本文详细介绍了一种利用组织切片机在下颌骨切片中培养牙胚的方法。该方法能够在牙齿发育过程中对其进行独特地观察和干预，为操作和谱系示踪提供了极佳的机会，而这些优势是传统培养方法所无法实现的。
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本文内容
摘要
摘要
外植体培养可对特定时间点的发育器官进行操作 因此是发育生物学家的一种重要方法。对于许多器官而言，很难接触到正在发育的组织以实现发育过程中的实时监测 离体 培养。切片培养法可使组织易于观察，从而能够追踪形态发生运动，并可针对特定细胞群体进行操作或谱系示踪。
本文介绍了一种在多种物种中成功用于牙胚培养的组织切片培养方法。该方法可充分暴露牙胚，使其发育速率与体内观察到的发育速率相近 体内，周围环绕着其他颌面部组织。这使得牙齿与其周围组织之间的相互作用得以被监测。尽管本文主要关注牙胚，但该相同方案也可用于追踪其他多种器官的发育过程，如唾液腺、Meckel 软骨、鼻腺、舌和耳。
引言
对于许多实验而言，能够培养组织至关重要 离体 以观察发育过程。通过培养发育中的组织，可在发育的特定时期进行取样，并可通过向培养基中添加因子或加载因子的微珠，以及通过转染和电穿孔技术，实现对基因的操控。1对于许多实验而言，能够观察组织在生长过程中的变化至关重要，例如追踪谱系标记细胞在组织形态发生过程中的命运。对于在胚胎内部深层发育的组织，这一需求尤其具有挑战性，因为当胚胎组织块被培养时，这些深层结构并不明显。牙齿便是一个典型例子，其发育发生在下颌骨、上颌骨以及额鼻突内。当整体培养下颌骨时，仅能观察到牙齿的表层结构，而形态学上的变化只能通过对固定后的组织切片进行分析才能获得。2我们改进了一种活体组织切片培养技术，可实现对牙胚发育过程的连续观察，并在发育过程中方便地接触牙体的各个部分。该技术采用改良的特罗韦尔（Trowell）方法，将牙胚组织切片置于气液界面进行培养。3这些切片培养物在直接观察牙齿形态发生过程以及追踪不同组分（如釉结节、牙乳头和牙囊）的谱系方面非常有用。1,4-7该技术不仅限于小鼠胚胎，已成功用于培养猪和蛇牙齿组织的活体切片8,9除了能够直观观察牙齿发育过程外，切片法还具有组织切片较薄、可更充分接触培养基中的营养物质以及培养箱中的气体的优势。这有助于牙胚生长得到改善，使其发育状况与实际情况相符 体内，并显示内皮细胞侵入乳头7相比之下，下颌骨整体培养中的牙胚....
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方案
1. 实验准备
- 使用磨刀石（以矿物油润滑）磨利解剖器械，并在使用前通过70%乙醇喷雾和干热灭菌法进行消毒。使用12 V电源在2 M氢氧化钠溶液中通过电解法磨利解剖针。
- 准备用于胚胎器官解剖和培养的培养基，该培养基由添加了1% GlutaMAX 和1%青霉素-链霉素的Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12（DMEM F12）组成。
2. 胚胎解剖
- 按照英国政府或其他主管机构批准的计划一方法，处死一只定时交配的怀孕雌性动物。剥离下腹部周围的皮肤，并用剪刀切开腹部。找到在下腹中线处相连的两个子宫角。
- 取出子宫并置于装有培养基的离心管中，置于冰上。组织在冰上可保存数小时。
- 将子宫取出，放入含有培养基的培养皿中，并置于显微镜下。尽可能在层流罩内进行胚胎解剖操作，以最大限度减少污染。
- 从子宫中分离出胚胎，并去除其胚外组织。
- 使用钨针切除胚胎头部，并将头部分离转移至含有新鲜培养基的新培养皿中。
- 将针插入口腔内，向头后部切割，从而从头部分离下颌骨（图1A和 1B）。分离后的下颌骨可在冰上的培养基中暂时保存，等待后续切片处理。
- 对于完整下颌骨切片，E11.5....
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结果
为了追踪第一恒磨牙牙囊的移动，采用上述方法对下颌骨进行250 μm的冠状切片。牙囊是包绕发育中牙齿外釉上皮（OEE）的一层间充质组织，先前已被证明参与牙周组织的形成6。下颌骨样本取自E14.5时期，即牙齿发育的帽状期。在切片中，牙上皮的轮廓清晰可见，而围绕牙上皮的致密化牙间充质则表现为一圈较深的环状结构（图4A）。在切片舌侧的牙外釉上皮旁的间充质区域注射DiI染料（图4A）。标记后，切片被培养4天，并在不同时间点拍照记录（图4B和图4C）。体内情况下，牙胚在E18.5时应已达到钟状期，而在切片中也观察到了明显的钟状期形态，表明在此时间段内发育进程相似。随着牙齿的生长，DiI标记区域逐渐延伸，形成一条环绕外牙上皮的细胞带（图4B和图4C）。
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讨论
这种牙齿培养方法的优点在于能够很好地接触到牙胚，从而可以精确地进行谱系示踪，并将微珠准确放置于上皮组织或间充质中。因此，在培养过程中可特异性地靶向发育中牙胚的特定区域。在培养期间，可连续观察牙胚形态的动态变化，并快速评估各种干预操作的效果。
然而，该方法仅适用于硬组织（如牙本质和牙釉质）大量形成之前的年轻牙胚，因为这些硬组织无法被准确切碎。对于胚胎15.5天（E15.5）后的下颌骨，必须在切碎前去除骨组织。这种方法的缺点是可能损伤牙胚，因为从E16.5开始牙胚与骨组织紧密相连。我们已成功对分离的牙胚进行切片，最晚至出生后第4天；此后由于牙釉质的沉积，牙齿变得过于坚硬，无法被切片机切割。该切片方法在E13.5时期的牙胚上效果良好。 即 芽期1,6在此时间点之前，当牙齿处于上皮增厚阶段时，牙胚虽能发育，但成功率降低，且长期来看形态可能受到影响。
该方法的一个主要缺点是切片在牙齿中的切割位置是随机的。在某些切片中，整个牙胚会完整地位于一个切片内，而在另一些切片中，切片器可能会将牙胚从中间切断。.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
Sarah A. Alfaqeeh 由沙特阿拉伯王国高等教育 Ministry、沙特国王大学牙科学院资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙醇 | VWR | 101077Y | 将100%乙醇用蒸馏H2O稀释至70%。 |
| DMEM F12 | Gibco | 12634-010 | 高级DMEM/F12培养基（Advanced Dulbecco's Modified Eagle Medium F12） |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma | P0781 | |
| DiI（Molecular probes） | Vybrant | V-22885 | 细胞标记溶液 |
| Invitrogen | 细胞示踪剂 CM-DiI，C-7000 | ||
| DiO（Molecular probes） | Vybrant | V22886 | |
| Geminator 500 | Thomas | Thomas No. 3885A20 | 干热灭菌器 |
| McIlwain组织切片机 | Ted Pella, Inc. | 10180 | 标准型号 |
| 器官培养皿（带中心井的器官培养皿） | Falcon | 353037 | |
| 膜（细胞培养插件，0.4 μm孔径） | BD Falcon | 353090 | PET核径迹蚀刻膜，6孔板规格 |
| 金属网格（不锈钢 - AISI 304 - 网格） | Goodfellow | FE228710 | (Fe/Cr18/Ni10) |
| AutoFlow直接加热CO2培养箱 | Nuaire | NU-5500 | |
| Picospritzer III | Intracel Ltd | 051-0500-900 0-100 psi | 单通道Picospritzer III |
| 带内丝玻璃毛细管，直径1 mm | WPI | TW100F-4 | |
| 钨丝，直径0.1 mm | Goodfellow | W005138 | |
| 钨丝，直径0.38 mm | Goodfellow | W005155 | |
| 吸液管 | Sigma | A5177 | 用于口吸法细胞谱系示踪 |
参考文献
- Rothova, M., Peterkova, R., Tucker, A. S. Fate map of the dental mesenchyme: dynamic development of the dental papilla and follicle. Developmental biology. 366, 244-254 (2012).
- Ferguson, C. A., et al.
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