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方法文章

酵母发光检测与Xenopus卵母细胞电生理检测对TRPV4分子机械敏感性的研究

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DOI：

10.3791/50816

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2013年12月31日

 ,  ,  , 
1Laboratory of Cell and Molecular Biology, University of Wisconsin – Madison, 2Department of Genetics, University of Wisconsin – Madison

本文内容

摘要

为了补充研究TRPV4的常用方法，本文描述了两种方法：可通过低渗刺激下转基因酵母中的Ca2+-腔肠素发光测定法来研究其机械敏感性；也可通过向Xenopus卵母细胞注射TRPV4 RNA，利用全细胞双电极电压钳或膜片钳技术（在贴附式或游离式模式下）进行检测。

摘要

TRPV4（瞬时受体电位香草素亚型4）在脊椎动物组织中广泛表达，可被多种刺激激活，包括机械力。某些TRPV4基因突变会导致人类复杂的遗传性骨骼或神经病理疾病。野生型或突变型TRPV4转基因通常在培养的哺乳动物细胞中表达，并通过Fura-2荧光测定法和电极技术进行检测。然而，关于其机械敏感性的机制以及相关疾病的分子基础，目前文献报道存在混乱和争议。为补充现有研究方法，本文描述了两种可用于研究TRPV4分子特性的附加方法。（1）将大鼠TRPV4基因与aequorin转基因共同转化至出芽酵母中。对转化后的酵母群体施加低渗冲击，TRPV4通道介导的Ca2+释放会与aequorin结合，产生光信号。在此系统中，TRPV4脱离了其在哺乳动物细胞中常见的伴侣蛋白环境，因而能够揭示其自身的机械敏感性。（2）将TRPV4的cRNA注射到非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞中。经过适当孵育后，采用双电极电压钳技术检测其宏观电流。当从卵母细胞浴液中去除惰性渗透物时，电流的上升可指示其机械敏感性。卵母细胞产生的微安级（10-6 至 10-4 A）电流远大于培养细胞中的亚纳安至纳安级（10-10 至 10-9 A）电流，因而可实现更清晰的定量分析和更可靠的结果评估。此外，通过膜片钳技术（在贴附式或切除式模式下），还可直接记录反映单个通道蛋白活性的微观电流。同一枚卵母细胞可提供多个膜片记录样本，有利于提高数据的可重复性。对膜片施加负压可激活TRPV4，从而直接评估其机械敏感性。这些方法亦可用于研究其他类型的TRP通道。

引言

瞬时受体电位（TRP）通道包含七个阳离子通道亚家族，具有感觉功能1,2。在哺乳动物中，TRP通道的香草素亚家族（TRPV）有六种亚型。TRPV4（4型）3,4可响应热刺激、某些化学物质、渗透性肿胀或剪切应力。研究人员曾多次通过候选基因法和/或表达克隆法分离出TRPV4基因5-8，其中表达克隆法依据的是该基因产物对低渗环境的反应。TRPV4在几乎所有器官中均有表达，并参与多种不同类型细胞的发育、生理或病理过程3,4。

引人注目的是，已发现 >50 种人类常染色体显性 TRPV4 突变，可导致周围神经病变和/或骨骼发育异常（骨骼发育异常）9-11。这些骨骼发育异常的表型范围广泛，从轻度的3型短肢畸形（3型侏儒症）、科兹沃夫斯基型脊椎骨骺发育不良，到严重的发育异常，其中一些可导致新生儿或胚胎期死亡。尽管各种可能的致病机制均被提出，但目前尚无一种机制能够解释这些疾病在多样性、复杂性、变异性以及偶尔出现的表型重叠方面的特征4。

与其他TRP通道1类似，TRPV4是一种四聚体。在大鼠或人TRPV4中，每个亚基由871个氨基酸残基组成。其核心结构为六个跨膜α螺旋（S1-S6），其排列方式可能类似于电压门控K+通道。其中，S1至S4构成一个外周结构域，而S5和S6则形成通透性孔道结构域。在TRPV4的S5和S6之间存在一段短的孔螺旋，其后接序列为LDLFKLTIGMGDL，其中四个残基可能汇聚形成阳离子选择性滤过器。该蛋白的470个残基组成的N端胞质段包含6个锚蛋白重复序列，已知可结合蛋白质或小分子配体。C端152个残基的胞质段则包含一个钙调蛋白结合序列，以及其他可能结合其他分子的位点3。

TRPV4 是一种阳离子通道，基本不通过阴离子1。其生理功能主要是将刺激信号转导为 Ca2+ 内流，但也允许其他阳离子通过，具有 Eisenman IV 型通透性序列，对二价阳离子的通透性占优势，PCa : PNa 比值约为 712。单通道电导在向外方向约为 90 pS，在向内方向约为 40 pS，并呈现整流特性6,13,14。异源表达的电流（如下所示）可被低渗膨胀、剪切应力或温热激活15。此外，多不饱和脂肪酸16,17 和合成佛波酯 4αPDD18 也可激活该通道。目前最强效的激动剂是 GSK1016790A19，拮抗剂为 GSK2193874，两者均通过高通量小分子筛选发现，在浓度为 10-9 至 10-8 M 范围内即有效20。

TRPV4 研究中仍有两个关键领域存在困惑：（1）尽管 TRPV4 主要因其机械敏感性而被研究，但其分子基础仍存在争议。一种模型认为低渗状态以某种方式激活磷脂酶 A2（PLA2），从而产生多不饱和脂肪酸（PUFA）花生四烯酸（AA），后者经环氧化酶转化为环氧二十碳三烯酸（EET），EET 与 TRPV4 结合并使其激活16,17。然而，已有研究表明 TRPV4 本身可直接响应细胞膜牵张14（见下文），这提供了一种更简单的解释。（2）TRPV4 突变引起的病理表现令人困惑。从根本上说，需要明确这些疾病是由于通道活性的丧失、降低还是增强所致。然而在此问题上，现有文献远未达成一致。尽管多个骨骼发育不良相关等位基因被报道具有更高的活性（功能获得型，GOF）4,21，但也有若干被报道表现为活性降低（功能丧失型，LOF）10,22。一项针对14个等位基因的系统性研究发现它们均为 GOF 突变（见下文）23。认为其中部分为 LOF 的说法似乎与 trpV4-/- 基因敲除小鼠的表型相矛盾，该小鼠在完全缺失 TRPV4 功能的情况下仍可存活且具有生育能力，仅表现出轻微缺陷。

这些争议的一部分源于方法学。不同实验室采用不同的方法或同一方法的不同变体，并使用不同的评判标准。最常见的是，在培养的哺乳动物细胞（HEK、CHO、HeLa）中瞬时表达TRPV4，并通过Ca2+敏感性荧光染料Fura-2检测激动剂或低渗刺激引起的细胞内[Ca2+]升高。这种对荧光测定法的过度依赖已受到批评1。不同细胞群体中的表达水平、其分布情况以及染料的有效浓度均需加以控制并记录。更为可靠的方法是直接进行电生理检测。然而，即使这种方法在常规操作中也存在问题。由于单个培养细胞中的表达水平难以控制，全细胞电流存在较大变异。此外，由于电流信号较小，获得可靠的统计结果需要较大的样本量，而这往往难以实现。膜片钳检测很少被实施，部分此类记录显示出成簇的活动爆发，使得统计分析变得困难16,17。

为了更好地理解分子机械敏感性，我们开发了另外两种系统来研究TRPV4。（1）为了将TRPV4从其通常的哺乳动物互作分子中分离出来，我们表达了大鼠TRPV4 TRPV4 在酿酒酵母中24功能性表达 TRPV4 在这种进化距离较远的背景下，结果表明，即使没有其通常的相互作用伙伴，TRPV4 仍能响应渗透力。由于酵母不合成花生四烯酸（AA）或环氧二十碳烯酸（EET）等多不饱和脂肪酸，且其基因组中不存在磷脂酶 A2（PLA2）或环氧合酶基因，该表达结果进一步表明，这些分子成分对于 TRPV4 感知力学刺激并非必需。将 TRPV4 表达于分子生物学操作最为便利的真核生物中，也有利于高效开展正向或反向遗传学操作。25. (2) 为对TRPV4进行深入的生物物理分析，我们在 非洲爪蟾 卵母细胞。与可产生亚纳安至纳安（10-10 至 10-9 A) 电流，卵母细胞表达的电流单位为微安（µA）（10-6 至 10-4 A) 信噪比显著提高，有助于实现更精确的定量分析和更可靠的比较。如此表达的TRPV4还可通过膜片钳技术对单个分子进行检测。单个卵母细胞允许多次进行膜片采样，进一步提高了定量的可靠性。此类研究表明，TRPV4通道本身可直接被膜牵张力激活。14分析还显示，14个代表性骨骼发育不良等位基因均为功能获得性突变。此外，该组成型Ca2+ 渗漏程度与骨骼疾病的严重程度平行23.

由于这两种方法具有新颖性和实用性，现将其详细操作步骤整理于此，以便今后在TRPV4或类似通道的研究中进行重复验证。

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方案

1. 酵母发光测定法

使用酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）BYYT菌株。该菌株是BY4741（MATa, ura3D0, his3D1, leu2D0, lys2D0, yvc1::HIS3, tok1::kanMX4）的yvc1- tok1-衍生菌株。按照Batiza等26和Loukin 等24所述方法，用携带leu筛选标记并表达aequorin的质粒pEVP1/Aeq以及携带ura筛选标记并表达大鼠TRPV4的质粒p416GPDV4转化酵母细胞。质粒构建和转化采用标准方法27。酵母菌株和质粒可应要求提供。

  1. 在30 °C摇床中，将2 ml酵母细胞接种于含1 M山梨醇的leu- ura- “DCD”缺陷培养基28（一种硫酸盐缺乏型的CMD-leu-ura培养基29）中，过夜培养至对数生长后期。取200 µl上述培养物接种至1.8 ml新鲜培养基中，并补充2 µM腔肠素（coelenterazine），于室温避光静置培养24小时。
  2. 使用蒸气压渗透压仪测定培养物（通常为1,400 mOsM）及其他溶液（如下）的渗透压。
  3. 将20 µl新鲜培养物分装至12 mm发光仪试管中，用于单管型发光仪检测。
  4. 进行低渗冲击时，加入200 µl溶液，该溶液含有25 mM NaEGTA（pH 7.2）或NaMES（pH 7.2）以及500–100 mM NaCl（总渗透压为1,200–400 mOsM），具体浓度根据所需冲击强度调整。在渗透压下降冲击前后持续监测发光信号，仅在短暂稀释操作时中断，至少记录冲击后120秒内的发光值。将发光仪输出结果在台式计算机上记录为相对发光单位（RUL）。

尽管未用于转基因TRPV4的研究，我们已在自动化系统中采用上述方案的一种变体，用于检测大量酵母菌株的反应。利用微孔板发光仪并结合相应软件，成功分析了酵母基因缺失文库（包含4,906种单基因缺失突变株）对低渗30或高渗31刺激的反应。

2 和 3. 卵母细胞电生理学方法

膜片钳技术采用基本方法32。使用高保真PfuUtra聚合酶对野生型或突变型TRPV4的开放读码框进行PCR扩增，并将其克隆至pGH19载体中33。该过程将ORF精确插入至Xenopus β-珠蛋白基因的5'和3'非翻译区之间，并位于T7 RNA聚合酶启动子的下游。在3'非翻译区下游将构建体线性化，作为体外 T7 RNA聚合酶转录反应的模板。采用标准的分子生物学技术34。

使用X. laevis的V-VI期卵母细胞。动物饲养、部分卵巢切除、去滤泡及卵膜去除均按照标准操作流程进行32,33,35。使用Drummond Nanoinject II自动显微注射仪，每枚卵母细胞注射2-40 ng的cRNA溶液。每组实验注射约30枚卵母细胞。在注射TRPV4-cRNA后，将卵母细胞在含有庆大霉素（100 µg/ml）和1 µM 钌红14的ND96培养基中孵育。

2. 双电极电压钳

  1. 使用拉针仪从一次性精密 100 µl 微量移液器中单独拉制硼硅酸盐玻璃记录电极。
  2. 拉制用于测量电压和注入电流的电极，使其尖端孔径约为 1 µm。
  3. 用 2 M KCl 从后端填充电极，使其电阻达到 0.1–0.2 mΩ。将电极安装在 HS2A 头级放大器上，该放大器与 VG-2Ax100 虚地浴槽钳制装置一起，通过 Digidata 1440 数模转换器连接至 GeneClamp 500 放大器接口。使用 pClamp10 软件采集数据。
  4. 将待测卵母细胞置于安装在解剖显微镜载物台上的定制塑料腔室内的 1 ml 浴液中，显微镜放大倍数为 20X。浴液通过靠近卵母细胞放置的 3 M KCl 琼脂桥和氯化银丝实现虚地连接，并接入 VG-2A 虚地头级放大器。
  5. 使用塑料管作为进液和出液通道，构建可连续灌流的腔室。进液管连接至定制的灌流系统，该系统由六个 50 ml 注射器壳体组成的多通管路构成，每个注射器内装有不同的溶液。通过在管路上使用“Keck”斜面夹控制任一特定溶液的重力驱动流速至约 2–3 ml/min。
  6. 将两个电极连同其头级放大器安装在显微操作器上，通过显微操作完成电极对卵母细胞的穿刺。

3. 直接机械敏感性的膜片钳检测

膜片钳技术的基本方法，包括移液管制备、吉欧姆（GΩ）密封的形成以及细胞贴附或分离膜片模式的建立，参见 Hamill et al.36 和 Conn32。

  1. 使用尖端直径约 1 µm（气泡等级 5-6）的硼硅酸盐玻璃移液管，装入含 98 mM KCl、1 mM MgCl2 和 10 mM K+-HEPES（pH 7.2）的溶液。
  2. 通过塑料管将膜片钳移液管连接至 5 ml 注射器，并通过 T 型接头同时连接至压力计。使用计算机同步采集电极和压力计的信号。以 10 kHz 采样频率记录数据，分析时再通过八极贝塞尔滤波器以 1 kHz 进行回放。
  3. 可从同一个卵母细胞上反复分离出不同的膜片。该方法可提高对 TRPV4 分子活性检测的效率与可靠性。

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结果

在典型的发光测定实验中，通过将200 μl不同低渗透压的冲击溶液加入到20 μl渗透压为1,400 mOsM的培养物中，可实现400–1,200 mOsM范围的低渗向下冲击。当实验组的相对发光单位（RLU）与两个阴性对照组进行比较时，TRPV4的活性表现明显：阴性对照组分别为转化了空质粒p416GPDV4的酵母细胞，或转化了在离子选择性滤过区含有突变的TRPV4基因质粒的酵母细胞（图1）24。

在典型的双电极电压钳实验中，卵母细胞最初浸没于持续流动的等渗浴液中，浴液成分（单位为 mM）包含 66 KMeSO4、1.8 Ba(MeSO4)2、5 K+-HEPES（pH 7.2）和 100 山梨醇。每 10 秒从 -20 mV 的保持电位施加 +20 mV、持续 100 毫秒的测试脉冲，于脉冲末尾测定峰值电流。为诱发低渗反应，将灌流液更换为不含山梨醇但其他成分相同的溶液。当重新加入山梨醇时，该低渗反应可逆；此外，TRP 通道阻...

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讨论

如引言所述，研究TRPV4功能的常用方法有时会导致结果不一致和争议。本文所述的两套方法具有一些优势，可作为现有方法的补充。尽管本文仅描述了TRPV4的相关研究，这些方法也可拓展用于研究其他离子通道。

1. 酵母发光检测方法

酿酒酵母在低渗休克下具有天然的Ca2+内流反应，该反应会因影响脂质组成的突变而增强30。此信号可通过外源性EGTA消除。然而，该螯合剂无法消除异源表达的TRPV4所介导的信号24，表明该通道表达于细胞内膜，极有可能位于内质网膜上，从而在渗透休克时将Ca2+从内质网释放至细胞质中。异源表达通道在酵母中的运输过程尚未被研究。若将该方法拓展至其他TRP通道或其他假定的机械敏感性通道的研究，必须进行螯合实验，并需考虑内源性系统的存在。

2A. 双电极电压钳

与膜片钳实验不同，双电极电压钳实验是在完整卵母细胞上进行的，此时卵黄膜...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢Andrea Kremsreiter提供的出色技术协助。本实验室的工作由美国国立卫生研究院（NIH）GM096088项目以及威斯康星大学麦迪逊分校Vilas Trust基金资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
蒸气压渗透压计WescorWescor 5500美国犹他州洛根
Sirius 单管发光检测仪 Titertek-BerholdSirius美国路易斯安那州亨茨维尔
微孔板发光检测仪Titertek-BertholdMithras LB940美国路易斯安那州亨茨维尔
发光检测软件Titertek-BertholdMikroWin2000美国路易斯安那州亨茨维尔
膜片钳系统及软件Axon InstrumentHS2A 头级放大器、VG-2Ax100 虚拟接地浴槽钳制装置、GeneClamp 500 放大器、digidata 1440 数字转换器、pClamp10 软件美国加利福尼亚州联合市
压力计Bio-Tec美国佛蒙特州维努斯基
玻璃微电极拉制仪Sutter Instrument CoModel P-97美国加利福尼亚州诺瓦托
微量注射仪Drummond ScientificNanoinject II美国宾夕法尼亚州布鲁马尔
腔肠素荧光素Invitrogen美国加利福尼亚州卡尔斯巴德
T7 RNA 聚合酶反应试剂盒AmbionmMessage mMachine美国德克萨斯州奥斯汀
庆大霉素Sigma 
钌红 Sigma 
微量移液管 Drummond100 微升微量移液管美国宾夕法尼亚州布鲁马尔
高保真 PfuUtra 聚合酶 Stratagene美国加利福尼亚州拉霍亚

参考文献

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