完整心脏中单个线粒体超氧闪光的共聚焦成像 体内

摘要

共聚焦扫描显微镜用于在活体动物的灌注心脏或骨骼肌中成像单个线粒体事件。对单个线粒体过程（如超氧自由基闪光和膜电位波动）进行实时监测，能够在生理相关环境以及病理干扰条件下评估线粒体功能。

摘要

线粒体是真核生物系统中一种关键的细胞内细胞器，负责能量生成和细胞内信号传导。线粒体功能障碍常伴随人类疾病发生，并在其中发挥促进作用。目前开发的用于评估线粒体功能与功能障碍的大多数方法均基于 体外 或 离体 测量。这些实验的结果在确定线粒体功能方面能力有限 体内在这里，我们介绍一种利用共聚焦扫描显微镜对活体动物完整组织进行成像的新方法，该方法可实时评估单个线粒体的功能。 体内首先，我们构建表达线粒体靶向的超氧阴离子指示剂——环状重排的黄色荧光蛋白（mt-cpYFP）的转基因小鼠。将麻醉后的mt-cpYFP小鼠固定于定制的载物台适配器上，对暴露的后肢骨骼肌进行延时成像。随后处死小鼠，取出心脏并连接至Langendorff灌流系统，以37 °C的生理溶液进行灌流。将灌流中的心脏置于共聚焦显微镜载物台上的特制腔室中，并施加轻柔压力以固定心脏，抑制心跳引起的空间位移伪影。通过每秒一帧的实时二维共聚焦成像检测超氧闪变信号。灌流液可添加不同的呼吸底物或其他荧光指示剂，亦可通过调整灌流条件构建缺血-再灌注等疾病模型。该技术为在完整组织中研究单个线粒体功能提供了一种独特的方法 体内.

引言

线粒体在细胞生物能量学、自由基信号传导、氧化还原稳态、离子调节以及细胞命运决定中发挥核心作用^1,2。线粒体功能障碍常常伴随并参与多种疾病的发病机制^3-6。尤其在心脏和骨骼肌等肌肉系统中，线粒体呼吸作用提供了大部分ATP，以支持细胞内钙离子的及时调控和强健的收缩力生成^7,8。这些肌肉含有大量线粒体，其体积可占细胞总体积的20–40%，并"固定"分布于肌丝之间²。

尽管已有大量研究，但我们对线粒体功能调控的理解，特别是在活体（in vivo）和生理相关条件下的调控，仍然有限。其中一个原因是，目前开发的大多数评估线粒体功能的方法依赖于体外（in vitro）或离体（ex vivo）手段，例如通过人工底物补充后监测分离线粒体的耗氧量，或通过形态学（例如 电子显微镜）、酶活性（例如 顺乌头酸酶活性）或细胞内ATP水平等间接方式来评估线粒体功能^9-11。

近年来，具有相对线粒体富集特性的 小分子荧光探针 已被用于观察完整细胞中线粒体的信号，包括膜电位、钙离子和活性氧（ROS）^11-13此外，已开发出多种基于绿色荧光蛋白（GFP）的氧化还原与活性氧（ROS）探针，以实现对区室化细胞内氧化还原状态或ROS信号的更特异性检测。^14-16其中，我们开发了一种可遗传编码的超氧阴离子指示剂——环状重排的黄色荧光蛋白，并将其靶向定位至线粒体（mt-cpYFP）¹⁷mt-cpYFP 可在 405 或 488 nm 激发，两种激发条件下的发射峰均位于 515 nm。在 488 nm 激发时的发射信号对超氧阴离子具有特异性响应，这一点已被先前研究证实。 体外 和 体内 校准^17,18405 nm 激发下的发射信号用作内参对照（有关 mt-cpYFP 在不同条件下的激发和发射光谱的详细信息，请参见参考文献17中的图1）。通过时间推移共聚焦成像，该探针可检测完整细胞中单个线粒体内爆发性超氧阴离子生成事件，称为超氧闪（superoxide flash）。超氧闪是线粒体呼吸功能的综合体现，伴随短暂的线粒体膜去极化和活性氧（ROS）的产生^17-20最近，我们利用pUC-CAGGS-mt-cpYFP载体构建了泛组织mt-cpYFP转基因小鼠^17,19 在C57/BL6背景下验证了该指示剂在心脏、骨骼肌及其他组织中的强表达（图2). 转基因小鼠将在华盛顿大学批准材料转让协议（MTA）后，根据请求提供给感兴趣的学术研究人员。

在本研究中，我们描述 原位 离体灌注心脏中超氧闪光的成像以及 体内 麻醉状态下mt-cpYFP转基因小鼠骨骼肌中闪光事件的成像^17,19该技术可在生理相关条件下实时监测单个线粒体活性氧生成事件 体内 ^21,22还可以利用该系统结合适当的荧光探针监测其他单个线粒体参数，如膜电位和钙离子浓度。此外，可同步或平行评估线粒体功能与细胞内事件例如 钙瞬变）或心脏功能（例如 射血分数）可以实现。可通过向灌注心脏施加缺血与再灌注等病理干扰，以评估应激对完整心肌中单个线粒体功能的影响。

方案

1. 实验准备

1. 配制等渗平衡盐溶液（50 ml），其中包含：140 mM NaCl、5 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、10 mM 葡萄糖、10 mM HEPES，用 NaOH 调节 pH 至 7.4。₂，2 mM MgCl₂ 和10 mM HEPES（pH 7.2）用于 体内 骨骼肌成像
2. 配制 1 L 含有以下成分的克雷布斯-亨塞尔特缓冲液（KHB）：118 mM NaCl、5.3 mM KCl、1.2 mM MgSO₄₄，0.5 mM EDTA 和 25 mM NaHCO₃₃.
3. 用含95% O₂的气体对KHB进行鼓泡处理₂/5% CO₂₂ 在加入 2 mM CaCl 之前孵育 10–15 分钟₂。加入代谢底物（例如 10 mM 葡萄糖和 0.5 mM 丙酮酸盐。
4. 通过将钳子、剪刀和镊子在70%乙醇中灭菌，然后在无菌ddH₂O中冲洗，以准备手术器械。₂O.
5. 打开心脏灌流系统，调节水浴循环仪的温度，将蠕动泵的转速设为6 ml/min。
6. 用95% O₂饱和KHB溶液₂/5% CO₂₂ 气体，并监测流出物的流速和温度（37 °C，使用光纤温度探针）。系统需要约20分钟以达到气体和温度的平衡。

2. 活体骨骼肌的共聚焦成像 In Vivo

1. 用戊巴比妥钠（80 mg/kg，腹腔注射）麻醉小鼠。动物将在10–15分钟内达到手术麻醉深度（对足趾夹捏无反应），并维持该状态1–1.5小时，足以完成后续操作 体内 骨骼肌成像
2. 去除一只后肢的毛发，并用70%乙醇对皮肤进行消毒。
3. 沿肢体外侧皮肤做切口，暴露腓肠肌。
4. 用尖头镊子轻轻夹起肌外膜，用剪刀将其剪开。进一步解剖以去除肌外膜，暴露其下方的肌纤维。
5. 对于 体内 将TMRM（500 nM）加入等渗平衡盐溶液中，浸没骨骼肌30分钟，以实现TMRM的加载，随后用不含指示剂的溶液洗去。
6. 将小鼠侧卧于共聚焦显微镜（Zeiss LSM 510）载物台上，固定其后肢，使暴露的骨骼肌面向培养腔底部的盖玻片。盖玻片位于肌肉组织与倒置物镜（40倍油镜）之间。
7. 轻轻下压腿部，使组织与盖玻片紧密贴合。将暴露的肌肉浸入等渗平衡盐溶液中。
8. 记录二维（2D， xy以每帧1秒的采样速率采集共聚焦图像。每个像素的强度以8位深度进行数字化。通常，一次序列扫描包含100帧。
9. 通过先在405 nm处激发并采集信号来获取连续图像 >505 nm 处，然后在 488 nm 处激发并同时采集信号 >505 nm，用于 mt-cpYFP 的双波长激发成像。采用 405、488 和 543 nm 的顺序激发，分别在 505–545、505–545 和 >560 nm，分别用于mt-cpYFP和TMRM的三波长激发成像。

3. 灌注小鼠心脏的共聚焦成像

1. 完成骨骼肌体内成像后，立即向小鼠腹腔注射 200 单位肝素。10 分钟后，通过开胸法处死小鼠，并迅速取出带有肺和胸腺的心脏。
2. 在冰浴缓冲液中快速分离肺组织。辨认胸腺的各个叶，并轻轻掀开以暴露升主动脉。
3. 去除胸腺，仔细清除周围组织，分离出主动脉。
4. 在主动脉弓第一个分支之前的升主动脉上端做一切口。
5. 用两把显微缝合镊子轻轻夹住主动脉壁以暴露管腔，小心地将主动脉套入灌流导管（PE50 管）。使用微血管夹固定主动脉位置，同时迅速用缝线结扎固定。
6. 移除血管夹，用镊子小心检查导管，确保导管尖端位于主动脉根部上方。根据需要添加额外结扎线以固定心脏位置。
7. 启动蠕动泵，以 1 ml/min 的流速灌注心脏。灌注后心脏将恢复搏动。
8. 调整灌注系统的位�置，将心脏置于显微镜载物台上。载物台配有加热适配器，可对容纳心脏的灌流腔室进行加热。
9. 向腔室内加入 1 ml KHB 灌注液，使心脏部分浸没。监测腔室温度保持在 37 °C，并使用蠕动泵移除流出液。
10. 逐步提高蠕动泵流速，使心脏获得足够的灌注流量（约 2 ml/min）。
11. 稳定灌注 10 分钟后，向灌注液中加入 10 μM blebbistatin 和 100–500 nM TMRM。10 分钟后心率将减慢。
12. 对心脏施加轻柔压力，确保心脏与腔室底部的盖玻片紧密接触，进一步抑制心跳。
13. 按照上述第 2.8 步所述方法，对完整心肌组织进行共聚焦成像。仔细调节焦平面，以获得最清晰的图像。

4. 图像处理与数据分析

1. 使用共聚焦软件中"生理学分析"模块提供的工具分析单个线粒体闪光事件及膜电位变化。该模块通常包含在共聚焦系统的图像采集软件中，可用于在图像中划定特定区域，并输出带时间标签的荧光强度数据。
2. 打开数据库，然后打开待分析的连续二维图像文件。
3. 点击"感兴趣区域（ROI）均值"，切换至"ROI均值"模式。再次点击"感兴趣区域（ROI）均值"，以确认进入"ROI均值"模式。
4. 关闭除cpYFP 488 nm通道外的其他通道显示，以便选择闪光信号。
5. 放大图像，并手动移动滑动条以播放连续的二维图像序列。
6. 通过寻找荧光信号短暂增强的位置，识别单个线粒体超氧闪光事件。使用合适的ROI工具标记闪光区域。每个ROI的荧光强度随时间变化的曲线将显示在图像旁。
7. 完成所有闪光事件的选取后，重新开启其他通道的显示。在细胞外区域选择一个ROI用于背景信号扣除。输出每个ROI的平均荧光强度及其对应的时间标签。
8. 记录每个连续扫描图像文件中的闪光次数，以及扫描时间和细胞面积。使用Excel计算闪光频率，单位为每100秒/1,000 μm²细胞面积内的闪光数。
9. 使用基于交互式数据语言（IDL, ResearchSystems）编写的自定义程序计算每个闪光事件的参数（包括幅度、达峰时间及衰减时间）。IDL软件为商业软件，用于闪光参数分析的自定义程序可向作者申请获取。

结果

根据本方案，可在麻醉小鼠的骨骼肌中进行单个线粒体事件的活体成像，随后在灌注心脏中进行原位成像（图1）。优化成像条件可确保获得完整肌肉组织的清晰图像，并达到单个线粒体的分辨率（图2）。通常使用TMRM来验证mt-cpYFP的定位，其信号应与mt-cpYFP信号完全重叠（图2）。TMRM是一种 commercially available 的用于完整细胞中线粒体膜电位检测的指示剂²³，其光谱与cpYFP可区分。此外，通过使用顺序激发方法，TMRM与mt-cpYFP的发射信号不会相互干扰¹⁷。如图3所示的代表性图像表明，在连续二维扫描图像中可识别出伴随膜去极化的单个线粒体超氧爆发事件，在骨骼肌组织和心肌中均表现为相对于背景信号的瞬时荧光增强（图3）。除了高分辨率外，还需具备足够的荧光强度，这可通过调节激光强度和信号采集通道的增益来实现。通常将细胞的基础荧光信号设定为通道最大强度的三分之一至四分之一...

讨论

在活体动物或灌注器官中成像单个线粒体事件，相较于传统的线粒体功能评估方法具有显著优势^{17,19,21,22,24,25}. 此处所述技术可实现实时 原位 在亚细胞分辨率下测定线粒体功能在真实生理条件下的状态。当与其他测量方法结合时，这对于系统研究线粒体在特定器官或细胞类型正常功能中的作用尤为有用。 体内这是一种结合了共聚焦显微镜和复杂灌注系统的复杂技术，可对多种参数进行精确控制。尽管如此，该技术已被用于将机体整体葡萄糖代谢与肌肉线粒体功能关联起来。^17,19,20 目前我们正利用这些方法研究心脏病中的线粒体功能障碍。

朗根多夫心脏灌流系统可通过监测左心室压力和成像细胞内Ca²⁺来评估心脏功能²⁺ 每次搏动期间的瞬时变化。或者，可灌注其他荧光探针（如 MitoSOX 或 DCF）以辅助 原位 心肌中稳态活性氧水平的成像。Langendorff 灌流心脏已被广泛用于评估心脏对生理条件（例如 多巴酚丁胺诱导的β-肾上腺素能刺激）或病理性的（例如<...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>试剂
Blebbistatin	多伦多研究化学品公司	B592500
CaCl2	Acros Organics	AC34961-5000
EDTA	Fisher Scientific	BP120-500
D-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270-1
HEPES	Sigma-Aldrich	H7006-500
KCl	Sigma-Aldrich	P9541-1
MgCl₂2•6H2O	Fisher Scientific	BP214-500
MgSO₄4•7H2O	Sigma-Aldrich	M1880-1
NaCl	Fisher Scientific	BP358-212
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S8282-500
NaHCO₃3	Sigma-Aldrich	S6014-1
丙酮酸	Sigma-Aldrich	P2256-25
TMRM	Invitrogen	T-668
<强>设备
共聚焦线扫描显微镜（LSM 510 Meta，Zeiss），软件版本 4.2 SP1，包含 "生理学分析" 模块