本文描述了一种用于保存睾丸生殖细胞三维染色质结构的方法，该方法被称为三维（3D）载片法。该技术可提高亚核结构检测的灵敏度，适用于免疫荧光、DNA和RNA荧光检测。 原位 杂交（FISH）
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摘要
摘要
在睾丸生殖细胞分化过程中，细胞核内染色质结构发生动态变化。以下介绍一种旨在保存小鼠睾丸生殖细胞中三维染色质结构的方法，该方法被称为三维（3D）载片法。该方法中，直接对睾丸小管进行透化处理以去除胞质成分，随后进行固定以保存核内物质。接着将小管解离，细胞悬液经细胞离心涂片后附着于载玻片上。该方法提高了对核内亚结构的检测灵敏度，适用于免疫荧光、DNA和RNA荧光检测 原位 杂交（FISH）以及这些检测方法的联合使用。作为3D载片法潜在应用的一个示例，展示了Cot-1 RNA FISH用于检测新生RNA。3D载片法将有助于深入分析睾丸生殖细胞分化过程中染色质结构、DNA与RNA之间的空间关系。
引言
在睾丸中，生殖细胞通过减数分裂从二倍体精原细胞分化为成熟的单倍体精子。在此过程中，生殖细胞的核染色质结构持续发生动态重塑。表面铺展技术常用于单个生精细胞的细胞学检查。其中一种广泛应用的表面铺展方法采用低渗处理，使单个生精细胞展开并压平。1这些条件非常适合对减数分裂染色体进行详细分析。使用该方法可清晰观察染色体特征，如联会状态和重组焦点。然而，低渗处理会破坏核内染色质的高级结构，因此该技术不适用于细胞核的结构分析。为此，已开发出一种改进方法，用于保存睾丸生殖细胞中三维染色质结构。该方法被称为三维（3D）载片法。图1）。3D载片法已实现了细胞核内新生RNA定位的检测，该方法最初为研究睾丸生殖细胞分化过程中的基因表达和染色质状态而优化，采用RNA荧光原位杂交技术 原位 荧光原位杂交（FISH）2,3该3D方法同样适用于免疫荧光、DNA和RNA荧光原位杂交（FISH）的联合应用。此外，该方法还促进了减数分裂后性染色质（PMSC）的发现，PMSC是存在于减数分裂后精子细胞中的性染色体沉默区室。2.
3D 载玻片法最初通过结合核染色载玻片制备过程中的两个关键步骤而优化：固定步骤旨在固定核物质 ，以及通透步骤旨在去除细胞质成分，以提高染色试剂（如抗体和FISH探针）的可及性。如先前另一篇文献所述3，已确定为了获得最佳结果并降低细胞质背景信号，....
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方案
1. 3D 载玻片制备
- 准备以下试剂：
- CSK 缓冲液：100 mM NaCl、300 mM 蔗糖、10 mM PIPES、3 mM MgCl2。用 1 M NaOH 调节 pH 至 6.8。将 CSK 缓冲液在 4 °C 下保存。
- 含 0.5% Triton X-100 的 CSK 缓冲液：向 40 ml CSK 缓冲液中加入 200 μl Triton X-100。使用磁力搅拌器混合溶液，直至 Triton X-100 完全溶解。将含 0.5% Triton X-100 的 CSK 缓冲液在 4 °C 下保存。
- 4% 多聚甲醛（PFA）–PBS，pH 7.4：将 4 g PFA 溶于约 70–80 ml 水中。为加快溶解过程，加入约 20 μl 4 N NaOH，并将溶液置于 60 °C 水浴中，直至 PFA 完全溶解且溶液透明。此过程约需 1 小时。PFA 完全溶解后，加入 10 ml 10× PBS。用水定容至 100 ml，并将溶液冷却至室温（25 °C）。每次新实验均需使用新鲜配制的溶液。
注意：所有动物实验须获得机构许可，并遵守相关动物护理指南。
- 处死雄性小鼠。使用镊子和剪刀从小鼠体内取出睾丸。将睾丸置于 PBS（或 RPMI 1640）中。取出睾丸后，立即依次进行以下步骤 1.3–1.4，以防止 RNA 降解。
- 在小型培....
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结果
3D 载玻片的代表性结果如图所示 图2在本实验中，通过Cot-1 RNA FISH检测新生转录，同时使用抗CBX1和γH2AX抗体进行免疫染色。为结合RNA FISH与免疫染色，先进行免疫染色，随后按所述步骤进行RNA FISH。3CBX1 是一种异染色质蛋白，定位于着丝粒周围异染色质以及减数分裂过程中沉默的性染色体（称为 XY 小体或性小体）。γH2AX 是组蛋白变体 H2AX 的磷酸化形式，定位于 XY 小体上。在本图中，Cot-1 信号聚集在常染色质区域，但在着丝粒周围异染色质和 XY 小体上被排除。
在表面铺展制备过程中，低渗溶液处理可使细胞核膨胀，并物理性地延展核内结构。这种主流方法最适合在单一z平面内捕获所有减数分裂染色体1。为了阐明3D载片法与经低渗处理后的表面铺展法之间的差异，本研究使用落射荧光显微镜，在相同放大倍数下展示了各实验中粗线期精母细胞的代表性图像（图2A和2B）。在经低渗溶液处理的表面铺展样本中，三维染色质结构.......
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讨论
在三维载片制备过程中，通透步骤在固定步骤之前进行。这些步骤直接作用于曲细精管，从而保持染色质的三维结构。另一种用于保持RNA/DNA FISH中染色质结构的方法是同时进行通透和固定步骤。这种替代技术已在有袋类动物的生殖细胞以及小鼠着床前胚胎中应用7,8。然而，如果固定步骤在通透步骤之前进行，可能会导致较高的细胞质背景信号。因此，RNA和DNA FISH载片优化的关键因素取决于通透步骤与固定步骤的先后顺序。通透步骤的持续时间也是载片制备优化的重要因素。本方法通常采用6分钟作为标准条件，但可根据所用材料的差异进行调整。
三维染色质结构的保存是3D载片区别于表面铺展载片的一个显著特征。这一优势与染色体铺展制备方法有显著不同。3D载片方法能够保持三维染色质结构，但需要通过多个z轴层面成像来完整覆盖整个细胞核。单个z轴层面无法捕获细胞核中的全部信号。因此，需要多个z轴层面成像是该方法的主要局限性。若要在单个z轴层面中完整捕获细胞核，表面铺展法则具有优势。因此，3D方法与表面铺展制备方法各有独特优势 ，在减数分裂和精子发生研究中可相互补充。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我感谢Jeannie T. Lee在我于Lee实验室工作期间对本项目的指导，以及Tyler Broering对稿件的编辑。本研究得到了March of Dimes基金会Basil O’Connor启动学者奖和美国国立卫生研究院资助GM098605的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Cot-1 DNA | Invitrogen | 18440-016 | |
| Stratagene Prime-It Fluor 荧光标记试剂盒 | Agilent | 300380 | |
| 鲱鱼精子DNA溶液 | Invitrogen | 15634-017 | |
| 乙醇，200度（无水） | Pharmco-aaper | 111000200 | |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889 | |
| 去离子甲酰胺 | American Bioanalytical | AB00600-00500 | |
| 柠檬酸三钠二水合物 | Sigma-Aldrich | C8532 | |
| 牛血清白蛋白 | Lifeblood Medical | 77110-100 | |
| 来自Leuconostoc spp.的硫酸葡聚糖钠盐 | Sigma-Aldrich | D6001 | |
| RPMI 1640培养基 | Invitrogen | A10491-01 | |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| PIPES缓冲液 | Sigma-Aldrich | P6757 | |
| 六水合氯化镁 | Sigma-Aldrich | M0250 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| 多聚甲醛 | Sigma-Aldrich | 76240 | |
| 氢氧化钠 | Sigma-Aldrich | 221465 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Sigma-Aldrich | P4417 | |
| 含DAPI的VECTASHIELD封片剂 | Vector Laboratories | H1200 | |
| 核糖核苷-钒酰复合物 | New England Biolabs | S1402S | |
| Illustra MicroSpin G-50纯化柱 | GE Healthcare | 27-5330-01 | |
| 微量离心机 | Eppendorf | 5424 | |
| 镊子 | VWR | 300-050 | |
| 微量离心管 | Bioexpress | C-3262-1 | |
| Cytospin 3离心涂片机 | Shandon | ||
| 柯普林瓶 | Fisher | 08-815 | |
| Superfrost /Plus载玻片 | Fisher | 12-550-15 | |
| 4孔培养皿 | Fisher | 12-566-301 | |
| 盖玻片 | Fisher | 12-544-G | |
| 空气培养箱 | Revolutionary Science | RS-IF-203 |
参考文献
- Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
- Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germl....
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重印与许可
