切片培养法用于观察牙胚在器官培养中的发育过程

摘要

本文详细介绍了一种利用组织切片机在下颌骨切片中培养牙胚的方法。该方法能够在牙齿发育过程中对其进行独特地观察和干预，为操作和谱系示踪提供了极佳的机会，而这些优势是传统培养方法所无法实现的。

摘要

外植体培养可对特定时间点的发育器官进行操作 因此是发育生物学家的一种重要方法。对于许多器官而言，很难接触到正在发育的组织以实现发育过程中的实时监测 离体 培养。切片培养法可使组织易于观察，从而能够追踪形态发生运动，并可针对特定细胞群体进行操作或谱系示踪。

本文介绍了一种在多种物种中成功用于牙胚培养的组织切片培养方法。该方法可充分暴露牙胚，使其发育速率与体内观察到的发育速率相近 体内，周围环绕着其他颌面部组织。这使得牙齿与其周围组织之间的相互作用得以被监测。尽管本文主要关注牙胚，但该相同方案也可用于追踪其他多种器官的发育过程，如唾液腺、Meckel 软骨、鼻腺、舌和耳。

引言

对于许多实验而言，能够培养组织至关重要 离体 以观察发育过程。通过培养发育中的组织，可在发育的特定时期进行取样，并可通过向培养基中添加因子或加载因子的微珠，以及通过转染和电穿孔技术，实现对基因的操控。¹对于许多实验而言，能够观察组织在生长过程中的变化至关重要，例如追踪谱系标记细胞在组织形态发生过程中的命运。对于在胚胎内部深层发育的组织，这一需求尤其具有挑战性，因为当胚胎组织块被培养时，这些深层结构并不明显。牙齿便是一个典型例子，其发育发生在下颌骨、上颌骨以及额鼻突内。当整体培养下颌骨时，仅能观察到牙齿的表层结构，而形态学上的变化只能通过对固定后的组织切片进行分析才能获得。²我们改进了一种活体组织切片培养技术，可实现对牙胚发育过程的连续观察，并在发育过程中方便地接触牙体的各个部分。该技术采用改良的特罗韦尔（Trowell）方法，将牙胚组织切片置于气液界面进行培养。³这些切片培养物在直接观察牙齿形态发生过程以及追踪不同组分（如釉结节、牙乳头和牙囊）的谱系方面非常有用。^1,4-7该技术不仅限于小鼠胚胎，已成功用于培养猪和蛇牙齿组织的活体切片^8,9除了能够直观观察牙齿发育过程外，切片法还具有组织切片较薄、可更充分接触培养基中的营养物质以及培养箱中的气体的优势。这有助于牙胚生长得到改善，使其发育状况与实际情况相符 体内，并显示内皮细胞侵入乳头⁷相比之下，下颌骨整体培养中的牙胚发育速度较慢 体内 长期培养中，培养物中心常出现坏死。在组织切片培养中，牙齿在下颌骨切片内发育，可监测其与周围发育中的骨组织及其他组织的相互作用。在本方法中，组织在解剖后直接切碎，无需包埋于支撑介质中。^10,11 无需使用任何系统将组织固定在切块板上。因此，该方法具有非侵入性和快速的特点，可在一次操作中对多个下颌骨进行切片。

方案

1. 实验准备

1. 使用磨刀石（以矿物油润滑）磨利解剖器械，并在使用前通过70%乙醇喷雾和干热灭菌法进行消毒。使用12 V电源在2 M氢氧化钠溶液中通过电解法磨利解剖针。
2. 准备用于胚胎器官解剖和培养的培养基，该培养基由添加了1% GlutaMAX 和1%青霉素-链霉素的Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12（DMEM F12）组成。

2. 胚胎解剖

1. 按照英国政府或其他主管机构批准的计划一方法，处死一只定时交配的怀孕雌性动物。剥离下腹部周围的皮肤，并用剪刀切开腹部。找到在下腹中线处相连的两个子宫角。
2. 取出子宫并置于装有培养基的离心管中，置于冰上。组织在冰上可保存数小时。
3. 将子宫取出，放入含有培养基的培养皿中，并置于显微镜下。尽可能在层流罩内进行胚胎解剖操作，以最大限度减少污染。
4. 从子宫中分离出胚胎，并去除其胚外组织。
5. 使用钨针切除胚胎头部，并将头部分离转移至含有新鲜培养基的新培养皿中。
6. 将针插入口腔内，向头后部切割，从而从头部分离下颌骨（图1A和 1B）。分离后的下颌骨可在冰上的培养基中暂时保存，等待后续切片处理。
7. 对于完整下颌骨切片，E11.5–E15.5阶段最适合牙胚培养。E15.5之后，下颌骨内发育中的骨组织过于坚硬，难以切片。虽然仍可制备牙体切片，但在切片前必须先通过解剖去除骨组织（齿骨及正在形成的牙槽骨）⁹。使用钨针和镊子小心去除骨组织。

3. 胚胎切片

1. 使用标准的台式组织切片机准备下颌组织切片（图1C）。每处理约200个下颌样本后应更换新刀片，并确保刀片落下时与安装盘表面齐平。
2. 使用前用70%乙醇清洁安装盘和刀片。操作仪器时务必小心，因为刀片非常锋利。
3. 根据样本的发育年龄以及是否需要完整的牙胚，将切片机的切片距离设置为200–400 μm之间。将刀片力度调至最大。
4. 使用移液器或镊子将下颌样本转移至塑料安装盘上。在盘上摆放下颌时，需确保其方向清晰可辨。发育中的舌体可作为判断方向的有用解剖标志。对于磨牙，采用额面/横断面方向（见图1B中的切片平面）；对于切牙，则采用通过下颌的矢状面切片，以反映这些牙齿在生长过程中的不同取向（见图2A中的切片平面）。
5. 用滤纸吸除组织周围的多余培养基，使下颌样本在安装盘上轻微干燥。
6. 干燥后立即把安装盘放置在切片机的圆形不锈钢平台上。打开机器并按下启动键。平台会自动从左向右移动，同时携带刀片的切片臂以最高达200次/分钟的频率上下往复运动进行切片。
7. 当组织完全被切片后，关闭机器。确保刀片臂处于抬起位置后再取出安装盘。切片过程中切勿将手指置于刀片臂下方，也不得无人看管运行中的机器。
8. 取下安装盘后，立即向盘上的切片加入培养基，以防止组织过度干燥。使用钨针小心地将切下的组织从盘底剥离，然后用移液器转移至盛有培养基的小型培养皿中（图2A）。
9. 用针将切片分开，在体视显微镜下挑选含有目标组织的切片（图1D、1E 和2B）。将选好的切片置于含新鲜培养基的培养皿中。

4. 切片培养

1. 通过向培养皿外周加入约 2 ml 经高压灭菌的水以防止脱水，并将金属网格置于培养皿中央，准备好中央小室的器官培养皿用于培养（图 3A 和 3B）。
2. 通过从不锈钢网片上裁剪出约 4 cm × 1.5 cm 的条状物制备金属网格 。使用打孔器在条带中央打孔，并将两侧弯曲形成交错的末端。网格应平整地横跨中央小室，与培养皿底部平行（图 3A 和 3B）。使用前对网格进行高压灭菌以实现灭菌。
3. 裁剪一块足够大的透明聚对苯二甲酸乙二醇酯（PET）膜（孔径 0.4 μm），以覆盖网格中的孔洞。将裁剪好的膜放入含有选定组织切片的培养皿中。
4. 将切片置于膜的上方，然后小心地将膜从培养基中提起，使切片平整地位于中央。
5. 将滤膜放置在网格上，覆盖中央的圆形孔洞，并向小室中加入约 1 ml 培养基，使液面达到膜的水平。
6. 如需进行干预操作，可在培养基中添加蛋白质或小分子抑制剂（例如⁸）。
7. 在培养第 0 天拍摄切片图像，以记录其形态学特征。
8. 将培养皿置于 37 °C、5% CO₂ 的湿润化培养箱中进行培养。
9. 在平均约 7 天的培养期间定期拍摄培养物图像。每 48–72 小时更换一次培养基。拍摄时使用底部光源观察切片（图 2C–E）。

5. 谱系示踪

如果需要进行谱系示踪，可在第4步切片培养之前将脂溶性染料（如DiI或DiO）注入牙胚中。

1. 使用拉针仪拉制玻璃毛细管针头。
2. 用镊子折断针尖，将针尖朝下放入染料溶液中。静置数分钟，使染料通过毛细作用充满针尖。
3. 将充满染料的针头插入持针器，并通过导管连接至注射器或口吸装置。
4. 将针尖置于培养液中，接触待标记的脑片区域。施加气压，将少量染料从针头推出并沉积到组织上。
5. 移除针头，并在荧光下检查标记情况。
6. 标记成功的脑片可转移至滤膜上，按步骤4所述进行培养。

结果

为了追踪第一恒磨牙牙囊的移动，采用上述方法对下颌骨进行250 μm的冠状切片。牙囊是包围发育中牙齿外釉上皮（OEE）的一层间充质组织，先前已被证明参与牙周组织的形成⁶。下颌骨样本取自E14.5时期，即牙齿发育的帽状期。在切片中，牙上皮的轮廓清晰可见，围绕牙上皮的致密化牙间充质可识别为一圈较深的环状结构（图4A）。在切片舌侧的牙外釉上皮旁的间充质区域注射DiI染料（图4A）。标记后，切片被培养4天，并在不同时间点拍照记录（图4B和4C）。在体内，牙胚在E18.5时应已达到钟状期，而在切片中也观察到了明显的钟状期形态，表明在此时间段内发育进程相似。随着牙齿的生长，DiI标记区域逐渐延伸为一条环绕外牙上皮的细胞带（图4B和4C）。

讨论

这种牙齿培养方法的优点在于能够很好地接触到牙胚，从而可以精确地进行谱系示踪，并将微珠准确放置于上皮组织或间充质中。因此，在培养过程中可特异性地靶向发育中牙胚的特定区域。在培养期间，可连续观察牙胚形态的动态变化，并快速评估各种干预操作的效果。

然而，该方法仅适用于硬组织（如牙本质和牙釉质）大量形成之前的年轻牙胚，因为这些硬组织无法被准确切碎。对于胚胎15.5天（E15.5）后的下颌骨，必须在切碎前去除骨组织。这种方法的缺点是可能损伤牙胚，因为从E16.5开始牙胚与骨组织紧密相连。我们已成功对分离的牙胚进行切片，最晚至出生后第4天；此后由于牙釉质的沉积，牙齿变得过于坚硬，无法被切片机切割。该切片方法在E13.5时期的牙胚上效果良好。 即 芽期^1,6在此时间点之前，当牙齿处于上皮增厚阶段时，牙胚虽能发育，但成功率降低，且长期来看形态可能受到影响。

该方法的一个主要缺点是切片在牙齿中的切割位置是随机的。在某些切片中，整个牙胚会完整地位于一个切片内，而在另一些切片中，切片器可能会将牙胚从中间切断。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙醇	VWR	101077Y	将100%乙醇用蒸馏H2O稀释至70%。
DMEM F12	Gibco	12634-010	高级DMEM/F12培养基（Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12）
GlutaMAX	Gibco	35050-061
青霉素-链霉素	Sigma	P0781
DiI（Molecular probes）	Vybrant	V-22885	细胞标记溶液
	Invitrogen		细胞示踪剂 CM-DiI，C-7000
DiO（Molecular probes）	Vybrant	V22886
Geminator 500	Thomas	Thomas No. 3885A20	干热灭菌器
McIlwain组织切片机	Ted Pella, Inc.	10180	标准型号
器官培养皿（带中心井的器官培养皿）	Falcon	353037
膜（细胞培养插件，0.4 μm孔径）	BD Falcon	353090	PET核径迹蚀刻膜，6孔板规格
金属网格（不锈钢 - AISI 304 - 网格）	Goodfellow	FE228710	(Fe/Cr18/Ni10)
AutoFlow直接加热CO2培养箱	Nuaire	NU-5500
Picospritzer III	Intracel Ltd	051-0500-900 0-100 psi	单通道Picospritzer III
带内丝玻璃毛细管，直径1 mm	WPI	TW100F-4
钨丝，直径0.1 mm	Goodfellow	W005138
钨丝，直径0.38 mm	Goodfellow	W005155
吸液管	Sigma	A5177	用于口吸法细胞谱系示踪