本方法描述了利用点击化学技术检测裂谷热病毒MP-12株（RVFV MP-12）感染后宿主细胞转录水平变化的方法。结果可通过荧光显微镜进行定性观察，或通过流式细胞术获得定量数据。该方法可适用于其他病毒的研究。
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摘要
摘要
许多RNA病毒已进化出抑制宿主细胞转录的能力，以此规避细胞的防御机制。因此，在研究这类病毒时，快速且可靠地测量感染细胞中转录活性的方法显得尤为重要。传统上，转录活性的测定方法包括放射性核苷酸（如3H-尿苷）掺入法，随后通过放射自显影或液体闪烁计数进行检测；或使用卤化尿苷类似物（如5-溴尿苷，BrU）掺入法，随后通过免疫染色进行检测。然而，使用放射性同位素需要专门的设备，在许多实验室环境中难以实现；而BrU的检测过程可能较为繁琐，且灵敏度较低。
近年来发展的点击化学技术，通过叠氮化物与炔烃在铜催化下形成三唑，现已成为上述两种方法的快速且高灵敏度的替代方案。点击化学是一种两步过程：首先通过掺入尿苷类似物5-乙炔基尿苷（EU）对新生RNA进行标记，随后利用荧光叠氮化物对标签进行检测。这些叠氮化物可与多种不同荧光染料偶联，为成像提供了广泛的选择。
本方案描述了一种利用点击化学方法检测裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）MP-12株感染细胞中转录抑制的技术。同时，通过经典的细胞内免疫染色法测定这些细胞中病毒蛋白的表达。步骤1至4详述了通过荧光显微镜观察转录抑制的方法，而步骤5至8则详述了通过流式细胞术定量转录抑制的方法。本方案易于调整，可用于其他病毒的研究。
引言
传统上，转录活性的检测依赖于将放射性核苷酸（3H-尿苷）1 或卤化核苷酸（BrU）2 掺入新生RNA中。这些尿苷类似物被细胞摄取后，通过核苷补救途径转化为尿苷三磷酸（UTP），随后掺入新合成的RNA中。3H-尿苷可通过自显影技术检测，但该方法耗时较长，或通过液体闪烁计数检测，但需要专用设备。此外，在一些实验室环境中，例如高等级生物安全防护实验室，使用放射性同位素可能并不实际。BrU可通过抗BrU抗体的免疫染色进行检测，但该方法可能需要强烈的细胞通透化处理，以确保抗体进入细胞核，或对RNA进行部分变性处理，因为RNA的二级结构可能在空间上阻碍抗体的结合。
本文所述方案利用近年来开发的点击化学3技术，检测感染RVFV MP-12毒株细胞中的转录活性。点击化学依赖于炔基与叠氮基团之间高效且高度选择性的铜(I)催化环加成反应4,5。在本方案中，首先通过掺入尿苷类似物EU标记感染细胞中新合成的RNA；随后在第二步中，利用荧光标记的叠氮化合物与掺入的EU发生反应从而实现检测。该方法的主要优势在于：（1）无需使用放射性同位素；（2）无需进行剧烈的细胞通透化处理或RNA变性。由于荧光叠氮化合物分子量小于50 Da，因此即使细胞通透化不充分或存在RNA二级结构，也不会阻碍其进入细胞。此外，在将RNA检测与针对病毒蛋白的经典免疫染色相结合时，研究人员在一抗的选择上不受限制。
本方案中描述了两种不同的方法：一种用于通过荧光显微镜观察转录过程（步骤1-4），另一种用于通过流式细胞术定量转录水平（步骤5-8）。这两种方法均结合了新生RNA的标记与病毒蛋白的细胞内免疫染色，从而能够在单细胞水平上分析转录活性与病毒感染之间的相关性。
作者已成功应用此处所述方案，检测了感染RVFV MP-12株6的细胞、感染不同MP-12突变株的细胞7,8,9以及感染托斯卡纳病毒（TOSV）的细胞10中的转录活性。本方案可轻松适用于其他病毒，并可进一步修改以结合针对特定病毒或细胞蛋白的免疫荧光染色。
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方案
通过荧光显微镜分析转录
1. 用 MP-12 感染细胞并用 EU 标记新生 RNA
- 将12 mm圆形盖玻片放入12孔细胞培养板中，每孔一片。
注意： 如果细胞难以贴附在盖玻片上，可在将其放入培养孔前用聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine，分子量 ≥ 70,000）包被。为此，将盖玻片浸入无菌的 H₂O 中含 0.1 mg/ml 聚-L-赖氨酸的溶液2用多聚-L-赖氨酸孵育5分钟。用无菌H₂O冲洗盖玻片。2O 并在空气中干燥至少 2 小时。
- 将293细胞接种到盖玻片上，每孔加入含5 × 104个细胞的1 ml生长培养基（DMEM，含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素）。在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中过夜培养。
- 用MP-12病毒感染细胞，感染复数（m.o.i.）为3。至少设置两孔未感染细胞：其中一孔作为未感染对照，另一孔在步骤1.5中用放线菌素D（ActD）处理，作为转录抑制对照。吸去生长培养基，稀释病毒原液，使每孔加入的总体积为200 ml。在37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育1小时。
注意： 细胞也可通过转染质粒DNA进行处理，而非感染细胞 体外 合成编码特定病毒蛋白的RNA。为此，按照制造商说明书，使用适当的化学转染试剂对细胞进行转染，并于转染后16小时进入步骤1.5。建议在RNA标记和固定前，优化转染条件和孵育时间。
- 移除接种物，每孔加入 1 ml 新鲜培养基。在 37 °C 下培养 15 小时。
注意：如果将本方案用于其他病毒，建议进行时间进程实验，以确定 RNA 标记和固定的最适时间点。设置该时间进程实验时，应使感染时间错开，以便所有样品可在同一时间进行标记、固定和染色。
- 感染后15小时（h.p.i.），将培养基更换为含有1 mM EU的培养基。在其中一个模拟感染孔中，同时加入5 μg/ml的放线菌素D（ActD）。该孔将作为转录抑制的对照，因为ActD可抑制DNA依赖性RNA合成。将细胞放回培养箱中继续培养。
- 感染后16小时（h.p.i.），移除培养基，每孔用1 ml PBS（KCl 0.20 g/L，KH2PO4 0.20 g/L，NaCl 8.00 g/L，Na2HPO4 1.15 g/L，pH 7.4）洗涤盖玻片一次。每孔加入1 ml 4%多聚甲醛（PFA），室温孵育30分钟以固定细胞。
注意：配制4% PFA固定液时，将10 g多聚甲醛溶解于150 ml加热至60 °C的H2O中，使用加热磁力搅拌器搅拌。加入500 μl的1 M NaOH，并继续搅拌至溶液澄清。用滤纸过滤PFA溶液以去除颗粒物，然后加入62.5 ml磷酸盐缓冲液（77 mM NaH2PO4，287 mM Na2HPO4，pH 7.4）。用H2O定容至总体积250 ml。分装成一次性使用量，于-20 °C冷冻保存。
- 每孔加入 1 ml PBS 洗涤一次。此步骤及后续所有洗涤步骤均无需孵育，立即进行步骤 2。
注意： 必须立即进行点击反应，因为RNA在此阶段长时间存放会发生降解；即使细胞在4 °C下保存1小时，也可观察到RNA荧光信号的减弱。同样，若进行时间进程实验，务必同时对所有样品进行标记、固定和染色。
2. 点击反应检测标记的RNA
- 加入1 ml含0.2% Triton X-100的PBS缓冲液，对细胞进行透化处理。室温孵育10分钟。
注意： 步骤 2.1 至 2.3 中使用的所有溶液均需为无核酸酶的。
- 每孔用 1 ml PBS 洗涤三次。
- 从 12 孔板中取出盖玻片，转移至湿盒中。每张盖玻片上覆盖 50 - 100 μl 点击染色液（100 mM Tris pH 8.5，1 mM CuSO4，20 μM 荧光叠氮化物 [激发/发射最大值：590/617 nm]，100 mM 抗坏血酸）。室温避光孵育 1 小时。
注意：组装湿化室时，用直径为10 cm的塑料封口膜铺垫细胞培养皿或培养皿底部，并用湿润的纸巾沿皿内边缘内侧铺一圈。将盖玻片放置在塑料封口膜上。
注意：在本实验方案的任何步骤中，均需注意避免盖玻片干燥。将盖玻片放入湿盒后，应立即直接向每张盖玻片上添加染色液为佳。
注意：请在此步骤前立即新鲜配制点击染色溶液。1.5 M Tris（pH 8.5）、100 mM CuSO4 和 500 mM 抗坏血酸的储存液可保存在 4 °C。然而，若抗坏血酸储存液变为黄色，则必须弃用。
注意：务必选择与荧光显微镜滤光片相匹配的荧光染料。
- 从湿盒中取出盖玻片，放入新的12孔板中，每孔加入1 ml PBS洗涤三次。
注意：如果无需检测病毒蛋白，可在本步骤后直接封片并进行成像（继续执行步骤 3.3）。
3. 免疫荧光法检测病毒蛋白的表达
- 每孔加入 1 ml 封闭缓冲液（含 3% (w/v) 牛血清白蛋白 (BSA) 的 PBS），于室温避光孵育 30 分钟。
- 从 12 孔板中取出盖玻片，转移至湿盒中，并加入用封闭缓冲液按 1:500 比例稀释的一抗（抗 RVFV 抗体，由德克萨斯大学医学分部 Dr. R.B. Tesh 惠赠），每片加入 50–100 μl。室温避光孵育 1 小时。
注意： 在将本方案用于其他病毒时，应首先确定一抗的最佳稀释比例。
注意：或者，此步骤也可在 4 °C 避光过夜进行。
- 从湿盒中取出盖玻片，放回 12 孔板中，每孔加入 1 ml PBS 洗涤三次。
- 从 12 孔板中取出盖玻片，放入湿盒中，每张盖玻片上加 50 - 100 μl 用封闭缓冲液按 1:500 稀释的二抗（与荧光染料偶联的抗小鼠 IgG [激发/发射最大值：495/519 nm]），在室温避光孵育 1 小时。
注意：请务必选择一种能够识别您的初级抗体并匹配荧光显微镜滤光片的二抗。
注意： 如有需要，可在二抗稀释液中加入 200 ng/ml DAPI 以显示细胞核。
- 从湿盒中取出盖玻片，放回12孔板中，每孔用1 ml PBS洗涤三次。
- 滴加一滴（ca. 15 μl) Fluoromount-G 加到显微镜载玻片上。将盖玻片浸入 H2O，去除过量的H2用纸巾轻触切片一侧以去除多余液体，将切片细胞面朝下置于Fluoromount-G封片剂液滴中，室温避光干燥5分钟。
注意：若在倒置显微镜上进行成像，请将Fluoromount-G在4 °C过夜冷却使其凝固，或使用透明指甲油封固盖玻片边缘，将其固定于载玻片上。
注意：载玻片可立即成像，或在 4 °C 避光条件下保存最多一周。
4. 数据采集
- 使用荧光显微镜进行成像。
注意：请务必选择适合您显微镜观测的荧光染料。作为参考，以下列出了本出版物中所示图像所使用的荧光染料及滤光片组。
DAPI：
激发滤光片：BP 330 - 385
二向色镜：DM 400
发射滤光片：LP 420
激发/发射最大值为 495/519 的荧光染料：
激发滤光片：BP 460 - 490
二向色镜：DM 505
发射滤光片：LP 510
激发/发射最大值为 590/617 的荧光染料：
激发滤光片：BP 545 - 580
二向色镜：DM 600
发射滤光片：LP 610
通过流式细胞术分析转录
5. 用MP-12感染细胞并用EU标记新生RNA
- 将293细胞接种于6孔组织培养板中，培养基为含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素的DMEM。置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育，直至细胞融合度达到80–100%。
- 用MP-12病毒感染细胞，感染复数（m.o.i.）为3。至少设置两个未感染的对照孔：其中一个作为未感染对照，另一个在步骤5.4中用放线菌素D（ActD）处理。吸除培养基，稀释病毒原液，使每孔加入的总体积为400 μl。置于37 °C、5% CO2的加湿培养箱中孵育1小时。
- 吸除接种液，每孔加入2 ml新鲜培养基。在37 °C继续孵育12小时。
注意：如果将本方案改编用于其他病毒，建议进行时间进程实验，以确定标记和收获的最佳时间点。设置该时间进程实验时，应使感染时间依次错开，以便所有样品可在同一时间进行标记、收获和染色。
- 在感染后12小时，将培养基更换为含有0.5 mM EU的培养基。向其中一个模拟感染孔中加入5 μg/ml的放线菌素D（ActD），作为转录抑制的对照，因为ActD可抑制DNA依赖性RNA合成。将细胞放回培养箱中继续培养。
- 在感染后13小时，用PBS洗涤细胞一次，通过胰酶消化法收集细胞。用含有1 mM EDTA的PBS（PBS-EDTA）对收集的细胞洗涤三次。
注意：在此步骤及后续步骤中，离心速度不得超过 500 - 1,000 ×g，以防止细胞破裂。离心 1 - 2 分钟以沉淀细胞。
注意：如果计划在点击反应后进行表面免疫染色，则应使用橡胶刮刀或一次性细胞刮刀收集细胞。
- 通过在1 ml 4% PFA中重悬细胞，在室温下固定30分钟。有关4% PFA的配制方法，请参见步骤1.6。
- 每孔用1 ml PBS-EDTA洗涤一次。立即进入步骤6。
注意： 必须立即进行点击反应，因为RNA在此阶段长时间放置会降解。同样，如果进行时间进程实验，务必在同一时间对所有样品进行标记、固定和染色。
6. 点击化学反应检测标记的RNA
- 用 0.5 ml 含 0.2% Triton X-100 的 PBS 重悬细胞以进行透化处理，在室温下孵育 10 分钟。
注意： 步骤 6.1 至 6.3 中使用的所有溶液均需无核酸酶。
注意：如果细胞在此步骤中沉淀不充分，可将离心时间延长至5分钟。当细胞悬浮于FACS缓冲液中后（步骤6.4），其沉淀性能将有所改善。
- 用 1 ml PBS 洗涤一次。
注意：此步骤中不要使用EDTA，因为它会螯合点击反应所必需的Cu2+离子。
- 将细胞重悬于200 μl点击染色溶液中（100 mM Tris，pH 8.5，1 mM CuSO4，200 nM 叠氮化物标记的荧光染料[激发/发射最大值：650/665 nm]，100 mM 抗坏血酸）。室温避光孵育1小时。
注意：请在此步骤前立即新鲜配制点击染色溶液。1.5 M Tris（pH 8.5）、100 mM CuSO4 和 500 mM 抗坏血酸的储存液可保存在 4 °C。然而，若抗坏血酸储存液变为黄色，则必须弃用。
注意：如果细胞在此步骤中发生聚集，可通过反复吹打数次重新悬浮细胞。
注意：务必选择一种可被您的流式细胞仪检测到的荧光染料。
注意：还需准备一份未进行点击化学染色步骤的感染细胞样本，用于流式细胞仪的校准。可在第5.2步中使用一半的感染细胞，或额外设置一个感染孔。这些对照细胞将在第7.1步进行免疫染色。
- 用FACS缓冲液（含1 mM EDTA和0.5% (w/v) BSA的PBS）洗涤两次。
注意：如果不需要对病毒蛋白进行免疫染色，可立即分析细胞（进入步骤8）。
7. 免疫荧光法检测病毒蛋白的表达
- 将细胞重悬于 200 μl 用 FACS 缓冲液稀释的一抗（anti-RVFV，1:10,000）中，室温避光孵育 1 小时。
注意： 或者，此步骤也可在 4 °C 避光过夜（O/N）进行。
注意：还需准备一份未感染的细胞样本，该样本需经过点击化学染色步骤但不进行免疫染色，用于流式细胞仪的校准。可在第5.2步中使用一半的模拟感染细胞，或额外设置一个未感染的孔。
注意： 当将本方案用于其他病毒时，应首先确定一抗的最佳稀释度。
- 用 FACS 缓冲液洗涤细胞两次。
- 将细胞重悬于 200 μl 用 FACS 缓冲液按 1:1,000 稀释的二抗（与荧光染料偶联的抗小鼠 IgG [激发/发射最大值：495/519 nm]）中，在室温避光孵育 1 小时。
- 用 FACS 缓冲液洗涤细胞一次。
注意： 此时，细胞可在 4 °C 避光条件下过夜保存。
8. 数据采集
- 用500 μl FACS缓冲液重悬细胞，转移至5 ml聚苯乙烯管中，使用流式细胞仪进行分析。采用MP-12感染的细胞（不进行点击反应，仅RVFV抗体染色）和模拟感染的细胞（仅进行点击反应）校准仪器。
注意：请务必选择适合您仪器检测的荧光染料。作为参考，以下是在本出版物中获取所示数据时所使用的激光线和滤光片组合。
激发/发射光谱为 495/519 的荧光染料：
激光：488 nm
滤光片：530/30
激发/发射光谱为 650/665 的荧光染料：
激光：640 nm
滤光片：670/20
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结果
RVFV（布尼亚病毒科）的NSs蛋白 布尼亚病毒科属 菲罗病毒属) 11 通过两种不同的机制抑制宿主细胞的普通转录：（i）通过结合基础转录因子 TFIIH 的 p44 亚基11 并通过促进TFIIH的p62亚基的蛋白酶体降解 6. 疫苗株 RVFV MP-12 13 由于MP-12株可在生物安全二级实验室中操作，且不受美国对其他野生型裂谷热病毒株适用的“选择性致病原规则”限制，因此本方案所述实验均采用该毒株。MP-12株的NSs蛋白功能完整，仍具有抑制宿主转录的能力6携带缺失 NSs 基因 69% 区域的病毒 rMP12-C13type 14，已被用作对照病毒，该病毒缺乏所有NSs功能，包括抑制宿主细胞转录的能力。
图1 显示通过荧光显微镜获得的图像。在模拟感染的细胞中（图1a-1d），细胞核呈现亮红色，表明正在进行转录。由于细胞仅被EU标记1小时后...
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讨论
本方案描述了一种通过将尿苷类似物EU掺入新生RNA，以检测病毒感染对宿主细胞转录影响的方法。该方法相较于以往技术具有多项优势：操作快速、灵敏度高，且无需使用放射性同位素。此外，该方法可灵活应用于荧光显微镜获取定性数据，或通过流式细胞术获得定量数据，且基本使用相同的试剂。当与病毒抗原的免疫荧光染色结合使用时，该方法还可使研究人员区分被感染与未感染的细胞。
需要注意的是，该方法对新合成的病毒RNA的标记效率与宿主转录本相同，这一缺点与其他依赖于 3H-尿苷或 BrU 掺入。然而，至少在 RVFV MP-12 感染的情况下，我们发现宿主转录本的量远超过病毒转录本的量，因此本检测所测得的总 RNA 中病毒 RNA 的影响可忽略不计。当将本方案用于其他病毒时，研究人员可通过病毒转录本的定位、用放线菌素 D（ActD）处理感染细胞，或通过荧光标记来识别病毒转录本 原位 荧光原位杂交（FISH）15. 如果病毒在细胞质中复制，例如 MP-12，则病毒 RNA 可以很容易地与细胞 RNA 区分开，因为在标记 1 小时后，细胞 RNA 仍...
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致谢
我们感谢 R.B. Tesh 提供小鼠多克隆抗裂谷热病毒抗血清，感谢 UTMB 流式细胞术核心设施的 M. Griffin 在流式细胞术方面的协助。本工作由通过西部地区卓越中心资助的 5 U54 AI057156 项目、NIH 资助项目 R01 AI08764301 以及 UTMB 疫苗开发塞利中心的资金支持。B.K. 得到 UTMB James W. McLaughlin 研究生奖学金基金的支持。O.L. 得到 Maurice R. Hilleman 早期职业研究者奖的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-乙炔基尿苷 | Berry Associates | PY 7563 | 溶于DMSO配制成100 mM储备液 |
| 12 mm圆形盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml聚苯乙烯管 | BD Biosciences | 352058 | |
| 放线菌素D（ActD） | Sigma | 9415 | 溶于DMSO配制成10 mM储备液 |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | 溶于H2O配制成100 mM储备液 |
| DAPI | Sigma | D-9542 | 溶于H2O配制成5 mg/ml储备液 |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| 荧光叠氮化物（Alexa Fluor 594偶联） | Invitrogen | A10270 | |
| 荧光叠氮化物（Alexa Fluor 657偶联） | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A-5960 | 溶于H2O配制成500 mM溶液 |
| 滤纸 | VWRbrand | 28333-087 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 聚-L-赖氨酸（分子量 ≥ 70000） | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma碱 | Sigma | T-1503 | 溶于H2O配制成1.5 M储备液，pH 8.5 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 荧光显微镜 | 例如 Olympus IX71 | ||
| 流式细胞仪 | 例如 BD Biosciences LSRII Fortessa |
参考文献
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