即使在冷冻保存条件下，溶液的pH值仍会随时间发生变化。我们通常将2x HBS分装后在4 °C保存不超过一个月，在-20 °C保存不超过一年。
第二个参数是培养基的pH值。为了保持一致，N2.1培养基通常在星形胶质细胞培养物上孵育过夜，但不超过24小时。此外，我们尽量使用汇合度相似的星形胶质细胞培养物。使用胶质细胞条件培养基还有助于降低转染过程中对神经元的毒性。条件培养基在转染前需在培养箱中平衡，以保持pH值一致。
磷酸钙沉淀物的大小和密度是转染成功的关键。过小的沉淀物会导致转染效率低下，而过大或结块的沉淀物通常会引起细胞毒性10。为了确保.......
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致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS065183 及罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院的启动资金资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14090-09 | 直头 / 锐利 / 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15008-08 | 弯头 / 锐利 / 8.5 cm / 5 mm 刃口 |
| 标准型镊子 | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| 学生用手术剪刀 | Fine Science Tools | 91401-14 | 钝头 / 14.5 cm |
| 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15006-09 | 侧向弯曲 / 9 cm / 10 mm 刃口 |
| 异氟烷 | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P2636 | |
| MEM 培养基 | Sigma | M2279 | |
| 100 mM 丙酮酸钠 | Sigma | S8636 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 补充剂 (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 补充剂 | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| 卵白蛋白 | Sigma | A5503 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% 胰蛋白酶 | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| 阿糖胞苷 | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| 犬尿烯酸 | Sigma | K3375 |
参考文献
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst....
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