利用点击化学技术检测病毒感染对宿主细胞RNA合成的影响

摘要

本方法描述了利用点击化学技术检测裂谷热病毒MP-12株（RVFV MP-12）感染后宿主细胞转录水平变化的方法。结果可通过荧光显微镜进行定性观察，或通过流式细胞术获得定量数据。该方法可适用于其他病毒的研究。

摘要

许多RNA病毒已进化出抑制宿主细胞转录的能力，以此规避细胞的防御机制。因此，在研究这类病毒时，快速且可靠地测量感染细胞中转录活性的方法显得尤为重要。传统上，转录活性的测定方法包括放射性核苷酸（如³H-尿苷）掺入法，随后通过放射自显影或液体闪烁计数进行检测；或使用卤化尿苷类似物（如5-溴尿苷，BrU）掺入法，随后通过免疫染色进行检测。然而，使用放射性同位素需要专门的设备，在许多实验室环境中难以实现；而BrU的检测过程可能较为繁琐，且灵敏度较低。

近年来发展的点击化学技术，通过叠氮化物与炔烃在铜催化下形成三唑，现已成为上述两种方法的快速且高灵敏度的替代方案。点击化学是一种两步过程：首先通过掺入尿苷类似物5-乙炔基尿苷（EU）对新生RNA进行标记，随后利用荧光叠氮化物对标签进行检测。这些叠氮化物可与多种不同荧光染料偶联，为成像提供了广泛的选择。

本方案描述了一种利用点击化学方法检测裂谷热病毒（Rift Valley fever virus，RVFV）MP-12株感染细胞中转录抑制的技术。同时，通过经典的细胞内免疫染色法测定这些细胞中病毒蛋白的表达。步骤1至4详述了通过荧光显微镜观察转录抑制的方法，而步骤5至8则详述了通过流式细胞术定量转录抑制的方法。本方案易于调整，可用于其他病毒的研究。

引言

传统上，转录活性的检测依赖于将放射性核苷酸（³H-尿苷）¹ 或卤化核苷酸（BrU）² 掺入新生RNA中。这些尿苷类似物被细胞摄取后，通过核苷补救途径转化为尿苷三磷酸（UTP），随后掺入新合成的RNA中。³H-尿苷可通过自显影技术检测，但该方法耗时较长，或通过液体闪烁计数检测，但需要专用设备。此外，在一些实验室环境中，例如高等级生物安全防护实验室，使用放射性同位素可能并不实际。BrU可通过抗BrU抗体的免疫染色进行检测，但该方法可能需要强烈的细胞通透化处理，以确保抗体进入细胞核，或对RNA进行部分变性处理，因为RNA的二级结构可能在空间上阻碍抗体的结合。

本文所述方案利用近年来开发的点击化学³技术，检测感染RVFV MP-12毒株细胞中的转录活性。点击化学依赖于炔基与叠氮基团之间高效且高度选择性的铜(I)催化环加成反应^4,5。在本方案中，首先通过掺入尿苷类似物EU标记感染细胞中新合成的RNA；随后在第二步中，利用荧光标记的叠氮化合物与掺入的EU发生反应从而实现检测。该方法的主要优势在于：（1）无需使用放射性同位素；（2）无需进行剧烈的细胞通透化处理或RNA变性。由于荧光叠氮化合物分子量小于50 Da，因此即使细胞通透化不充分或存在RNA二级结构，也不会阻碍其进入细胞。此外，在将RNA检测与针对病毒蛋白的经典免疫染色相结合时，研究人员在一抗的选择上不....

方案

通过荧光显微镜分析转录

1. 用 MP-12 感染细胞并用 EU 标记新生 RNA

1. 将12 mm圆形盖玻片放入12孔细胞培养板中，每孔一片。

注意： 如果细胞难以贴附在盖玻片上，可在将其放入培养孔前用聚-L-赖氨酸（poly-L-lysine，分子量 ≥ 70,000）包被。为此，将盖玻片浸入无菌的 H₂O 中含 0.1 mg/ml 聚-L-赖氨酸的溶液₂用多聚-L-赖氨酸孵育5分钟。用无菌H₂O冲洗盖玻片。₂O 并在空气中干燥至少 2 小时。

2. 将293细胞接种到盖玻片上，每孔加入含5 × 10⁴个细胞的1 ml生长培养基（DMEM，含10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素）。在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中过夜培养。
3. 用MP-12病毒感染细胞，感染复数（m.o.i.）为3。至少设置两孔未感染细胞：其中一孔作为未感染对照，另一孔在步骤1.5中用放线菌素D（ActD）处理，作为转录抑制对照。吸去生长培养基，稀释病毒原液，使每孔加入的总体积为200 ml。在37 °C、5% CO₂的湿化培养箱中孵育1小时。

结果

RVFV（布尼亚病毒科）的NSs蛋白 布尼亚病毒科属 菲罗病毒属) ¹¹ 通过两种不同的机制抑制宿主细胞的普通转录：（i）通过结合基础转录因子 TFIIH 的 p44 亚基¹¹ 并通过促进TFIIH的p62亚基的蛋白酶体降解 ⁶. 疫苗株 RVFV MP-12 ¹³ 由于MP-12株可在生物安全二级实验室中操作，且不受美国对其他野生型裂谷热病毒株适用的“选择性致病原规则”限制，因此本方案所述实验均采用该毒株。MP-12株的NSs蛋白功能完整，仍具有抑制宿主转录的能力⁶携带缺失 NSs 基因 69% 区域的病毒 rMP12-C13type ¹⁴，已被用作对照病毒，该病毒缺乏所有NSs功能，包括抑制宿主细胞转录的能力。

图1 显示通过荧光显微镜获得的图像。在模拟感染的细胞中（图1a-1d），细胞核呈现亮红色，表明正在进行转录。由于细胞仅被EU标记1小时后.......

讨论

本方案描述了一种通过将尿苷类似物EU掺入新生RNA，以检测病毒感染对宿主细胞转录影响的方法。该方法相较于以往技术具有多项优势：操作快速、灵敏度高，且无需使用放射性同位素。此外，该方法可灵活应用于荧光显微镜获取定性数据，或通过流式细胞术获得定量数据，且基本使用相同的试剂。当与病毒抗原的免疫荧光染色结合使用时，该方法还可使研究人员区分被感染与未感染的细胞。

需要注意的是，该方法对新合成的病毒RNA的标记效率与宿主转录本相同，这一缺点与其他依赖于 ³H-尿苷或 BrU 掺入。然而，至少在 RVFV MP-12 感染的情况下，我们发现宿主转录本的量远超过病毒转录本的量，因此本检测所测得的总 RNA 中病毒 RNA 的影响可忽略不计。当将本方案用于其他病毒时，研究人员可通过病毒转录本的定位、用放线菌素 D（ActD）处理感染细胞，或通过荧光标记来识别病毒转录本 原位 荧光原位杂交（FISH）¹⁵. 如果病毒在细胞质中复制，例如 MP-12，则病毒 RNA 可以很容易地与细胞 RNA 区分开，因为在标记 1 小时后，细胞 RNA 仍.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
5-乙炔基尿苷	Berry Associates	PY 7563	溶于DMSO配制成100 mM储备液
12 mm圆形盖玻片	Fisherbrand	12-545-82
5 ml聚苯乙烯管	BD Biosciences	352058
放线菌素D（ActD）	Sigma	9415	溶于DMSO配制成10 mM储备液
Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG	Invitrogen	A-11029
牛血清白蛋白（BSA）	Santa Cruz	sc-2323
CuSO4	Sigma	C-8027	溶于H2O配制成100 mM储备液
DAPI	Sigma	D-9542	溶于H2O配制成5 mg/ml储备液
DMEM	Invitrogen	11965092
FBS	Invitrogen	16000044
荧光叠氮化物（Alexa Fluor 594偶联）	Invitrogen	A10270
荧光叠氮化物（Alexa Fluor 657偶联）	Invitrogen	A10277
Fluoromount-G	Southern Biotech	0100-01
L-抗坏血酸	Sigma	A-5960	溶于H2O配制成500 mM溶液
滤纸	VWRbrand	28333-087
多聚甲醛	Sigma	158127
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140122
聚-L-赖氨酸（分子量 ≥ 70000）	Sigma	P1274
Triton X-100	Sigma	T-8787
Trizma碱	Sigma	T-1503	溶于H2O配制成1.5 M储备液，pH 8.5
胰蛋白酶-EDTA	Invitrogen	25200056
荧光显微镜			例如 Olympus IX71
流式细胞仪			例如 BD Biosciences LSRII Fortessa