磷酸钙沉淀法是一种方便且经济的转染培养细胞的方法。经过优化，该方法也可用于原代神经元等难转染细胞的转染。本文中，我们详细描述了海马神经元与星形胶质细胞共培养体系中磷酸钙转染的实验方案。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
磷酸钙沉淀法是一种方便且经济的转染培养细胞的方法。经过优化，该方法也可用于原代神经元等难转染细胞的转染。本文中，我们详细描述了海马神经元与星形胶质细胞共培养体系中磷酸钙转染的实验方案。
引言
原代神经元是最难转染的细胞类型之一，因为它们处于终末分化状态（有丝分裂后），并且对微环境变化极为敏感。目前有四种常用的方法可用于在这些细胞中表达外源基因和短发夹RNA（shRNA）1。每种方法都有其优缺点。例如，电穿孔通常需在新分离的神经元上进行2，因为细胞必须转移至电穿孔杯中才能完成转染。病毒感染通常可实现很高的转染效率3，但操作更繁琐，且对实验人员存在较高风险。市面上有多种基于脂质介导的转染试剂，其在神经元中的转染效果各不相同，且细胞毒性程度也存在差异。
磷酸钙转染是一种将外源基因导入神经元的简便且经济的方法。该方法最初由 Graham 和 Van Der Eb（1973 年）用于将腺病毒 DNA 导入哺乳动物细胞4。转染过程是将氯化钙与重组 DNA 在磷酸盐缓冲液中混合，从而形成 DNA/磷酸钙沉淀物。当这些沉淀物逐渐滴加到细胞单层上时，会黏附于细胞表面，通过内吞作用被细胞摄取，最终进入细胞核5。该过程可导致外源基因在靶细胞中的表达。磷酸钙转染的典型效率范围为 0.5–5%6–8。然而，通过仔细优化并一致地执行实验方案，转染效率可达近 50%。本文中，我们详细描述了对原代海马神经元进行磷酸钙转染的实验方案，这些神经元以夹心式共培养方式与星形胶质细胞共同培养9。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
1. 准备大鼠星形胶质细胞培养物以制备条件培养基及星形胶质细胞-神经元共培养体系。
- 制备解剖缓冲液（BSS，配方见表1），并在使用前于4 °C保存。
- 将新生大鼠幼崽（P0-P2）置于500 ml烧杯中，用异氟烷进行麻醉。
- 当幼崽完全不动时，用70%乙醇喷洒并断头。
- 取出脑组织。
- 用Dumont #5镊子牢固夹住头部，使用精细剪刀沿中线切开皮肤和颅骨。
- 将颅骨向两侧翻开以暴露脑组织，并将脑组织转移至盛有冷BSS的培养皿中。
- 在解剖显微镜下分离大脑半球与间脑及脑干。用一对镊子固定组织，另一对镊子轻轻牵拉，小心去除所有脑膜。
- 将所有半球组织收集至一个60 mm培养皿中。使用小剪刀尽可能将组织剪碎，然后将剪碎的组织转移至50 ml锥形管中。
- 向脑组织中加入1.5 ml 1% DNase I、1.5 ml 2.5% 胰蛋白酶和12 ml BSS（总体积为15 ml）。在37 °C摇水浴中孵育15分钟。为确保充分混匀，每5分钟手动轻轻摇动试管一次。
- 将上清液通过70 μm细胞滤器过滤至新的50 ml锥形管中。向此上清液中加入3 ml胎牛血清（FBS）。
- 向剩余的组织块中加入13.5 ml BSS和1.5 ml 2.5% 胰蛋白酶，再次在摇水浴中孵育15分钟。
- 将剩余的上清液通过细胞滤器过滤，并与第1.8步所得上清液合并。
- 以1,000 RPM离心5分钟，沉淀细胞。
- 用5 ml胶质细胞培养基重悬细胞沉淀。上清液可再次离心以收集残留细胞。
- 使用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 以每150 cm2培养瓶1 × 107的密度接种细胞。
- 接种后次日更换为新鲜胶质细胞培养基，之后每周用胶质细胞培养基换液两次。
- 当细胞融合度达到>80%（接种后约10天）时，用90%马血清和10% DMSO将细胞冻存于液氮中。每管冻存2 × 106个细胞。每个培养瓶大约可冻存5管。
- 在建立海马神经元培养前约10–14天，从冻存细胞中复苏胶质细胞进行接种。我们通常接种五块6孔板，足以支持90个盖玻片的海马神经元生长（每孔3个15 mm圆形盖玻片）。此外，我们还额外接种8–10个60 mm培养皿的胶质细胞，用于制备转染用的N2.1条件培养基。神经元培养前一天，应使用NB27培养基对细胞进行换液。此时星形胶质细胞的理想融合度应>90%。我们发现冻存过程可显著减少星形胶质细胞培养物中的小胶质细胞数量。由于当小胶质细胞存在于星形胶质细胞培养物中时会观察到神经毒性增强，因此我们始终采用由冻存细胞制备的星形胶质细胞培养物与神经元共培养。
2. 神经元培养
- 用 milliQ 水冲洗盖玻片 2 次以清洁。随后将盖玻片浸泡于浓硝酸中 24 小时，并在总共 2 小时内用 milliQ 水至少冲洗 5 次。盖玻片经烘干后，在 225 °C 烤箱中烘烤 6 小时以灭菌。
- 灭菌后将盖玻片转移至 60 mm 培养皿中。在每片盖玻片外缘附近放置四滴无菌石蜡，以便在共培养期间将神经元与胶质细胞分隔开。
- 用 1 mg/ml 多聚-L-赖氨酸溶于 0.1 M 硼酸盐缓冲液中，在 37 °C 培养箱中过夜包被盖玻片。
- 次日，用无菌 milliQ 水冲洗盖玻片两次，每次至少 15 分钟。随后在 37 °C 培养箱中用铺板培养基过夜孵育。
- 通过异氟烷麻醉后行气胸法处死孕鼠（E18），并通过断头法处死胚胎鼠。取出大脑并按上述方法分离大脑半球。
- 从大脑半球中分离海马组织。将所有海马组织放入 15 ml 圆底离心管中，加入 0.25% 胰蛋白酶（0.5 ml 2.5% 胰蛋白酶 + 4.5 ml BSS）在 37 ℃ 下消化 15 分钟。
- 将消化后的海马组织用 BSS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。随后用玻璃巴斯德移液管进行吹打解离，并使用血细胞计数板测定细胞密度。将神经元以每 60 mm 培养皿 2 × 105 个细胞的密度接种。
- 铺板后约 2–4 小时，将带有贴附神经元的盖玻片转移至含有星形胶质细胞的培养皿中，使神经元面朝下贴近胶质细胞。在 DIV3 时，向培养体系中加入阿糖胞苷，终浓度为 5 μM，以抑制胶质细胞增殖。
3. 钙转染
- 转染前一天，用胶质细胞条件化 N2.1 培养基。
- 转染当天，从胶质细胞中收集已条件化的 N2.1 培养基，转移至新培养皿中。将带有神经元的盖玻片转移至该条件化 N2.1 培养基中，在培养箱中平衡 10–30 分钟。
- 在一组无菌离心管中，加入 1–4 μg DNA、12.5 μl 2 M CaCl2 和无菌 H2O，总体积为 100 μl。在另一组离心管中，加入 100 μl 2x HBS。
- 逐次向含有 CaCl2/DNA 混合物的离心管中加入 2x HBS 的 ⅛ 体积（即 12.5 μl），每次加入后涡旋数秒。室温静置 15 分钟。
- 孵育 15 分钟后，将转染混合物逐滴加入细胞中，继续孵育 1–1.5 小时。在 10X 物镜下通过显微镜观察，应可见类似沙粒状的沉淀层。
- 孵育结束后，用预温的 HBS 洗涤缓冲液轻柔冲洗盖玻片两次。
- 将盖玻片放回原含胶质细胞的培养皿中，并加入犬尿酸，使其终浓度为 0.5 mM。
- 转染后的神经元最早可在次日进行活细胞成像或免疫细胞化学检测。转染后神经元可存活长达三周。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
当转染的各个参数在不同实验之间得到优化并严格控制时，可以获得高达50%的转染效率。图1展示了在DIV4时用GFP转染的一片神经元区域。该视野中共有28个神经元，其中16个被成功转染，转染效率超过50%。对同一盖玻片上其他视野的抽样观察显示，总体转染效率约为50%（数据未显示）。在星形胶质细胞共培养体系中，神经元在转染后仍保持健康并正常发育。图2展示了转染PSD-95-GFP质粒10天后（即DIV15）的一个海马神经元。该神经元已发育出大量成熟的蘑菇状树突棘，表明神经元状态良好。本方案具有高转染效率和低细胞毒性，是研究原代海马神经元基因功能的有力工具。此外，该方案还可有望被改进用于转染脑内其他类型的神经元以及其他难转染的细胞类型。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
要实现稳定且成功的转染，有几个关键参数需要严格控制10,11。对于磷酸钙转染而言，最关键的参数是2x HBS的pH值，我们实验中通常控制在7.10–7.15之间。我们建议配制三批pH值相差0.05的储备液，以消除不同pH计之间的测量差异。或者，也可使用Clontech哺乳动物转染试剂盒提供的2x HBS，其转染效率稳定且良好。需要注意的是，即使在冷冻保存条件下，溶液的pH值仍会随时间发生变化。我们通常将2x HBS分装后在4 °C保存不超过一个月，在-20 °C保存不超过一年。
第二个参数是培养基的pH值。为了保持一致，N2.1培养基通常在星形胶质细胞培养物上孵育过夜，但不超过24小时。此外，我们尽量使用汇合度相似的星形胶质细胞培养物。使用胶质细胞条件培养基还有助于降低转染过程中对神经元的毒性。条件培养基在转染前需在培养箱中平衡，以保持pH值一致。
磷酸钙沉淀物的大小和密度是转染成功的关键。过小的沉淀物会导致转染效率低下，而过大或结块的沉淀物通常会引起细胞毒性10。为了确保...
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
致谢
本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金项目 NS065183 及罗格斯大学罗伯特·伍德·约翰逊医学院的启动资金资助。
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Dumont #5 镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14090-09 | 直头 / 锐利 / 8.5 cm |
| Vannas-Tubinger 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15008-08 | 弯头 / 锐利 / 8.5 cm / 5 mm 刃口 |
| 标准型镊子 | Fine Science Tools | 11000-16 | |
| 学生用手术剪刀 | Fine Science Tools | 91401-14 | 钝头 / 14.5 cm |
| 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15006-09 | 侧向弯曲 / 9 cm / 10 mm 刃口 |
| 异氟烷 | Webster Veterinary | 14043-225-06 | |
| 聚-L-赖氨酸 | Sigma | P2636 | |
| MEM 培养基 | Sigma | M2279 | |
| 100 mM 丙酮酸钠 | Sigma | S8636 | |
| 葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| 10x HBSS | Sigma | H4385 | |
| 1 M HEPES, pH 7.3 | Gibco/Invitrogen | 15630-080 | |
| GlutaMAX | Gibco/Invitrogen | 35050-061 | |
| Neurobasal 培养基 | Gibco/Invitrogen | 21130-049 | |
| B27 补充剂 (50x) | Gibco/Invitrogen | 17504-044 | |
| N2 补充剂 | Gibco/Invitrogen | 17502-048 | |
| 卵白蛋白 | Sigma | A5503 | |
| 青霉素/链霉素 | Gibco/Invitrogen | 15070-063 | |
| 2.5% 胰蛋白酶 | Gibco/Invitrogen | 15090-046 | |
| DNase I | Sigma | DN-25 | |
| 阿糖胞苷 | Calbiochem/EMD Millipore | 251010 | |
| 犬尿烯酸 | Sigma | K3375 |
参考文献
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30, 6171-6177 (2010).
- Zeitelhofer, M., et al. High-efficiency transfection of mammalian neurons via nucleofection. Nat. Protoc. 2, 1692-1704 (2007).
- Janas, J., Skowronski, J., Van Aelst, L. Lentiviral delivery of RNAi in hippocampal neurons. Method Enzymol. 406, 593-605 (2006).
- Graham, F. L., vander Eb, A. J. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology. 52, 456-467 (1973).
- Craig, A. M. Transfecting cultured neurons. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , 2nd edition, MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Alavian, K. N., et al. Bcl-xL regulates metabolic efficiency of neurons through interaction with the mitochondrial F1FO ATP synthase. Nat. Cell Biol. 13, 1224-1233 (2011).
- Zhang, Y., et al. Modulation of synaptic function by VAC14, a protein that regulates the phosphoinositides PI(3,5)P(2) and PI(5)P. EMBO J. 31, 3442-3456 (2012).
- Dudek, H., Ghosh, A., Greenberg, M. E. Calcium phosphate transfection of DNA into neurons in primary culture. Curr. Protoc. Neurosci. Chapter 3, Unit 3 11(2001).
- Goslin, K. A. H., Banker, G. Rat Hippocampal Neurons in Low-Density Culture. Culturing Nerve Cells. Banker, G. aG. K. , MIT Press. Cambridge, MA. (1998).
- Kohrmann, M., et al. Fast, convenient, and effective method to transiently transfect primary hippocampal neurons. J. Neurosci. Res. 58, 831-835 (1999).
- Jiang, M., Chen, G. High Ca2+-phosphate transfection efficiency in low-density neuronal cultures. Nat. Protoc. 1, 695-700 (2006).
- Goetze, B., Grunewald, B., Baldassa, S., Kiebler, M. Chemically controlled formation of a DNA/calcium phosphate coprecipitate: application for transfection of mature hippocampal neurons. J. Neurobiol. 60, 517-525 (2004).
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
