中性粒细胞在黏膜细菌感染刺激下发生跨上皮迁移，可导致上皮损伤及临床疾病。 一个 体外 已开发出一种模型，该模型结合了病原体、人中性粒细胞以及在Transwell滤膜上培养的极化人上皮细胞层，以促进对调控此现象的分子机制进行深入研究。
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摘要
摘要
黏膜表面作为抵御病原生物的保护屏障。 先天免疫反应在感知病原体后被激活，导致以中性粒细胞为主的炎性细胞迁移并浸润组织。 如果过度进行或处于未解决状态，该过程可能对组织具有破坏性。 共培养 体外 模型可用于研究病原体诱导中性粒细胞跨上皮迁移过程中涉及的独特分子机制。 此类模型在实验设计上具有灵活性，可对病原体、上皮屏障或中性粒细胞进行可控性操控。 在可渗透的Transwell小室滤膜上培养的极化上皮单层，其顶面受到病原体感染时，会引发从基底侧向顶侧跨上皮迁移的生理相关性中性粒细胞迁移，中性粒细胞被施加于基底侧表面。 的 体外 本文所述模型展示了证明中性粒细胞迁移穿过受病原体感染的极化肺上皮单层所需的多个步骤 P. aeruginosa (PAO1) 描述了利用人源性肺上皮细胞在可渗透的Transwell小室中进行接种和培养的方法，以及从全人血中分离中性粒细胞和培养铜绿假单胞菌PAO1与非致病性K12菌株的过程 E. coli (MC1000) 迁移过程及对因病原体感染而被激活并成功迁移的中性粒细胞进行定量分析的代表性数据，包括阳性与阴性对照。 这 体外 该模型系统可被操控并应用于其他黏膜表面。 涉及过度中性粒细胞浸润的炎症反应可能对宿主组织造成破坏，并可在无病原体感染的情况下发生。 通过实验操控促进中性粒细胞跨上皮迁移的分子机制的更深入理解 体外 本文所述的共培养检测系统在识别多种黏膜感染性和炎症性疾病的新治疗靶点方面具有重要意义。
引言
黏膜表面作为物理和免疫屏障，能够抵御环境中普遍存在的外部威胁1,2。 当病原体入侵时，这种保护性上皮屏障可能遭到破坏2。 对于细菌性病原体而言，这种相互作用通常会通过激活先天免疫系统，引发一类被称为中性粒细胞的首批应答粒细胞的快速募集，从而启动炎症反应2-4。趋化因子部分由黏膜上皮细胞产生，以促进中性粒细胞的招募，帮助宿主清除致病菌2-4。 中性粒细胞在黏膜上皮表面过度或持续性的浸润可导致显著的病理损伤1,5。 这是由于中性粒细胞抗菌武器库对组织造成的非特异性损伤所致5-7。 在此类情况下，中性粒细胞在清除细菌的同时，对宿主组织的破坏作用超过了其防御功能。 保护性上皮屏障功能的破坏可使下层组织更易暴露于微生物和/或毒素，进一步加重疾病病理过程8,9。 这些后果可在多个器官系统中观察到，包括肺和消化道1,5。 此外，某些非感染性炎症性疾病，如重度哮喘发作、慢性阻塞性肺疾病（COPD）、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和炎症性肠病（IBD），其特征也是由过度的中性粒细胞反应导致黏膜上皮屏障的病理性破坏4,5,10-12。
中性粒细胞在黏膜感染后募集的复杂过程涉及多个区室化的步骤1,5,13,14
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方案
步骤（1-3）应在层流罩内的无菌环境中进行。
1. 胶原蛋白包被Transwell
- 配制 30 µg/ml 的胶原蛋白溶液。将 3 mg/ml 的胶原蛋白储备液用已通过 0.2 µm 滤器过滤的 60% 乙醇按 1:100 比例稀释。
- 涡旋振荡稀释后的 30 µg/ml 溶液。注意：无需涡旋振荡 3 mg/ml 的胶原蛋白储备液，因为该溶液黏度较高，涡旋可能引入气泡，从而影响移液时的准确性。
- 从外包装中取出具有 3 µm 孔径、生长面积为 0.33 cm2 的 transwell 小室，并将含有 12 个 transwell 的 24 孔板倒置放入生物安全柜中。
- 取下底部平板并置于一旁。注意：此时 transwell 将倒置并放置在 24 孔板盖子上。
- 点燃本生灯。用火焰灼烧止血钳以灭菌，并使其冷却。
- 使用无菌止血钳将 transwell 转移至一个 150 mm × 25 mm 的培养皿中，保持其倒置状态。注意：务必保持空的 24 孔板及其盖子的无菌状态，以便后续用于承载接种上皮细胞后的 transwell。
- 向每个倒置 transwell 的滤膜表面加入 70 µl 的 30 µg/ml 胶原蛋白溶液。注意：由于从底部接触滤膜表面时周围无壁，表面张力应足以使该体积的溶液保持原位。操作时需小心....
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结果
多项研究表明，病原体感染的上皮层可促进中性粒细胞跨上皮迁移3,8,19,24-28,31,32。这一过程通过病原体特异性诱导上皮细胞产生中性粒细胞趋化梯度而实现3,23。例如，致病性 P. aeruginosa 与肺上皮细胞顶面相互作用后，可引起大量中性粒细胞迁移穿过上皮层18,22,25,26,33,34。该具有临床相关性的检测系统可与适当的对照结合，通过多种方式进行调控，以揭示关键的病原体和宿主分子作用因子。
将中性粒细胞加入未预先感染的极化上皮细胞层时，中性粒细胞无法以可观的数量迁移穿过上皮层。然而，在未感染的上皮层两侧施加趋化因子梯度，则可驱动大量中性粒细胞穿越。在研究中性粒细胞迁移穿过病原体感染的上皮层时，每项实验均需分别设置这两种阴性与阳性对照。阴性对照用于确定在无信号刺激条件下穿过上皮层的中性粒细胞本底数量。当培养的上皮细胞已形成功能性屏障时，该数值应极低。若本底迁移率过高，将影响对病原体感染上皮组织所得结果的解读。阳性对照是指在上皮层两侧施加中性粒细胞趋化因子（如fMLP）的浓度梯度.......
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讨论
中性粒细胞迁移穿过黏膜上皮表面是细菌病原体感染后疾病病理中的常见特征3本文所述方法提供了一种快速、简便的实验方案，用于分离源自人细胞的这一特定事件 体外 模拟细菌感染引发的炎症过程特征的共培养实验系统。该系统最初是利用感染了肠道病原体的极化肠上皮细胞建立的，包括 鼠伤寒沙门氏菌, 志贺氏菌 福氏志贺氏菌以及多种致病性 大肠杆菌8,19,24,27,28每种致病性生物均可驱动中性粒细胞穿过生长于倒置的胶原包被可渗透Transwell滤膜上的极化肠上皮单层。该实验体系经改良后已适用于研究肺上皮屏障及病原体诱导的中性粒细胞跨上皮迁移。18,26除H292外，多项研究还采用了其他几种气道上皮细胞系，包括常被引用的A549、BEAS-2B和Calu-3肺上皮细胞系22,26. P. aeruginosa 引发肺部炎症，造成显著损伤，是急性肺炎和囊性纤维化等疾病的特征35,36如所述，该肺部病原体 P. aeruginosa 在感染肺.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本研究工作由美国国立卫生研究院（NIH）提供经费支持（项目编号：1 R01 AI095338-01A1）。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NCl-H292 细胞 | ATCC | CRL-1848 | |
| RPMI-1640 培养基 | ATCC | 30-2001 | |
| Pseudomonas aeruginosa PAO1 | ATCC | #47085 | |
| Escherichia coli MC1000 | ATCC | #39531 | |
| D-PBS (1x) 液体 | Invitrogen | 14190-144 | 不含钙和镁 |
| 热灭活胎牛血清 | Invitrogen | 10082-147 | 添加至培养基中，终浓度为 10% |
| 青霉素-链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | 100 倍浓缩液：每毫升含 10,000 单位青霉素和 10,000 µg 链霉素 |
| 胰蛋白酶-EDTA (0.05%) | Invitrogen | 25300-062 | 分装为 50 ml，于 -20 ºC 冻存。 使用中的分装可短期存放于 4 ºC。 |
| Hank's 平衡盐溶液 - HBSS(-) | Invitrogen | 14175-079 | 无菌，不含钙和镁 |
| 台盼蓝溶液 | Invitrogen | 15250-061. | 储存液 = 0.4% |
| 大鼠尾胶原蛋白 | Invitrogen | A10483-01 | 也可使用标准方案直接从大鼠尾部分离获得 |
| 柠檬酸 | Sigma-Aldrich | C1909-500G | 1 M 柠檬酸盐缓冲液和酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的组分 |
| 柠檬酸钠 | Sigma-Aldrich | S4641-500G | 1 M 柠檬酸盐缓冲液的组分 |
| 无水葡萄糖 | Sigma-Aldrich | D8066-250G | 酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的组分 |
| 氯化铵 | Sigma-Aldrich | 213330-500G | 红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分 |
| 碳酸氢钠 | Sigma-Aldrich | S6014-500G | 红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分 |
| EDTA | Sigma-Aldrich | ED-100G | 红细胞 (RBC) 裂解缓冲液的组分 |
| HBSS(+) 粉末 | Sigma-Aldrich | H1387-10L | HBSS+ 的关键组分 |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H3375-500G | HBSS+ 的组分 |
| Sigmacote | Sigma-Aldrich | SL2-25ML | 按照供应商说明对玻璃移液管尖端进行包被 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T-9284 | |
| 2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸) 二铵盐 (ABTS) | Sigma-Aldrich | A9941-50TAB | ABTS 底物溶液的关键组分 |
| 30% 过氧化氢溶液 | Sigma-Aldrich | H1009-100ML | ABTS 底物溶液的组分 |
| N-甲酰基-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸 (fMLP 或 fMLF) | Sigma-Aldrich | F-3506 | 应配制 10 mM 的储存液于 DMSO 中，并分装后于 -20 ºC 保存 |
| 明胶 B 型 | Fisher Scientific | M-12026 | |
| 铜绿假单胞菌分离琼脂 | Fisher Scientific | DF0927-17-1 | 按照制造商’s 说明制备 PIA 平板 |
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-749 | 可选，可提高中性粒细胞纯度 |
| 24 孔迁移板 | Corning Incorporated | #3524 | |
| 24 孔洗涤板 | Falcon | 35-1147 | 若在重复使用前用 70% 乙醇浸泡并彻底清洗，可重复使用 |
| 96 孔板 | Fisher Scientific | #12565501 | |
| Transwell 可渗透支持膜 | Corning Incorporated | #3415 | 聚碳酸酯；直径：6.5 mm；生长面积：0.33 cm2；培养皿类型：24 孔板；孔径：3.0 µm |
| 培养皿 | Falcon | 35-1013 | 每个培养皿可容纳 24 个倒置的 0.33 cm2 Transwell。 |
| 500 ml 0.2 μm 滤器/烧瓶 | Fisher Scientific | 09-740-25A | 用于酸性柠檬酸葡萄糖 (ACD) 溶液的除菌 |
| 5-3/4 英寸玻璃巴斯德吸管 | Fisher Scientific | 13-678-20A | 使用前需用 Sigmacote 包被尖端 |
| 止血钳 | Fisher Scientific | 13-812-14 | 弯曲，带齿 |
| Invertoskop 倒置显微镜 | Zeiss | #342222 | |
| Versa-Max 微孔板读数仪 | Molecular Devices | #432789 |
参考文献
- Burns, A. R., Smith, C. W., Walker, D. C. Unique structural features that influence neutrophil emigration into the lung. Physiol. Rev. 83, 309-336 (2003).
- Hurley, B. P., McCormick, B. A. Intestinal epithelial defense systems protect against bacterial threat....
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