本方法描述了利用点击化学技术检测裂谷热病毒MP-12株(RVFV MP-12)感染后宿主细胞转录水平变化的方法。结果可通过荧光显微镜进行定性观察,或通过流式细胞术获得定量数据。该方法可适用于其他病毒的研究。
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本方法描述了利用点击化学技术检测裂谷热病毒MP-12株(RVFV MP-12)感染后宿主细胞转录水平变化的方法。结果可通过荧光显微镜进行定性观察,或通过流式细胞术获得定量数据。该方法可适用于其他病毒的研究。
许多RNA病毒已进化出抑制宿主细胞转录的能力,以此规避细胞的防御机制。因此,在研究这类病毒时,快速且可靠地测量感染细胞中转录活性的方法显得尤为重要。传统上,转录活性的测定方法包括放射性核苷酸(如3H-尿苷)掺入法,随后通过放射自显影或液体闪烁计数进行检测;或使用卤化尿苷类似物(如5-溴尿苷,BrU)掺入法,随后通过免疫染色进行检测。然而,使用放射性同位素需要专门的设备,在许多实验室环境中难以实现;而BrU的检测过程可能较为繁琐,且灵敏度较低。
近年来发展的点击化学技术,通过叠氮化物与炔烃在铜催化下形成三唑,现已成为上述两种方法的快速且高灵敏度的替代方案。点击化学是一种两步过程:首先通过掺入尿苷类似物5-乙炔基尿苷(EU)对新生RNA进行标记,随后利用荧光叠氮化物对标签进行检测。这些叠氮化物可与多种不同荧光染料偶联,为成像提供了广泛的选择。
本方案描述了一种利用点击化学方法检测裂谷热病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)MP-12株感染细胞中转录抑制的技术。同时,通过经典的细胞内免疫染色法测定这些细胞中病毒蛋白的表达。步骤1至4详述了通过荧光显微镜观察转录抑制的方法,而步骤5至8则详述了通过流式细胞术定量转录抑制的方法。本方案易于调整,可用于其他病毒的研究。
传统上,转录活性的检测依赖于将放射性核苷酸(3H-尿苷)1 或卤化核苷酸(BrU)2 掺入新生RNA中。这些尿苷类似物被细胞摄取后,通过核苷补救途径转化为尿苷三磷酸(UTP),随后掺入新合成的RNA中。3H-尿苷可通过自显影技术检测,但该方法耗时较长,或通过液体闪烁计数检测,但需要专用设备。此外,在一些实验室环境中,例如高等级生物安全防护实验室,使用放射性同位素可能并不实际。BrU可通过抗BrU抗体的免疫染色进行检测,但该方法可能需要强烈的细胞通透化处理,以确保抗体进入细胞核,或对RNA进行部分变性处理,因为RNA的二级结构可能在空间上阻碍抗体的结合。
本文所述方案利用近年来开发的点击化学3技术,检测感染RVFV MP-12毒株细胞中的转录活性。点击化学依赖于炔基与叠氮基团之间高效且高度选择性的铜(I)催化环加成反应4,5。在本方案中,首先通过掺入尿苷类似物EU标记感染细胞中新合成的RNA;随后在第二步中,利用荧光标记的叠氮化合物与掺入的EU发生反应从而实现检测。该方法的主要优势在于:(1)无需使用放射性同位素;(2)无需进行剧烈的细胞通透化处理或RNA变性。由于荧光叠氮化合物分子量小于50 Da,因此即使细胞通透化不充分或存在RNA二级结构,也不会阻碍其进入细胞。此外,在将RNA检测与针对病毒蛋白的经典免疫染色相结合时,研究人员在一抗的选择上不受限制。
本方案中描述了两种不同的方法:一种用于通过荧光显微镜观察转录过程(步骤1-4),另一种用于通过流式细胞术定量转录水平(步骤5-8)。这两种方法均结合了新生RNA的标记与病毒蛋白的细胞内免疫染色,从而能够在单细胞水平上分析转录活性与病毒感染之间的相关性。
作者已成功应用此处所述方案,检测了感染RVFV MP-12株6的细胞、感染不同MP-12突变株的细胞7,8,9以及感染托斯卡纳病毒(TOSV)的细胞10中的转录活性。本方案可轻松适用于其他病毒,并可进一步修改以结合针对特定病毒或细胞蛋白的免疫荧光染色。
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通过荧光显微镜分析转录
1. 用 MP-12 感染细胞并用 EU 标记新生 RNA
注意: 如果细胞难以贴附在盖玻片上,可在将其放入培养孔前用聚-L-赖氨酸(poly-L-lysine,分子量 ≥ 70,000)包被。为此,将盖玻片浸入无菌的 H₂O 中含 0.1 mg/ml 聚-L-赖氨酸的溶液2用多聚-L-赖氨酸孵育5分钟。用无菌H₂O冲洗盖玻片。2O 并在空气中干燥至少 2 小时。
注意: 细胞也可通过转染质粒DNA进行处理,而非感染细胞 体外 合成编码特定病毒蛋白的RNA。为此,按照制造商说明书,使用适当的化学转染试剂对细胞进行转染,并于转染后16小时进入步骤1.5。建议在RNA标记和固定前,优化转染条件和孵育时间。
注意:如果将本方案用于其他病毒,建议进行时间进程实验,以确定 RNA 标记和固定的最适时间点。设置该时间进程实验时,应使感染时间错开,以便所有样品可在同一时间进行标记、固定和染色。
注意:配制4% PFA固定液时,将10 g多聚甲醛溶解于150 ml加热至60 °C的H2O中,使用加热磁力搅拌器搅拌。加入500 μl的1 M NaOH,并继续搅拌至溶液澄清。用滤纸过滤PFA溶液以去除颗粒物,然后加入62.5 ml磷酸盐缓冲液(77 mM NaH2PO4,287 mM Na2HPO4,pH 7.4)。用H2O定容至总体积250 ml。分装成一次性使用量,于-20 °C冷冻保存。
注意: 必须立即进行点击反应,因为RNA在此阶段长时间存放会发生降解;即使细胞在4 °C下保存1小时,也可观察到RNA荧光信号的减弱。同样,若进行时间进程实验,务必同时对所有样品进行标记、固定和染色。
2. 点击反应检测标记的RNA
注意: 步骤 2.1 至 2.3 中使用的所有溶液均需为无核酸酶的。
注意:组装湿化室时,用直径为10 cm的塑料封口膜铺垫细胞培养皿或培养皿底部,并用湿润的纸巾沿皿内边缘内侧铺一圈。将盖玻片放置在塑料封口膜上。
注意:在本实验方案的任何步骤中,均需注意避免盖玻片干燥。将盖玻片放入湿盒后,应立即直接向每张盖玻片上添加染色液为佳。
注意:请在此步骤前立即新鲜配制点击染色溶液。1.5 M Tris(pH 8.5)、100 mM CuSO4 和 500 mM 抗坏血酸的储存液可保存在 4 °C。然而,若抗坏血酸储存液变为黄色,则必须弃用。
注意:务必选择与荧光显微镜滤光片相匹配的荧光染料。
注意:如果无需检测病毒蛋白,可在本步骤后直接封片并进行成像(继续执行步骤 3.3)。
3. 免疫荧光法检测病毒蛋白的表达
注意: 在将本方案用于其他病毒时,应首先确定一抗的最佳稀释比例。
注意:或者,此步骤也可在 4 °C 避光过夜进行。
注意:请务必选择一种能够识别您的初级抗体并匹配荧光显微镜滤光片的二抗。
注意: 如有需要,可在二抗稀释液中加入 200 ng/ml DAPI 以显示细胞核。
注意:若在倒置显微镜上进行成像,请将Fluoromount-G在4 °C过夜冷却使其凝固,或使用透明指甲油封固盖玻片边缘,将其固定于载玻片上。
注意:载玻片可立即成像,或在 4 °C 避光条件下保存最多一周。
4. 数据采集
注意:请务必选择适合您显微镜观测的荧光染料。作为参考,以下列出了本出版物中所示图像所使用的荧光染料及滤光片组。
DAPI:
激发滤光片:BP 330 - 385
二向色镜:DM 400
发射滤光片:LP 420
激发/发射最大值为 495/519 的荧光染料:
激发滤光片:BP 460 - 490
二向色镜:DM 505
发射滤光片:LP 510
激发/发射最大值为 590/617 的荧光染料:
激发滤光片:BP 545 - 580
二向色镜:DM 600
发射滤光片:LP 610
通过流式细胞术分析转录
5. 用MP-12感染细胞并用EU标记新生RNA
注意:如果将本方案改编用于其他病毒,建议进行时间进程实验,以确定标记和收获的最佳时间点。设置该时间进程实验时,应使感染时间依次错开,以便所有样品可在同一时间进行标记、收获和染色。
注意:在此步骤及后续步骤中,离心速度不得超过 500 - 1,000 ×g,以防止细胞破裂。离心 1 - 2 分钟以沉淀细胞。
注意:如果计划在点击反应后进行表面免疫染色,则应使用橡胶刮刀或一次性细胞刮刀收集细胞。
注意: 必须立即进行点击反应,因为RNA在此阶段长时间放置会降解。同样,如果进行时间进程实验,务必在同一时间对所有样品进行标记、固定和染色。
6. 点击化学反应检测标记的RNA
注意: 步骤 6.1 至 6.3 中使用的所有溶液均需无核酸酶。
注意:如果细胞在此步骤中沉淀不充分,可将离心时间延长至5分钟。当细胞悬浮于FACS缓冲液中后(步骤6.4),其沉淀性能将有所改善。
注意:此步骤中不要使用EDTA,因为它会螯合点击反应所必需的Cu2+离子。
注意:请在此步骤前立即新鲜配制点击染色溶液。1.5 M Tris(pH 8.5)、100 mM CuSO4 和 500 mM 抗坏血酸的储存液可保存在 4 °C。然而,若抗坏血酸储存液变为黄色,则必须弃用。
注意:如果细胞在此步骤中发生聚集,可通过反复吹打数次重新悬浮细胞。
注意:务必选择一种可被您的流式细胞仪检测到的荧光染料。
注意:还需准备一份未进行点击化学染色步骤的感染细胞样本,用于流式细胞仪的校准。可在第5.2步中使用一半的感染细胞,或额外设置一个感染孔。这些对照细胞将在第7.1步进行免疫染色。
注意:如果不需要对病毒蛋白进行免疫染色,可立即分析细胞(进入步骤8)。
7. 免疫荧光法检测病毒蛋白的表达
注意: 或者,此步骤也可在 4 °C 避光过夜(O/N)进行。
注意:还需准备一份未感染的细胞样本,该样本需经过点击化学染色步骤但不进行免疫染色,用于流式细胞仪的校准。可在第5.2步中使用一半的模拟感染细胞,或额外设置一个未感染的孔。
注意: 当将本方案用于其他病毒时,应首先确定一抗的最佳稀释度。
注意: 此时,细胞可在 4 °C 避光条件下过夜保存。
8. 数据采集
注意:请务必选择适合您仪器检测的荧光染料。作为参考,以下是在本出版物中获取所示数据时所使用的激光线和滤光片组合。
激发/发射光谱为 495/519 的荧光染料:
激光:488 nm
滤光片:530/30
激发/发射光谱为 650/665 的荧光染料:
激光:640 nm
滤光片:670/20
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RVFV(布尼亚病毒科)的NSs蛋白 布尼亚病毒科属 菲罗病毒属) 11 通过两种不同的机制抑制宿主细胞的普通转录:(i)通过结合基础转录因子 TFIIH 的 p44 亚基11 并通过促进TFIIH的p62亚基的蛋白酶体降解 6. 疫苗株 RVFV MP-12 13 由于MP-12株可在生物安全二级实验室中操作,且不受美国对其他野生型裂谷热病毒株适用的“选择性致病原规则”限制,因此本方案所述实验均采用该毒株。MP-12株的NSs蛋白功能完整,仍具有抑制宿主转录的能力6携带缺失 NSs 基因 69% 区域的病毒 rMP12-C13type 14,已被用作对照病毒,该病毒缺乏所有NSs功能,包括抑制宿主细胞转录的能力。
图1 显示通过荧光显微镜获得的图像。在模拟感染的细胞中(图1a-1d),细胞核呈现亮红色,表明正在进行转录。由于细胞仅被EU标记1小时后...
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本方案描述了一种通过将尿苷类似物EU掺入新生RNA,以检测病毒感染对宿主细胞转录影响的方法。该方法相较于以往技术具有多项优势:操作快速、灵敏度高,且无需使用放射性同位素。此外,该方法可灵活应用于荧光显微镜获取定性数据,或通过流式细胞术获得定量数据,且基本使用相同的试剂。当与病毒抗原的免疫荧光染色结合使用时,该方法还可使研究人员区分被感染与未感染的细胞。
需要注意的是,该方法对新合成的病毒RNA的标记效率与宿主转录本相同,这一缺点与其他依赖于 3H-尿苷或 BrU 掺入。然而,至少在 RVFV MP-12 感染的情况下,我们发现宿主转录本的量远超过病毒转录本的量,因此本检测所测得的总 RNA 中病毒 RNA 的影响可忽略不计。当将本方案用于其他病毒时,研究人员可通过病毒转录本的定位、用放线菌素 D(ActD)处理感染细胞,或通过荧光标记来识别病毒转录本 原位 荧光原位杂交(FISH)15. 如果病毒在细胞质中复制,例如 MP-12,则病毒 RNA 可以很容易地与细胞 RNA 区分开,因为在标记 1 小时后,细胞 RNA 仍...
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我们感谢 R.B. Tesh 提供小鼠多克隆抗裂谷热病毒抗血清,感谢 UTMB 流式细胞术核心设施的 M. Griffin 在流式细胞术方面的协助。本工作由通过西部地区卓越中心资助的 5 U54 AI057156 项目、NIH 资助项目 R01 AI08764301 以及 UTMB 疫苗开发塞利中心的资金支持。B.K. 得到 UTMB James W. McLaughlin 研究生奖学金基金的支持。O.L. 得到 Maurice R. Hilleman 早期职业研究者奖的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 5-乙炔基尿苷 | Berry Associates | PY 7563 | 溶于DMSO配制成100 mM储备液 |
| 12 mm圆形盖玻片 | Fisherbrand | 12-545-82 | |
| 5 ml聚苯乙烯管 | BD Biosciences | 352058 | |
| 放线菌素D(ActD) | Sigma | 9415 | 溶于DMSO配制成10 mM储备液 |
| Alexa Fluor 488山羊抗小鼠IgG | Invitrogen | A-11029 | |
| 牛血清白蛋白(BSA) | Santa Cruz | sc-2323 | |
| CuSO4 | Sigma | C-8027 | 溶于H2O配制成100 mM储备液 |
| DAPI | Sigma | D-9542 | 溶于H2O配制成5 mg/ml储备液 |
| DMEM | Invitrogen | 11965092 | |
| FBS | Invitrogen | 16000044 | |
| 荧光叠氮化物(Alexa Fluor 594偶联) | Invitrogen | A10270 | |
| 荧光叠氮化物(Alexa Fluor 657偶联) | Invitrogen | A10277 | |
| Fluoromount-G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| L-抗坏血酸 | Sigma | A-5960 | 溶于H2O配制成500 mM溶液 |
| 滤纸 | VWRbrand | 28333-087 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140122 | |
| 聚-L-赖氨酸(分子量 ≥ 70000) | Sigma | P1274 | |
| Triton X-100 | Sigma | T-8787 | |
| Trizma碱 | Sigma | T-1503 | 溶于H2O配制成1.5 M储备液,pH 8.5 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Invitrogen | 25200056 | |
| 荧光显微镜 | 例如 Olympus IX71 | ||
| 流式细胞仪 | 例如 BD Biosciences LSRII Fortessa |
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