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方法文章

体外 共培养实验评估病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移

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DOI：

10.3791/50823

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2014年1月6日

 ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Harvard Medical School, 2Department of Pediatric Gastroenterology, MGH for Children, 3Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital

本文内容

摘要

中性粒细胞在黏膜细菌感染刺激下发生跨上皮迁移，可导致上皮损伤及临床疾病。 一个 体外 已开发出一种模型，该模型结合了病原体、人中性粒细胞以及在Transwell滤膜上培养的极化人上皮细胞层，以促进对调控此现象的分子机制进行深入研究。

摘要

黏膜表面作为抵御病原生物的保护屏障。 先天免疫反应在感知病原体后被激活，导致以中性粒细胞为主的炎性细胞迁移并浸润组织。 如果过度进行或处于未解决状态，该过程可能对组织具有破坏性。  共培养 体外 模型可用于研究病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移过程中涉及的独特分子机制。 此类模型在实验设计上具有灵活性，可对病原体、上皮屏障或中性粒细胞进行可控性操控。 在可渗透的Transwell小室滤膜上培养的极化上皮单层，其顶面受到病原体感染时，会引发从基底侧向顶侧跨上皮迁移的生理相关性中性粒细胞迁移，中性粒细胞被施加于基底侧表面。 的 体外 本文所述模型展示了证明中性粒细胞迁移穿过受病原体感染的极化肺上皮单层所需的多个步骤 P. aeruginosa (PAO1) 描述了利用人源性肺上皮细胞在可渗透的Transwell小室中进行接种和培养的方法，以及从全人血中分离中性粒细胞和培养铜绿假单胞菌PAO1与非致病性K12菌株的过程 E. coli (MC1000)  迁移过程及对因病原体感染而被激活并成功迁移的中性粒细胞进行定量分析的代表性数据，包括阳性与阴性对照。 这 体外 该模型系统可被操控并应用于其他黏膜表面。 涉及过度中性粒细胞浸润的炎症反应可能对宿主组织造成破坏，并可在无病原体感染的情况下发生。 通过实验操控促进中性粒细胞跨上皮迁移的分子机制的更深入理解 体外 本文所述的共培养检测系统在识别多种黏膜感染性和炎症性疾病的新治疗靶点方面具有重要意义。

引言

黏膜表面作为物理和免疫屏障，能够抵御环境中普遍存在的外部威胁1,2。 当病原体入侵时，这种保护性上皮屏障可能遭到破坏2。 对于细菌性病原体而言，这种相互作用通常会通过激活先天免疫系统，引发一类被称为中性粒细胞的首批应答粒细胞的快速募集，从而启动炎症反应2-4。趋化因子部分由黏膜上皮细胞产生，以促进中性粒细胞的招募，帮助宿主清除致病菌2-4。 中性粒细胞在黏膜上皮表面过度或持续性的浸润可导致显著的病理损伤1,5。 这是由于中性粒细胞抗菌武器库对组织造成的非特异性损伤所致5-7。 在此类情况下，中性粒细胞在清除细菌的同时，对宿主组织的破坏作用超过了其防御功能。 保护性上皮屏障功能的破坏可使下层组织更易暴露于微生物和/或毒素，进一步加重疾病病理过程8,9。 这些后果可在多个器官系统中观察到，包括肺和消化道1,5。 此外，某些非感染性炎症性疾病，如重度哮喘发作、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和炎症性肠病（IBD），其特征也是由过度的中性粒细胞反应导致黏膜上皮屏障的病理性破坏4,5,10-12。

中性粒细胞在黏膜感染后募集的复杂过程涉及多个区室化的步骤1,5,13,14。 首先，中性粒细胞必须通过一系列细胞间相互作用从循环中离开，从而实现跨内皮迁移1,13。 接着，中性粒细胞需穿越含有细胞外基质的现有间质空间1,14。 为了到达受感染黏膜的腔面，中性粒细胞必须进一步迁移穿过上皮屏障1,4,5。 这一复杂的多步骤现象通常通过感染的in vivo动物模型进行整体研究15。 这些模型有助于确定特定因子（如趋化因子、黏附分子或信号通路）在整个过程中的必要性，但在解析各个独立区室化步骤中关键的分子贡献方面往往不够充分16。 在这方面，模拟中性粒细胞跨内皮、跨基质或跨上皮迁移的共培养in vitro系统已被证明特别有用1,14,16,17。 

一种稳健的共培养检测系统已被开发出来，用于解析病原体感染诱导中性粒细胞跨上皮迁移的机制18-22. 该模型包括用细菌病原体感染极化的人上皮细胞层的顶面，随后将 freshly isolated human neutrophils 应用于基底面18-22. 中性粒细胞在病原体感染后，响应上皮细胞分泌的趋化因子，迁移穿过上皮屏障18,21-23. 该模型系统已应用于肠道和肺上皮细胞培养，通过暴露于相应组织特异性的细菌病原体，揭示了在黏膜感染过程中中性粒细胞募集可能涉及的新型分子机制3,8,19,24-28. 该方法的优势在于 体外 共培养模型的优势在于，这种简化的方法可使研究者在高度可控、可重复性高且相对经济的体系中，对病原体、上皮屏障和/或中性粒细胞进行实验性操控。 通过这一方法获得的见解可有效用于中性粒细胞募集过程中区室化事件的针对性分析 体内 感染模型22,29,30.

本文演示了成功建立该可重复模型所需的多个步骤，以研究病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移。 本文以病原体 Pseudomonas aeruginosa感染的肺上皮屏障为例；然而，通过少量修改，也可替换为其他组织上皮和病原体。 文中详细介绍了在倒置的胶原包被的可通透Transwell滤膜上接种和培养极化肺上皮细胞层的方法，以及致病性P. aeruginosa的培养和从中性粒细胞全血中分离中性粒细胞的步骤。 本文还展示了如何将这些组分结合，以观察病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移，并提供了适当的阳性和阴性对照，以建立可重复的检测体系。 本文结合文献中的具体研究，讨论了该方法在探究病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移不同方面的广泛适用性。

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方案

步骤（1-3）应在层流罩内的无菌环境中进行。

1. 胶原蛋白包被Transwell

  1. 配制 30 µg/ml 的胶原蛋白溶液。将 3 mg/ml 的胶原蛋白储备液用已通过 0.2 µm 滤器过滤的 60% 乙醇按 1:100 比例稀释。
  2. 涡旋振荡稀释后的 30 µg/ml 溶液。注意：无需涡旋振荡 3 mg/ml 的胶原蛋白储备液，因为该溶液黏度较高，涡旋可能引入气泡，从而影响移液时的准确性。
  3. 从外包装中取出具有 3 µm 孔径、生长面积为 0.33 cm2 的 transwell 小室，并将含有 12 个 transwell 的 24 孔板倒置放入生物安全柜中。
  4. 取下底部平板并置于一旁。注意：此时 transwell 将倒置并放置在 24 孔板盖子上。
  5. 点燃本生灯。用火焰灼烧止血钳以灭菌，并使其冷却。
  6. 使用无菌止血钳将 transwell 转移至一个 150 mm × 25 mm 的培养皿中，保持其倒置状态。注意：务必保持空的 24 孔板及其盖子的无菌状态，以便后续用于承载接种上皮细胞后的 transwell。
  7. 向每个倒置 transwell 的滤膜表面加入 70 µl 的 30 µg/ml 胶原蛋白溶液。注意：由于从底部接触滤膜表面时周围无壁，表面张力应足以使该体积的溶液保持原位。操作时需小心避免胶原蛋白溶液沿 transwell 侧壁滴落，并在包被过程中避免移动 transwell。
  8. 保持培养皿盖子打开至少 4 小时，以使乙醇溶液完全蒸发。在此期间，为维持无菌环境，应保持生物安全柜风扇和紫外灯开启。
  9. transwell 干燥后可立即使用，或在盖好培养皿盖子并保持无菌的条件下于室温保存最多一周。

2. 用于接种Transwell的上皮细胞传代培养

（本方案专门描述了肺上皮细胞系H292在transwell上培养形成上皮屏障的处理方法。其他上皮细胞系也可使用，仅需稍作修改。）

  1. 通过向 RPMI 1640 培养基中添加 10% 热灭活胎牛血清（HI-FBS）和 1× 青霉素/链霉素，制备细胞培养基。
  2. 将培养基、胰蛋白酶-EDTA（T-EDTA）和 D-PBS 置于 37 ºC 水浴中预热。
  3. 从培养箱中取出含有细胞的 T-75 培养瓶，用倒置显微镜观察细胞融合度。注意：使用 H292 细胞时，培养瓶中的细胞应接近或完全融合。
  4. 吸除培养瓶中的培养基。为减少细胞干燥时间，提前将下一步使用的溶液置于超净台中，并松开瓶盖。
  5. 向 T-75 培养瓶中加入 5 ml D-PBS，轻轻晃动。避免产生气泡。随后通过抽吸去除 PBS。
  6. 向 T-75 培养瓶中加入 3 ml T-EDTA，轻轻晃动使其覆盖瓶底。
  7. 吸除大部分 T-EDTA，保留约 0.3 ml 在 T-75 培养瓶中。
  8. 将残留的少量 T-EDTA 均匀分布于细胞表面，并将培养瓶置于加湿培养箱中，在标准培养条件下（37 ºC，5% CO2）孵育。
  9. 孵育一段时间后，从培养箱中取出培养瓶。注意：轻轻敲击培养瓶侧面，细胞应易于从瓶壁脱落。在显微镜下观察时，细胞应呈圆形并悬浮。H292 细胞通常需要 5–10 分钟完成此过程。
  10. 向培养瓶中加入 10 ml 培养基以中和 T-EDTA 并重悬细胞。用移液器吸取细胞悬液，反复吹打约五次，使细胞充分重悬。
  11. 将重悬的细胞转移至 15 ml 离心管中，用于接种 Transwell 小室。注意：按此方法制备的 H292 细胞悬液浓度应在约 1 × 106–1.8 × 106 个细胞/ml 范围内。

3. 在胶原蛋白包被的Transwell小室中接种上皮细胞

  1. 从15 ml离心管中取70 µl重悬的细胞溶液，加入每个倒置的胶原蛋白包被的Transwell小室中。注意：H292细胞溶液浓度在1 × 106–1.8 × 106 个细胞/ml范围内时，每个Transwell小室可接种约70,000–120,000个细胞。
  2. 在接种Transwell小室过程中，需定期轻轻倒置离心管以混匀细胞悬液，防止细胞沉降到15 ml离心管底部。注意：切勿涡旋细胞，且移液枪头应避免直接接触胶原蛋白包被的膜滤器。
  3. 所有倒置的Transwell小室接种上皮细胞后，盖上培养皿盖，小心放入组织培养孵箱中，在37 ºC、5% CO2、加湿条件下培养。操作时应注意避免扰动已加入胶原蛋白包被膜滤器的细胞悬液。
  4. 将倒置的Transwell小室在组织培养孵箱中（37 ºC、5% CO2、加湿条件）静置过夜。注意：含有细胞的液滴应始终与Transwell小室的通透性膜滤器保持接触。若因液体蒸发或沿Transwell小室侧壁滴落导致膜滤器变干，上皮层可能无法正常生长。
  5. 次日，向原始的无菌24孔板中每孔加入1 ml培养基，并使用无菌止血钳将每个倒置的Transwell小室翻转，放入含有1 ml培养基的孔中。
  6. 向每个Transwell小室的上室加入0.2 ml培养基，然后放回组织培养孵箱中，在37 ºC、5% CO2、加湿条件下继续培养。
  7. H292倒置Transwell小室在接种后8天至1个月内均可使用。注意：建议至少在接种后8天再使用，以确保上皮单层已完全形成并具备功能性屏障。可通过检测单层上皮是否能够限制辣根过氧化物酶（HRP）从基底侧向顶侧的跨上皮转运来评估H292上皮屏障功能18。

4. 准备用于感染Transwell上皮层的细菌

  1. 实验前一天，从假单胞菌分离琼脂平板上挑取一株 P. aeruginosa PAO1 单菌落，从LB琼脂平板上挑取一株K12 E. coli MC1000 单菌落，分别接种于含有3 ml LB肉汤的试管中。注意：P. aeruginosa 为人源性病原体，操作时应遵循标准的BSL2安全规范。
  2. 在37 °C、225 rpm条件下振荡培养过夜。
  3. 次日，从浓菌液中各取出1 ml，分别转移至1.5 ml离心管中。
  4. 在微型离心机中以15,800 × g离心5分钟，弃上清液。
  5. 提前配制含钙和镁的Hanks’平衡盐溶液（HBSS+）。将23.8 g HEPES和97.5 g HBSS+粉末溶于9.5 L蒸馏水中，边搅拌边少量加入10 M NaOH溶液，并监测pH值，直至pH稳定在7.4。定容至10 L，4 °C保存。
  6. 用1 ml HBSS+重悬各细菌沉淀。涡旋振荡，确保形成均匀的细菌悬液。
  7. 再次以15,800 × g离心5分钟，弃上清液。
  8. 用0.6 ml HBSS+重悬PAO1菌体沉淀，用0.5 ml HBSS+重悬MC1000菌体沉淀。涡旋振荡使细菌充分悬浮。
  9. 将重悬后的PAO1和MC1000菌液用HBSS+按1:100比例进一步稀释。例如，取50 µl重悬的0.6 ml PAO1菌液加入5 ml HBSS+中。注：通过光密度（OD）测定结合标准菌落形成单位（CFU）稀释涂布法测定菌液浓度，按此方法制备的PAO1和MC1000菌液浓度通常稳定在3 × 107–6 × 107 CFU/ml之间。细菌培养物的密度与其在600 nm处测得的OD值呈正相关，可据此估算细菌细胞浓度。为确认细菌细胞浓度，可将菌液稀释至极低浓度后涂布于琼脂平板，使平板上菌落数预计在30–200之间。将菌液均匀涂布后，在37 °C过夜培养，使每个细菌细胞形成肉眼可见的独立菌落，随后进行菌落计数。

5. 从全血中分离中性粒细胞

  1. 酸性柠檬酸葡萄糖溶液（ACD）用作抗凝剂，制备方法为将6.9 g柠檬酸、12.5 g柠檬酸钠和10 g葡萄糖加入500 ml蒸馏水中。待所有成分完全溶解后，通过0.2 µm滤器过滤除菌。将ACD溶液于4 ºC保存。
  2. 采血前，向50 ml注射器中加入5 ml ACD，并连接21 x ¾ G蝶形针（12 in） 管路
  3. 应用止血带，用酒精擦拭静脉，然后插入针头。注意：任何涉及人类受试者的研究方案必须经机构审查委员会批准，并获得每位献血者的书面知情同意。例如，使用本方案开展的实验已获麻省总医院机构审查委员会批准，方案编号为 #1999-P-007782。
  4. 缓慢抽取45 ml血液，确保血液进入注射器后与ACD充分混合。
  5. 当采集量达到45 ml（总体积50 ml）时，在拔出针头前解开止血带。拔出针头后，立即用无菌纱布对伤口施加压力。
  6. 沿50 ml离心管管壁缓慢转移血液，用时约5-10秒。
  7. 在室温下，以1,000 × g离心20分钟，离心时关闭刹车。注意：可在离心前增加一步骤，即将全血用PBS稀释，并将稀释后的血液小心地铺在Ficoll-Paque液面上，以更有效地分离白膜层与粒细胞，从而获得略高的中性粒细胞纯度。8省略此步骤可节省时间，且对该检测的得率和纯度影响不大，因此我们倾向于不进行血液覆盖于Ficoll-Paque的步骤。
  8. 离心血液的同时，将1 g明胶缓慢加入50 ml不含钙和镁的预热Hanks’ Balanced Salt Solution（HBSS(-)）中，配制2%明胶溶液。保持溶液温度为37 ºC。
  9. 使用经Sigmacote处理的玻璃移液管尖端，吸除并弃去50 ml离心管中的血浆。
  10. 继续小心吸取以去除白膜层，其中含有包括淋巴细胞在内的白细胞。
  11. 当缓慢移除白膜层时，红细胞（RBC）层上方的乳白色浑浊物质将逐渐消失。一旦白膜层被完全移除，从试管上方观察可清晰看到红细胞层，此时应停止吸液。
  12. 尽量不要扰动红细胞层，因为粒细胞（主要是中性粒细胞）位于红细胞层表面附近，但肉眼不可见。
  13. 向15 ml红细胞层中加入30 ml温热的2%明胶溶液（红细胞层体积的2倍量）。
  14. 轻轻倒置试管以混匀，注意尽量减少气泡产生。
  15. 37℃孵育 ℃孵育25分钟。注意：红细胞应发生聚集并沉降至管底。作为明胶的替代物，可使用高分子量葡聚糖沉淀红细胞。8.
  16. 孵育后，用移液管将含有粒细胞的上层淡红色溶液转移至新的50 ml离心管中，注意转移过程中避免扰动已沉淀的深色红细胞层。分离后，弃去深色红细胞层。
  17. 将含有粒细胞和少量红细胞的浅红色上清液转移至离心机，室温下以1,000 × g离心10分钟，开启刹车制动，使细胞沉淀成团。
  18. 小心倾倒或吸除上清液，因为离心后形成的红褐色细胞沉淀通常较为松散。
  19. 提前配制红细胞裂解缓冲液，加入8.29 g氯化铵（NH₄Cl）、1.00 g碳酸氢钠（NaHCO₃）和0.037 g乙二胺四乙酸二钠（EDTA-2Na）至800 mL去离子水中，搅拌溶解后用去离子水定容至1 L。4 ºC保存。4Cl），1 g 碳酸氢钠（NaHCO₃）3)，并将0.038 g EDTA加入1 L蒸馏水中，混匀。将红细胞裂解缓冲液储存于4 ºC。
  20. 用少量冷的红细胞裂解缓冲液重悬并充分分散呈红色的细胞沉淀。待细胞沉淀完全悬浮于溶液中后，用红细胞裂解缓冲液加至总体积50 ml。注意：从此步骤开始，后续操作中均需将细胞置于冰上或4 ºC环境中。
  21. 在4℃下以300 × g离心10分钟 ℃，然后倒出或吸除上清液。注意：上清液可能略带红色，含有裂解的红细胞。此时沉淀应呈淡黄色或灰白色。如果沉淀呈红色，表明仍有较多红细胞残留，可重复步骤5.20–5.21。若步骤5.20所得红色沉淀未充分破碎，则细胞沉淀中仍会残留较多红细胞。
  22. 重悬并用少量不含钙镁的HBSS（-）将白色沉淀打散，然后用HBSS（-）补至50 ml。注意：应使用HBSS（-）而非含钙镁的HBSS（+）重悬白色细胞沉淀。HBSS（-）不含钙离子和镁离子。
  23. 在4℃下以300 × g离心10分钟，再次离心 ºC
  24. 弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml HBSS(-)中，终体积为1 ml。
  25. 将1 ml细胞悬液中的5 µl加入含有250 µl HBSS(-)的1.5 ml离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。
  26. 加入25 µl稀释的细胞悬液至25 µl 0.4%台盼蓝溶液中。
  27. 向标准血细胞计数板的两侧各加入 12 µl 混合液。
  28. 统计血细胞计数板两侧中间方格内排除台盼蓝染料的活细胞数量。
  29. 计算细胞浓度时，将两个方格的平均值乘以100（稀释因子），然后再乘以104 以获得每毫升的细胞数量。
  30. 调整终浓度至 5 x 107 细胞/毫升。如果大于 5 x 107 细胞/毫升，通过添加HBSS(-)进行调整。如果浓度较低，离心收集细胞并重悬于适当体积的溶液中。
  31. 将细胞置于冰上保存，直至准备进行迁移实验。注意：这些细胞代表白细胞中的粒细胞群体。从全人血中分离得到的粒细胞大多数为中性粒细胞。细胞以HBSS(-)悬浮并保持在冰上，直至加入迁移实验体系，以维持细胞的静息状态。

6. 迁移实验用上皮细胞层的制备

（这些步骤无需在无菌操作台内进行。）

  1. 从培养箱中取出24孔板，其中的transwell滤膜下表面已培养上皮层至少八天。
  2. 用止血钳夹住每个transwell的边缘，从24孔板中取出，并将其倒置在废液桶上方，弃去transwell内腔中的培养基。将每个transwell浸入盛有HBSS+的洗涤烧杯中，使transwell内腔充满HBSS+，然后将液体倒入废液桶中弃去。
  3. 重复步骤6.2，用预热至37 ºC的HBSS+进行第二次洗涤。完成两次洗涤后，将transwell放入新的24孔板中，每孔加入1 ml HBSS+。注意：所有洗涤步骤均应使用预热至37 ºC的HBSS+。
  4. 观察每个transwell的上室，以评估上皮细胞层的完整性。注意：当transwell置于含有1 ml HBSS+的24孔板孔中时，HBSS+不应渗入或充满transwell的上室。
  5. 仔细观察每个transwell后，在其上室中加入0.2 ml HBSS+。
  6. 将24孔板置于37 ºC、5% CO2的湿润培养箱中孵育30–60分钟，使上皮细胞层达到平衡状态。

7. 中性粒细胞跨上皮迁移实验

  1. 从培养箱中取出已用 HBSS+ 平衡的 24 孔板洗涤式 Transwell。
  2. 用止血钳夹住每个 Transwell，将上室液体弃入废液桶中。
  3. 将每个 Transwell 倒置放入一个 150 mm × 25 mm 的培养皿中。
  4. 向其中六个倒置的 Transwell 中各加入 25 µl HBSS+；向另外三个倒置的 Transwell 中各加入 25 µl 用 HBSS+ 稀释的 P. aeruginosa（PAO1），该菌液按步骤 4 所述方法制备；向最后三个倒置的 Transwell 中各加入 25 µl 用 HBSS+ 稀释的 E. coli K12（MC1000），该菌液同样按步骤 4 所述方法制备。每种细菌接种量约为每上皮层 0.8 × 106–1.5 × 106 CFU，因为步骤 4 所制备的菌液浓度约为 3 × 107–6 × 107 CFU/ml。
  5. 在 37 ºC、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 60 分钟。
  6. 通过将 5 µl 10 mM fMLP 原液加入 5 ml HBSS+ 中制备 fMLP，得到 10 µM 溶液，作为中性粒细胞迁移的阳性对照。
  7. 用止血钳夹住 Transwell，将其翻转回含有 1 ml HBSS+ 的 24 孔洗涤板（下室）中进行洗涤；向每个上室加入 0.2 ml HBSS+。
  8. 用止血钳夹住 Transwell，从第一块洗涤板中取出；在将其放入含有 1 ml HBSS+ 的第二块 24 孔洗涤板之前，将上室液体弃入废液桶中；向每个上室加入 0.2 ml HBSS+。
  9. 重复步骤 7.8 一次，共完成 3 次洗涤。注意：无论是否接种细菌，所有 Transwell 均应接受相同的处理和洗涤程序，以确保所有用于检测的 Transwell 操作一致。通过乳酸脱氢酶毒性检测和 HRP 渗透检测评估，PAO1 或 MC1000 感染 60 分钟不会降低 H292 单层细胞的活力或改变其屏障特性18,22。
  10. 通过向 24 孔板的 12 个孔中各加入 1 ml HBSS+，制备 24 孔迁移板。注意：该板可提前准备。
  11. 第三次洗涤后，用止血钳夹住 Transwell，将上室液体弃入废液桶，然后将三个未感染的 Transwell 放入含有 1 ml HBSS+ 的 24 孔迁移板的三个孔中，作为阴性对照。
  12. 用移液器向含有 1 ml HBSS+ 的 24 孔迁移板的三个孔中各加入 10 µl 10 µM fMLP 溶液（终浓度 100 nM）。
  13. 将三个未感染的 Transwell 放入含有 100 nM fMLP 的 24 孔迁移板的三个孔中，作为分离的中性粒细胞迁移能力的阳性对照。
  14. 将三个接种 PAO1 的 Transwell 和三个接种 MC1000 的 Transwell 分别放入含有 1 ml HBSS+ 的 24 孔迁移板的三个孔中。向每个 Transwell 的上室加入 0.1 ml HBSS+。
  15. 在每个 Transwell 的 0.1 ml HBSS+ 上，小心加入 20 µl 按步骤 5 所述方法制备的中性粒细胞悬液（5 × 107 个细胞/ml）。注意：这相当于每个 Transwell 约 1 × 106 个中性粒细胞。
  16. 在 37 ºC、5% CO2 的湿润培养箱中孵育 2 小时，以允许中性粒细胞跨上皮迁移。
  17. 制备标准曲线以确定 2 小时后迁移的中性粒细胞数量。将 40 µl 中性粒细胞悬液（5 × 107 个细胞/ml）加入 2 ml HBSS(+) 中，取 1 ml 加入 1 ml HBSS(+) 中，并连续进行 2 倍稀释 8 次，共获得 10 个标准品，浓度范围约为 2,000 个细胞/ml 至 1 × 106 个细胞/ml。另设 1 ml HBSS(+) 作为空白对照。
  18. 迁移 2 小时后，用止血钳夹起 Transwell，轻轻在 24 孔迁移板内壁上轻敲，弃去 Transwell。
  19. 在倒置显微镜下用 10X 物镜观察 24 孔迁移板各孔，宏观评估中性粒细胞的迁移情况（不同条件下迁移的中性粒细胞图像见图 1）。
  20. 向 24 孔迁移板中使用的每个孔、每个标准品孔及空白对照孔中各加入 50 µl 10% Triton X-100。
  21. 将 24 孔迁移板、标准品板和空白对照板在 4 ºC 下低速旋转 20 分钟。
  22. 提前制备 1 M 柠檬酸盐缓冲液。将 52.5 g 柠檬酸和 73.5 g 柠檬酸钠加入 400 ml 蒸馏水中，调节 pH 至 4.2，再加蒸馏水定容至 500 ml。将溶液储存于 4 ºC。
  23. 当天新鲜配制 ABTS 底物溶液。将 3 片 ABTS 片剂（每片 10 mg）和 5 ml 1 M 柠檬酸盐缓冲液加入 45 ml 蒸馏水中，待片剂完全溶解。在需要使用 ABTS 底物溶液前（见步骤 7.27），再加入 50 µl 30% 过氧化氢。
  24. 向 24 孔迁移板中使用的每个孔、每个标准品孔及空白对照孔中各加入 50 µl 柠檬酸盐缓冲液。
  25. 将每个样品孔中的溶液充分混匀后，取 100 µl 双份转移至 96 孔板中。注意：在转移至 96 孔板前，必须彻底混匀每个样品孔中的内容物。转移前应上下吹打至少五次。
  26. 混匀后，将每个标准品和空白对照（空白双份）各取 100 µl 转移至 96 孔板中。
  27. 向 ABTS 溶液中加入 50 µl 30% 过氧化氢，并涡旋混匀。
  28. 向 96 孔板中的每个样品孔加入 100 µl ABTS 底物溶液。
  29. 在避光条件下孵育 5–10 分钟。注意：某些孔中应出现绿色，其深浅与孔中中性粒细胞数量相关。
  30. 使用酶标仪在 405 nm 波长下读数。
  31. 利用标准品计算跨过上皮层的中性粒细胞数量，其中已知数量的中性粒细胞标准品与在 405 nm 处测得的过氧化物酶活性（以光密度表示）之间存在线性正相关关系（代表性数据见 图 2 和 图 3）。注意：该中性粒细胞定量方法利用了中性粒细胞因表达髓过氧化物酶而具有大量过氧化物酶活性的特点。也可考虑其他中性粒细胞定量方法，例如使用放射性或荧光化合物预标记中性粒细胞的方法。

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结果

多项研究表明，病原体感染的上皮层可促进中性粒细胞跨上皮迁移3,8,19,24-28,31,32。这一过程通过病原体特异性诱导上皮细胞产生中性粒细胞趋化梯度而实现3,23。例如，致病性 P. aeruginosa 与肺上皮细胞顶面相互作用后，可引起大量中性粒细胞迁移穿过上皮层18,22,25,26,33,34。该具有临床相关性的检测系统可与适当的对照结合，通过多种方式进行调控，以揭示关键的病原体和宿主分子作用因子。

将中性粒细胞加入未预先感染的极化上皮细胞层时，中性粒细胞无法以可观的数量迁移穿过上皮层。然而，在未感染的上皮层两侧施加趋化因子梯度，则可驱动大量中性粒细胞穿越。在研究中性粒细胞迁移穿过病原体感染的上皮层时，每项实验均需分别设置这两种阴性与阳性对照。阴性对照用于确定在无信号刺激条件下穿过上皮层的中性粒细胞本底数量。当培养的上皮细胞已形成功能性屏障时，该数值应极低。若本底迁移率过高，将影响对病原体感染上皮组织所得结果的解读。阳性对照是指在上皮层两侧施加中性粒细胞趋化因子（如fMLP）的浓度梯度...

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讨论

中性粒细胞迁移穿过黏膜上皮表面是细菌病原体感染后疾病病理中的常见特征3本文所述方法提供了一种快速、简便的实验方案，用于分离源自人细胞的这一特定事件 体外 模拟细菌感染引发的炎症过程特征的共培养实验系统。该系统最初是利用感染了肠道病原体的极化肠上皮细胞建立的，包括 鼠伤寒沙门氏菌, 志贺氏菌 福氏志贺氏菌以及多种致病性 大肠杆菌8,19,24,27,28每种致病性生物均可驱动中性粒细胞穿过生长于倒置的胶原包被可渗透Transwell滤膜上的极化肠上皮单层。该实验体系经改良后已适用于研究肺上皮屏障及病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移。18,26除H292外，多项研究还采用了其他几种气道上皮细胞系，包括常被引用的A549、BEAS-2B和Calu-3肺上皮细胞系22,26. P. aeruginosa 引发肺部炎症，造成显著损伤，是急性肺炎和囊性纤维化等疾病的特征35,36如所述，该肺部病原体 P. aeruginosa 在感染肺...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）提供经费支持（项目编号：1 R01 AI095338-01A1）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NCl-H292 细胞ATCCCRL-1848
RPMI-1640 培养基ATCC30-2001
Pseudomonas aeruginosa PAO1ATCC#47085
Escherichia coli MC1000ATCC#39531
D-PBS (1x) 液体Invitrogen14190-144不含钙和镁
热灭活胎牛血清Invitrogen10082-147添加至培养基中，终浓度为 10%
青霉素-链霉素Invitrogen15140-122100 倍浓缩液：每毫升含 10,000 单位青霉素和 10,000 µg 链霉素
胰蛋白酶-EDTA (0.05%)Invitrogen25300-062分装为 50 ml，于 -20 ºC 冻存。  使用中的分装可短期存放于 4 ºC。  
Hank's 平衡盐溶液 - HBSS(-)Invitrogen14175-079无菌，不含钙和镁
台盼蓝溶液Invitrogen15250-061.储存液 = 0.4%
大鼠尾胶原蛋白InvitrogenA10483-01也可使用标准方案直接从大鼠尾部分离获得
柠檬酸Sigma-AldrichC1909-500G1 M 柠檬酸盐缓冲液和酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的组分
柠檬酸钠Sigma-AldrichS4641-500G1 M 柠檬酸盐缓冲液的组分
无水葡萄糖Sigma-AldrichD8066-250G酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的组分
氯化铵Sigma-Aldrich213330-500G红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分
碳酸氢钠Sigma-AldrichS6014-500G红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分
EDTASigma-AldrichED-100G红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分
HBSS(+) 粉末Sigma-AldrichH1387-10LHBSS+ 的关键组分
HEPESSigma-AldrichH3375-500GHBSS+ 的组分
SigmacoteSigma-AldrichSL2-25ML按照供应商说明对玻璃移液管尖端进行包被
Triton X-100Sigma-AldrichT-9284
2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐 (ABTS)Sigma-AldrichA9941-50TABABTS 底物溶液的关键组分
30% 过氧化氢溶液Sigma-AldrichH1009-100MLABTS 底物溶液的组分
N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 (fMLP 或 fMLF)Sigma-AldrichF-3506应配制 10 mM 的储存液于 DMSO 中，并分装后于 -20 ºC 保存
明胶 B 型Fisher ScientificM-12026
铜绿假单胞菌分离琼脂 Fisher ScientificDF0927-17-1按照制造商’s 说明制备 PIA 平板
Ficoll-Paque PLUS Fisher Scientific45-001-749可选，可提高中性粒细胞纯度
24 孔迁移板Corning Incorporated#3524
24 孔洗涤板Falcon35-1147若在重复使用前用 70% 乙醇浸泡并彻底清洗，可重复使用
96 孔板Fisher Scientific#12565501
Transwell 可渗透支持膜 Corning Incorporated#3415聚碳酸酯；直径：6.5 mm；生长面积：0.33 cm2；培养皿类型：24 孔板；孔径：3.0 µm
培养皿Falcon35-1013每个培养皿可容纳 24 个倒置的 0.33 cm2 Transwell。  
500 ml 0.2 μm 滤器/烧瓶Fisher Scientific09-740-25A用于酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的除菌
5-3/4 英寸玻璃巴斯德吸管Fisher Scientific13-678-20A使用前需用 Sigmacote 包被尖端
止血钳Fisher Scientific13-812-14弯曲，带齿
Invertoskop 倒置显微镜Zeiss#342222
Versa-Max 微孔板读数仪Molecular Devices#432789

参考文献

  1. Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
  2. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threats. Curr. Gastroenterol. Rep. 6, 355-361 (2004).
  3. McCormick, B. A. Bacterial-induced hepoxilin A3 secretion as a pro-inflammatory mediator. FEBS J. 274, 3513-3518 (2007).
  4. Mumy, K. L., McCormick, B. A. The role of neutrophils in the event of intestinal inflammation. Curr. Opin. Pharmacol. 9, 697-701 (2009).
  5. Chin, A. C., Parkos, C. A. Pathobiology of neutrophil transepithelial migration: implications in mediating epithelial injury. Annu. Rev. Pathol. 2, 111-143 (2007).
  6. Segel, G. B., Halterman, M. W., Lichtman, M. A. The paradox of the neutrophil's role in tissue injury. J. Leukoc. Biol. 89, 359-372 (2011).
  7. Weiss, S. J. Tissue destruction by neutrophils. N. Engl. J. Med. 320, 365-376 (1989).
  8. Hurley, B. P., Thorpe, C. M., Acheson, D. W. Shiga toxin translocation across intestinal epithelial cells is enhanced by neutrophil transmigration. Infect. Immun. 69, 6148-6155 (2001).
  9. Kohler, H., et al. Salmonella enterica serovar Typhimurium regulates intercellular junction proteins and facilitates transepithelial neutrophil and bacterial passage. Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol. 293, 178-187 (2007).
  10. Gane, J., Stockley, R. Mechanisms of neutrophil transmigration across the vascular endothelium in COPD. Thorax. 67, 553-561 (2012).
  11. Grommes, J., Soehnlein, O. Contribution of neutrophils to acute lung injury. Mol. Med. 17, 293-307 (2011).
  12. Nakagome, K., Matsushita, S., Nagata, M. Neutrophilic inflammation in severe asthma. Int. Arch. Allergy Immunol.. 158 Suppl 1, 96-102 (2012).
  13. Choi, E. Y., Santoso, S., Chavakis, T. Mechanisms of neutrophil transendothelial migration. Front. Biosci. 14, 1596-1605 (2009).
  14. Louis, N. A., Campbell, E., Colgan, S. P. Model systems to investigate neutrophil adhesion and chemotaxis. Methods Mol. Biol. 412, 257-270 (2007).
  15. Craig, A., Mai, J., Cai, S., Jeyaseelan, S. Neutrophil recruitment to the lungs during bacterial pneumonia. Infect. Immun. 77, 568-575 (2009).
  16. Hurley, B. P., McCormick, B. A. Translating tissue culture results into animal models: the case of Salmonella typhimurium. Trends Microbiol. 11, 562-569 (2003).
  17. Lee, W. Y., Chin, A. C., Voss, S., Parkos, C. A. In vitro neutrophil transepithelial migration. Methods Mol. Biol. 341, 205-215 (2006).
  18. Hurley, B. P., Siccardi, D., Mrsny, R. J., McCormick, B. A. Polymorphonuclear cell transmigration induced by Pseudomonas aeruginosa requires the eicosanoid hepoxilin A3. J. Immunol. 173, 5712-5720 (2004).
  19. McCormick, B. A., Colgan, S. P., Delp-Archer, C., Miller, S. I., Madara, J. L. Salmonella typhimurium attachment to human intestinal epithelial monolayers: transcellular signalling to subepithelial neutrophils. J. Cell Biol. 123, 895-907 (1993).
  20. McCormick, B. A., et al. Surface attachment of Salmonella typhimurium to intestinal epithelia imprints the subepithelial matrix with gradients chemotactic for neutrophils. J. Cell Biol. 131, 1599-1608 (1995).
  21. Mrsny, R. J., et al. Identification of hepoxilin A3 in inflammatory events: a required role in neutrophil migration across intestinal epithelia. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7421-7426 (2004).
  22. Tamang, D. L., et al. Hepoxilin A(3) facilitates neutrophilic breach of lipoxygenase-expressing airway epithelial barriers. J. Immunol. 189, 4960-4969 (2012).
  23. McCormick, B. A., Parkos, C. A., Colgan, S. P., Carnes, D. K., Madara, J. L. Apical secretion of a pathogen-elicited epithelial chemoattractant activity in response to surface colonization of intestinal epithelia by Salmonella typhimurium. J. Immunol. 160, 455-466 (1998).
  24. Boll, E. J., et al. Enteroaggregative Escherichia coli promotes transepithelial migration of neutrophils through a conserved 12-lipoxygenase pathway. Cell Microbiol. 14, 120-132 (2012).
  25. Hurley, B. P., et al. The two-component sensor response regulator RoxS/RoxR plays a role in Pseudomonas aeruginosa interactions with airway epithelial cells. Microbes Infect. 12, 190-198 (2010).
  26. Hurley, B. P., Williams, N. L., McCormick, B. A. Involvement of phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-mediated PMN transepithelial migration. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 290, L703-L709 (2006).
  27. McCormick, B. A., Siber, A. M., Maurelli, A. T. Requirement of the Shigella flexneri virulence plasmid in the ability to induce trafficking of neutrophils across polarized monolayers of the intestinal epithelium. Infect. Immun. 66, 4237-4243 (1998).
  28. Savkovic, S. D., Koutsouris, A., Hecht, G. Attachment of a noninvasive enteric pathogen, enteropathogenic Escherichia coli, to cultured human intestinal epithelial monolayers induces transmigration of neutrophils. Infect. Immun. 64, 4480-4487 (1996).
  29. Agbor, T. A., Demma, Z. C., Mumy, K. L., Bien, J. D., McCormick, B. A. The ERM protein, ezrin, regulates neutrophil transmigration by modulating the apical localization of MRP2 in response to the SipA effector protein during Salmonella typhimurium infection. Cell Microbiol. 13, 2007-2021 (2011).
  30. Pazos, M., et al. Multidrug resistance-associated transporter 2 regulates mucosal inflammation by facilitating the synthesis of hepoxilin A3. J. Immunol. 181, 8044-8052 (2008).
  31. Agace, W. W., Patarroyo, M., Svensson, M., Carlemalm, E., Svanborg, C. Escherichia coli induces transuroepithelial neutrophil migration by an intercellular adhesion molecule-1-dependent mechanism. Infect. Immun. 63, 4054-4062 (1995).
  32. Bhowmick, R., et al. Systemic Disease during Streptococcus pneumoniae Acute Lung Infection Requires 12-Lipoxygenase-Dependent Inflammation. J. Immunol. , (2013).
  33. Hurley, B. P., Pirzai, W., Mumy, K. L., Gronert, K., McCormick, B. A. Selective eicosanoid-generating capacity of cytoplasmic phospholipase A2 in Pseudomonas aeruginosa-infected epithelial cells. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 300, 286-294 (2011).
  34. Hurley, B. P., Sin, A., McCormick, B. A. Adhesion molecules involved in hepoxilin A3-mediated neutrophil transepithelial migration. Clin. Exp. Immunol. 151, 297-305 (2008).
  35. Frank, D. W. Research Topic on Pseudomonas aeruginosa, Biology, Genetics, and Host-Pathogen Interactions. Front. Microbiol. 3, 20 (2012).
  36. Lyczak, J. B., Cannon, C. L., Pier, G. B. Lung infections associated with cystic fibrosis. Clin. Microbiol. Rev. 15, 194-222 (2002).
  37. Bucior, I., Mostov, K., Engel, J. N. Pseudomonas aeruginosa-mediated damage requires distinct receptors at the apical and basolateral surfaces of the polarized epithelium. Infect. Immun. 78, 939-953 (2010).
  38. Kierbel, A., et al. Pseudomonas aeruginosa exploits a PIP3-dependent pathway to transform apical into basolateral membrane. J. Cell Biol. 177, 21-27 (2007).
  39. Lee, C. A., et al. A secreted Salmonella protein induces a proinflammatory response in epithelial cells, which promotes neutrophil migration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 12283-12288 (2000).
  40. Zurawski, D. V., Mumy, K. L., Faherty, C. S., McCormick, B. A., Maurelli, A. T. Shigella flexneri type III secretion system effectors OspB and OspF target the nucleus to downregulate the host inflammatory response via interactions with retinoblastoma protein. Mol. Microbiol. 71, 350-368 (2009).
  41. Brazil, J. C., et al. Neutrophil migration across intestinal epithelium: evidence for a role of CD44 in regulating detachment of migrating cells from the luminal surface. J. Immunol. 185, 7026-7036 (2010).
  42. Lawrence, D. W., et al. Antiadhesive role of apical decay-accelerating factor (CD55) in human neutrophil transmigration across mucosal epithelia. J. Exp. Med. 198, 999-1010 (2003).
  43. Hodges, K., Hecht, G. Interspecies communication in the gut, from bacterial delivery to host-cell response. J. Physiol. 590, 433-440 (2012).

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病原体诱导迁移上皮单层感染Transwell滤膜系统中性粒细胞分离铜绿假单胞菌PAO1髓过氧化物酶活性胶原包被程序Hank's Plus缓冲液
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