本方法描述了利用点击化学技术检测裂谷热病毒MP-12株(RVFV MP-12)感染后宿主细胞转录水平变化的方法。结果可通过荧光显微镜进行定性观察,或通过流式细胞术获得定量数据。该方法可适用于其他病毒的研究。
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本方法描述了利用点击化学技术检测裂谷热病毒MP-12株(RVFV MP-12)感染后宿主细胞转录水平变化的方法。结果可通过荧光显微镜进行定性观察,或通过流式细胞术获得定量数据。该方法可适用于其他病毒的研究。
许多RNA病毒已进化出抑制宿主细胞转录的能力,以此规避细胞的防御机制。因此,在研究这类病毒时,快速且可靠地测量感染细胞中转录活性的方法显得尤为重要。传统上,转录活性的测定方法包括放射性核苷酸(如3H-尿苷)掺入法,随后通过放射自显影或液体闪烁计数进行检测;或使用卤化尿苷类似物(如5-溴尿苷,BrU)掺入法,随后通过免疫染色进行检测。然而,使用放射性同位素需要专门的设备,在许多实验室环境中难以实现;而BrU的检测过程可能较为繁琐,且灵敏度较低。
近年来发展的点击化学技术,通过叠氮化物与炔烃在铜催化下形成三唑,现已成为上述两种方法的快速且高灵敏度的替代方案。点击化学是一种两步过程:首先通过掺入尿苷类似物5-乙炔基尿苷(EU)对新生RNA进行标记,随后利用荧光叠氮化物对标签进行检测。这些叠氮化物可与多种不同荧光染料偶联,为成像提供了广泛的选择。
本方案描述了一种利用点击化学方法检测裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)MP-12株感染细胞中转录抑制的技术。同时,通过经典的细胞内免疫染色法测定这些细胞中病毒蛋白的表达。步骤1至4详述了通过荧光显微镜观察转录抑制的方法,而步骤5至8则详述了通过流式细胞术定量转录抑制的方法。本方案易于调整,可用于其他病毒的研究。
传统上,转录活性的检测依赖于将放射性核苷酸(3H-尿苷)1 或卤化核苷酸(BrU)2 掺入新生RNA中。这些尿苷类似物被细胞摄取后,通过核苷补救途径转化为尿苷三磷酸(UTP),随后掺入新合成的RNA中。3H-尿苷可通过自显影技术检测,但该方法耗时较长,或通过液体闪烁计数检测,但需要专用设备。此外,在一些实验室环境中,例如高等级生物安全防护实验室,使用放射性同位素可能并不实际。BrU可通过抗BrU抗体的免疫染色进行检测,但该方法可能需要强烈的细胞通透化处理,以确保抗体进入细胞核,或对RNA进行部分变性处理,因为RNA的二级结构可能在空间上阻碍抗体的结合。
本文所述方案利用近年来开发的点击化学3技术,检测感染RVFV MP-12毒株细胞中的转录活性。点击化学依赖于炔基与叠氮基团之间高效且高度选择性的铜(I)催化环加成反应4,5。在本方案中,首先通过掺入尿苷类似物EU标记感染细胞中新合成的RNA;随后在第二步中,利用荧光标记的叠氮化合物与掺入的EU发生反应从而实现检测。该方法的主要优势在于:(1)无需使用放射性同位素;(2)无需进行剧烈的细胞通透化处理或RNA变性。由于荧光叠氮化合物分子量小于50 Da,因此即使细胞通透化不充分或存在RNA二级结构,也不会阻碍其进入细胞。此外,在将RNA检测与针对病毒蛋白的经典免疫染色相结合时,研究人员在一抗的选择上不....
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通过荧光显微镜分析转录
1. 用 MP-12 感染细胞并用 EU 标记新生 RNA
注意: 如果细胞难以贴附在盖玻片上,可在将其放入培养孔前用聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine,分子量 ≥ 70,000)包被。为此,将盖玻片浸入无菌的 H₂O 中含 0.1 mg/ml 聚-L-赖氨酸的溶液2用多聚-L-赖氨酸孵育5分钟。用无菌H₂O冲洗盖玻片。2O 并在空气中干燥至少 2 小时。
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RVFV(布尼亚病毒科)的NSs蛋白 布尼亚病毒科属 菲罗病毒属) 11 通过两种不同的机制抑制宿主细胞的普通转录:(i)通过结合基础转录因子 TFIIH 的 p44 亚基11 并通过促进TFIIH的p62亚基的蛋白酶体降解 6. 疫苗株 RVFV MP-12 13 由于MP-12株可在生物安全二级实验室中操作,且不受美国对其他野生型裂谷热病毒株适用的“选择性致病原规则”限制,因此本方案所述实验均采用该毒株。MP-12株的NSs蛋白功能完整,仍具有抑制宿主转录的能力6携带缺失 NSs 基因 69% 区域的病毒 rMP12-C13type 14,已被用作对照病毒,该病毒缺乏所有NSs功能,包括抑制宿主细胞转录的能力。
图1 显示通过荧光显微镜获得的图像。在模拟感染的细胞中(图1a-1d),细胞核呈现亮红色,表明正在进行转录。由于细胞仅被EU标记1小时后.......
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本方案描述了一种通过将尿苷类似物EU掺入新生RNA,以检测病毒感染对宿主细胞转录影响的方法。该方法相较于以往技术具有多项优势:操作快速、灵敏度高,且无需使用放射性同位素。此外,该方法可灵活应用于荧光显微镜获取定性数据,或通过流式细胞术获得定量数据,且基本使用相同的试剂。当与病毒抗原的免疫荧光染色结合使用时,该方法还可使研究人员区分被感染与未感染的细胞。
需要注意的是,该方法对新合成的病毒RNA的标记效率与宿主转录本相同,这一缺点与其他依赖于 3H-尿苷或 BrU 掺入。然而,至少在 RVFV MP-12 感染的情况下,我们发现宿主转录本的量远超过病毒转录本的量,因此本检测所测得的总 RNA 中病毒 RNA 的影响可忽略不计。当将本方案用于其他病毒时,研究人员可通过病毒转录本的定位、用放线菌素 D(ActD)处理感染细胞,或通过荧光标记来识别病毒转录本 原位 荧光原位杂交(FISH)15. 如果病毒在细胞质中复制,例如 MP-12,则病毒 RNA 可以很容易地与细胞 RNA 区分开,因为在标记 1 小时后,细胞 RNA 仍.......
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我们感谢 R.B. Tesh 提供小鼠多克隆抗裂谷热病毒抗血清,感谢 UTMB 流式细胞术核心设施的 M. Griffin 在流式细胞术方面的协助。本工作由通过西部地区卓越中心资助的 5 U54 AI057156 项目、NIH 资助项目 R01 AI08764301 以及 UTMB 疫苗开发塞利中心的资金支持。B.K. 得到 UTMB James W. McLaughlin 研究生奖学金基金的支持。O.L. 得到 Maurice R. Hilleman 早期职业研究者奖的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-乙炔基尿苷 | Berry Associates | PY 7563 | 溶于DMSO配制成100 mM储备液 |
| 12 mm圆形盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml聚苯乙烯管 | BD Biosciences | 352058 | |
| 放线菌素D(ActD) | Sigma | 9415 | 溶于DMSO配制成10 mM储备液 |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| 牛血清白蛋白(BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | 溶于H2O配制成100 mM储备液 |
| DAPI | Sigma | D-9542 | 溶于H2O配制成5 mg/ml储备液 |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| 荧光叠氮化物(Alexa Fluor 594偶联) | Invitrogen | A10270 | |
| 荧光叠氮化物(Alexa Fluor 657偶联) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A-5960 | 溶于H2O配制成500 mM溶液 |
| 滤纸 | VWRbrand | 28333-087 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 聚-L-赖氨酸(分子量 ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma碱 | Sigma | T-1503 | 溶于H2O配制成1.5 M储备液,pH 8.5 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 荧光显微镜 | 例如 Olympus IX71 | ||
| 流式细胞仪 | 例如 BD Biosciences LSRII Fortessa |
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