方法文章

保存睾丸生殖细胞三维染色质结构的制片方法

DOI：

10.3791/50819

⸱

2014年1月10日

1Division of Reproductive Sciences, Division of Developmental Biology, Perinatal Institute, Cincinnati Children's Hospital Medical Center, 2Department of Pediatrics, University of Cincinnati College of Medicine

本文内容

摘要

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本文描述了一种用于保存睾丸生殖细胞三维染色质结构的方法，该方法被称为三维（3D）载片法。该技术可提高亚核结构检测的灵敏度，适用于免疫荧光、DNA和RNA荧光检测。 原位 杂交（FISH）

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在睾丸生殖细胞分化过程中，细胞核内染色质结构发生动态变化。以下介绍一种旨在保存小鼠睾丸生殖细胞中三维染色质结构的方法，该方法被称为三维（3D）载片法。该方法中，直接对睾丸小管进行透化处理以去除胞质成分，随后进行固定以保存核内物质。接着将小管解离，细胞悬液经细胞离心涂片后附着于载玻片上。该方法提高了对核内亚结构的检测灵敏度，适用于免疫荧光、DNA和RNA荧光检测 原位 杂交（FISH）以及这些检测方法的联合使用。作为3D载片法潜在应用的一个示例，展示了Cot-1 RNA FISH用于检测新生RNA。3D载片法将有助于深入分析睾丸生殖细胞分化过程中染色质结构、DNA与RNA之间的空间关系。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在睾丸中，生殖细胞通过减数分裂从二倍体精原细胞分化为成熟的单倍体精子。在此过程中，生殖细胞的核染色质结构持续发生动态重塑。表面铺展技术常用于单个生精细胞的细胞学检查。其中一种广泛应用的表面铺展方法采用低渗处理，使单个生精细胞展开并压平。1这些条件非常适合对减数分裂染色体进行详细分析。使用该方法可清晰观察染色体特征，如联会状态和重组焦点。然而，低渗处理会破坏核内染色质的高级结构，因此该技术不适用于细胞核的结构分析。为此，已开发出一种改进方法，用于保存睾丸生殖细胞中三维染色质结构。该方法被称为三维（3D）载片法。图1）。3D载片法已实现了细胞核内新生RNA定位的检测，该方法最初为研究睾丸生殖细胞分化过程中的基因表达和染色质状态而优化，采用RNA荧光原位杂交技术 原位 荧光原位杂交（FISH）2,3该3D方法同样适用于免疫荧光、DNA和RNA荧光原位杂交（FISH）的联合应用。此外，该方法还促进了减数分裂后性染色质（PMSC）的发现，PMSC是存在于减数分裂后精子细胞中的性染色体沉默区室。2.

3D 载玻片法最初通过结合核染色载玻片制备过程中的两个关键步骤而优化：固定步骤旨在固定核物质 ，以及通透步骤旨在去除细胞质成分，以提高染色试剂（如抗体和FISH探针）的可及性。如先前另一篇文献所述3，已确定为了获得最佳结果并降低细胞质背景信号，通透步骤必须在固定步骤之前进行。在本3D载玻片法中，通透步骤和随后的固定步骤直接在曲细精管 上进行，之后使用镊子对生殖细胞进行机械解离，再通过细胞离心涂片仪将细胞沉积到载玻片上。另一种用于生精细胞RNA FISH的替代方法已在其他实验室开发4。该方法与3D方法一致，为了获得最佳的RNA FISH结果，通透步骤也必须先于固定步骤。

以下方案描述了3D载玻片方法，并提供了一个可能应用的示例，即利用Cot-1 RNA FISH检测细胞核内新生RNA。Cot-1 DNA由基因组中的重复元件组成。在此方法中，Cot-1 DNA探针与新生转录本的内含子及非翻译区（UTR）杂交，从而检测细胞核中具有转录活性的区域5,6。3D载玻片具有良好的通用性，可结合免疫荧光、DNA和RNA FISH技术，用于深入分析染色质结构之间的空间关系。

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方案

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1. 3D 载玻片制备

  1. 准备以下试剂：
    1. CSK 缓冲液：100 mM NaCl、300 mM 蔗糖、10 mM PIPES、3 mM MgCl2。用 1 M NaOH 调节 pH 至 6.8。将 CSK 缓冲液在 4 °C 下保存。
    2. 含 0.5% Triton X-100 的 CSK 缓冲液：向 40 ml CSK 缓冲液中加入 200 μl Triton X-100。使用磁力搅拌器混合溶液，直至 Triton X-100 完全溶解。将含 0.5% Triton X-100 的 CSK 缓冲液在 4 °C 下保存。
    3. 4% 多聚甲醛（PFA）–PBS，pH 7.4：将 4 g PFA 溶于约 70–80 ml 水中。为加快溶解过程，加入约 20 μl 4 N NaOH，并将溶液置于 60 °C 水浴中，直至 PFA 完全溶解且溶液透明。此过程约需 1 小时。PFA 完全溶解后，加入 10 ml 10× PBS。用水定容至 100 ml，并将溶液冷却至室温（25 °C）。每次新实验均需使用新鲜配制的溶液。
      注意：所有动物实验须获得机构许可，并遵守相关动物护理指南。
  2. 处死雄性小鼠。使用镊子和剪刀从小鼠体内取出睾丸。将睾丸置于 PBS（或 RPMI 1640）中。取出睾丸后，立即依次进行以下步骤 1.3–1.4，以防止 RNA 降解。
  3. 在小型培养皿中撕裂睾丸并去除白膜（tunica albuginea）。在冰上使用镊子将曲细精管在 PBS 中展开。
  4. 使用镊子将数根曲细精管（数段长约 5–10 mm 的曲细精管）转移至一个 4 孔板的孔中，孔内含 500 ml 冰上预冷的 CSK 缓冲液 + 0.5% Triton X-100，并孵育 6 分钟。过度暴露于 CSK 缓冲液可能导致细胞破裂。
  5. 使用镊子将所有曲细精管转移至一个 4 孔板的孔中，孔内含 4% PFA–PBS 溶液。此步骤可在无体视显微镜下完成，但也可选择使用。室温孵育 10 分钟。在孵育期间，同时开始准备 12 个细胞离心涂片装置。
  6. 使用镊子将所有曲细精管转移至一个 4 孔板的孔中，孔内含 PBS。室温孵育 5 分钟。
  7. 在载玻片背面，将所有曲细精管转移至 30 μl PBS 中（应避免接触载玻片顶部，因其带有阳离子电荷）。使用两把镊子的尖端将曲细精管撕碎。通过将曲细精管夹在两把镊子尖端之间并水平拉动，沿水平方向剪切曲细精管。持续此操作约 10–20 秒。
  8. 使用 P20 移液器吹打混匀悬浮液。
  9. 将悬浮液转移至微量离心管中，用 PBS 稀释至约 1.3 ml。将 100 μl 悬浮液分别加入 12 个细胞离心涂片装置中（共 1.2 ml）。此步骤无需测定细胞浓度。
  10. 在室温下以 2,000 rpm 离心 10 分钟进行细胞离心涂片。离心后，在实验台上将载玻片于室温干燥数分钟。待载玻片完全干燥数分钟后，进入下一步。
  11. 使用盛有 PBS 的 Coplin 染色缸，在室温下洗涤载玻片 5 分钟。
  12. 将载玻片转移至盛有 70% 乙醇的 Coplin 染色缸中，至少等待 2 分钟后再开始 RNA FISH 实验。载玻片可在 4 °C 的 70% 乙醇中稳定保存数周。如需长期保存，使用 Coplin 染色缸依次以 80% 和 100% 乙醇各处理 2 分钟，然后完全空气干燥。将载玻片存于 -80 °C 的玻片盒中。

2. 通过随机引物法准备 Cot-1 DNA 探针

  1. 配制以下试剂：
    1. 杂交缓冲液：混合上述组分以配制900 ml杂交缓冲液母液；该溶液用于探针的储存。此杂交缓冲液母液允许在杂交前加入10%体积的RNase抑制剂溶液（Ribonucleoside Vanadyl Complex）。
      组分量（μl)终浓度
      甲酰胺50050% (v/v)
      50% Dextran20010% (w/v)
      20x SSC1002x
      1% BSA1000.1%
      杂交前，加入 ⅒ 将200 mM核糖核苷酸钒酰复合物或水加入杂交缓冲液原液中，以达到最终浓度。置于-20℃ °C，该混合物在一年以上时间内保持稳定。
    2. 20x SSC：将88.2 g柠檬酸钠和175.3 g NaCl溶解于约800 ml水中，用几滴1 M HCl调节pH至7.0，加水定容至1 L，经高压灭菌后灭菌。配制完成后为20× SSC 可在室温下保存。
    3. 50% (w/v) 葡聚糖：搅拌水并缓慢加入50 g硫酸葡聚糖，室温下持续搅拌过夜。加水定容至100 ml。室温保存。
  2. 向PCR管中加入下所列的组分。使用PCR仪混合并孵育溶液，在95℃下孵育5分钟 °C.
    组分每反应用量（μl)最终
    Cot-1 DNA：1 mg/ml11 μg
    随机9碱基引物（来自试剂盒）10
    水27
  3. 短暂离心后置于冰上。
  4. 加入以下组分。混合后于37℃孵育30分钟 °使用PCR仪进行C步骤。（所用试剂盒的详细信息见试剂与设备表）。
    组分每反应用量（μl)终浓度
    步骤 2.2 制备的混合物38
    5x 核苷酸缓冲液（来自试剂盒）9.2
    Cy3-dUTP（1 mM）0.816 μM
    Klenow（来自试剂盒）2
  5. 加入2 μ加入 l 停止缓冲液（来自试剂盒）以终止反应。
  6. 使用微量离心柱纯化已终止的反应。
  7. 加入50 μ克（5 μ加入鲱鱼精子DNA（模板Cot-1 DNA的50倍过量）至纯化组分中。
  8. 使用移液器测量总体积。加入0.7倍体积的100%乙醇和0.1倍体积的3 M乙酸钠（pH 5.2），充分混匀，然后在4 °C下使用微量离心机以最大速度（17,000 × g）离心15分钟。 °C.
  9. 移除液体，加入 200 μ70% 乙醇，充分混匀，4 ℃ 下以最大速度离心 5 分钟 °C.
  10. 除去多余液体，在室温下干燥沉淀物10–30分钟。
  11. 将沉淀溶解于20 μ杂交缓冲液原液。由于沉淀物通常难以溶解，需反复用移液器吹打。作为替代方法，也可使用涡旋振荡器高效溶解沉淀。探针可保存于-20 °C，直至使用。

3. Cot-1 RNA FISH

  1. 将下表所列组分加入 PCR 管中。使用 PCR 仪，在 80 °C 下孵育 10 分钟，随后在 42 °C 下进行约 10–30 分钟的预退火步骤。保持在 42 °C 下直至杂交。核糖核苷酸钒酸复合物（Ribonucleoside Vanadyl Complex）为可选项；可用去离子水替代。
    组分每反应体积（μl）终浓度
    Cot-1 DNA 探针（50 ng/μl）2100 ng
    Ribonucleoside Vanadyl Complex（200 mM）220 mM
    杂交缓冲液加至 20
  2. 将载玻片置于盛有 80% 乙醇的 Coplin 染色缸中脱水 2 分钟，随后转移至盛有 100% 乙醇的 Coplin 染色缸中继续脱水 2 分钟。在室温下于实验台面上彻底干燥载玻片。
  3. 提前在 42 °C 培养箱中预热一个装有 2–3 cm 水的吸头盒腔室。将载玻片置于该吸头盒腔室内。将预退火后的探针短暂离心后，直接用移液器滴加至脱水后的载玻片上，避免产生气泡。用盖玻片轻轻覆盖载玻片表面。
  4. 在 42 °C 下杂交 6 小时至过夜（14–15 小时）。
  5. 在 Coplin 染色缸中配制洗涤液（两个染色缸中均含 2x SSC 和 50% 甲酰胺，另两个染色缸中含 2x SSC）。将洗涤液在 42 °C 水浴中预热 30 分钟。
  6. 用刀片从载玻片边缘小心移除盖玻片，避免刮伤样本。将载玻片放入含 2x SSC 和 50% 甲酰胺的 Coplin 染色缸中，在 45 °C 下洗涤 5 分钟。重复此步骤一次。
  7. 将载玻片放入含 2x SSC 的 Coplin 染色缸中，在 45 °C 下洗涤 5 分钟。重复此步骤一次。
  8. 向载玻片上加入 20 μl DAPI 封片剂，并加盖盖玻片。轻轻按压盖玻片以去除多余的封片剂，再用擦镜纸吸除多余液体。载玻片即可用于显微镜观察。

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结果

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一个3D切片的代表性结果如图2所示。在本实验中，通过Cot-1 RNA FISH检测新生转录，并结合使用抗CBX1和γH2AX抗体的免疫染色。为同时进行RNA FISH与免疫染色，首先执行免疫染色，随后进行RNA FISH，步骤如文献3所述。CBX1是一种异染色质蛋白，定位于着丝粒周围异染色质以及减数分裂过程中称为XY体（或性染色体体）的沉默性染色体区域。γH2AX是组蛋白变体H2AX的磷酸化形式，定位于XY体上。在该图像中，Cot-1信号富集于常染色质区域，但在着丝粒周围异染色质和XY体区域被排除。

在制备铺展表面时，低渗溶液处理会使细胞核膨胀，从而在物理上延展亚核结构。这种主流的减数分裂研究方法最适合在单一z平面内捕获全部的减数分裂染色体1。为了阐明3D载片法与经低渗处理后的铺展表面之间的差异，此处使用落射荧光显微镜在相同放大倍数下展示了各实验中粗线期精母细胞的代表性图像（图2A 和 图2B）。在经低渗溶液处理的铺展表面中，三维染色质...

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讨论

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在三维载片制备过程中，通透步骤在固定步骤之前进行。这些步骤直接作用于曲细精管，从而保持染色质的三维结构。另一种用于保持RNA/DNA FISH中染色质结构的方法是同时进行通透和固定步骤。这种替代技术已在有袋类动物的生殖细胞以及小鼠着床前胚胎中应用7,8。然而，如果固定步骤在通透步骤之前进行，可能会导致较高的细胞质背景信号。因此，RNA和DNA FISH载片优化的关键因素取决于通透步骤与固定步骤的先后顺序。通透步骤的持续时间也是载片制备优化的重要因素。本方法通常采用6分钟作为标准条件，但可根据所用材料的差异进行调整。

三维染色质结构的保存是3D载片区别于表面铺展载片的一个显著特征。这一优势与染色体铺展制备方法有显著不同。3D载片方法能够保持三维染色质结构，但需要通过多个z轴层面成像来完整覆盖整个细胞核。单个z轴层面无法捕获细胞核中的全部信号。因此，需要多个z轴层面成像是该方法的主要局限性。若要在单个z轴层面中完整捕获细胞核，表面铺展法则具有优势。因此，3D方法与表面铺展制备方法各有独特优势 ，在减数分裂和精子发生研究中可相互补充。

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

我感谢Jeannie T. Lee在我于Lee实验室工作期间对本项目的指导，以及Tyler Broering对稿件的编辑。本研究得到了March of Dimes基金会Basil O’Connor启动学者奖和美国国立卫生研究院资助GM098605的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Cot-1 DNA Invitrogen18440-016
Stratagene Prime-It Fluor 荧光标记试剂盒Agilent300380
鲱鱼精子DNA溶液Invitrogen15634-017
乙醇，200度（无水）Pharmco-aaper111000200
乙酸钠Sigma-AldrichS2889
去离子甲酰胺American BioanalyticalAB00600-00500
柠檬酸三钠二水合物Sigma-AldrichC8532
牛血清白蛋白Lifeblood Medical77110-100
来自Leuconostoc spp.的硫酸葡聚糖钠盐Sigma-AldrichD6001
RPMI 1640培养基InvitrogenA10491-01
蔗糖Sigma-AldrichS0389
PIPES缓冲液Sigma-AldrichP6757
六水合氯化镁Sigma-AldrichM0250
Triton X-100Sigma-AldrichT8787
多聚甲醛Sigma-Aldrich76240
氢氧化钠Sigma-Aldrich221465
磷酸盐缓冲液（PBS）Sigma-AldrichP4417
含DAPI的VECTASHIELD封片剂Vector LaboratoriesH1200
核糖核苷-钒酰复合物New England BiolabsS1402S
Illustra MicroSpin G-50纯化柱GE Healthcare27-5330-01
微量离心机Eppendorf5424
镊子VWR300-050
微量离心管BioexpressC-3262-1
Cytospin 3离心涂片机Shandon
柯普林瓶Fisher08-815
Superfrost /Plus载玻片Fisher12-550-15
4孔培养皿Fisher12-566-301
盖玻片 Fisher12-544-G
空气培养箱Revolutionary ScienceRS-IF-203

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Peters, A. H., Plug, A. W., van Vugt, M. J., de Boer, P. A drying-down technique for the spreading of mammalian meiocytes from the male and female germline. Chromosome Res. 5, 66-68 (1997).
  2. Namekawa, S. H., et al. Postmeiotic sex chromatin in the male germline of mice. Curr Biol. 16, 660-667 (2006).
  3. Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
  4. Mahadevaiah, S. K., Costa, Y., Turner, J. M. Using RNA FISH to study gene expression during mammalian meiosis. Methods in molecular biology. 558, 433-444 (2009).
  5. Hall, L. L., et al. An ectopic human XIST gene can induce chromosome inactivation in postdifferentiation human HT-1080 cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 8677-8682 (2002).
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  7. Namekawa, S. H., VandeBerg, J. L., McCarrey, J. R., Lee, J. T. Sex chromosome silencing in the marsupial male germ line. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9730-9735 (2007).
  8. Namekawa, S. H., Payer, B., Huynh, K. D., Jaenisch, R., Lee, J. T. Two-step imprinted X inactivation: repeat versus genic silencing in the mouse. Mol Cell Biol. 30, 3187-3205 (2010).
  9. Ichijima, Y., et al. MDC1 directs chromosome-wide silencing of the sex chromosomes in male germ cells. Genes Dev. 25, 959-971 (2011).
  10. Sin, H. S., et al. RNF8 regulates active epigenetic modifications and escape gene activation from inactive sex chromosomes in post-meiotic spermatids. Genes Dev. 26, 2737-2748 (2012).

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重印与许可

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标签

FISH COT 1 RNA FISH RNA XY

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