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方法文章

在实验性自身免疫性脑脊髓炎成年小鼠中植入玻璃脊髓窗

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DOI：

10.3791/50826

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2013年12月21日

 ,  ,  , 
1Developmental Biology Institute of Marseille-Luminy (IBDML), Aix Marseille University, 2Campus de la Timone, European Research Center for Medical Imaging (CERIMED)

本文内容

摘要

我们介绍了一种在成年小鼠暴露的脊髓上植入并维持玻璃窗的方法，用于研究实验性自身免疫性脑脊髓炎。这些玻璃窗可长期提供对脊髓的光学通路，从而在活体动物中利用双光子显微镜在亚细胞水平上监测细胞动态。

摘要

成年啮齿类动物的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是研究多发性硬化等自身免疫性脱髓鞘疾病的常用实验模型。本文介绍一种低成本且可重复的玻璃窗植入方案，适用于活体成年EAE小鼠脊髓组织细胞结构的活体显微观察，可在亚细胞分辨率下研究其动态变化。简言之，我们通过手术暴露T12-L2椎骨，并使用氰基丙烯酸酯和牙科水泥在暴露的椎骨周围构建一个腔室。在T13至L1节段进行椎板切除术，随后在暴露的脊髓背侧表面覆盖一层透明的硅胶弹性体。将改良的玻璃盖玻片植入暴露的脊髓上方，注意避免玻璃直接接触脊髓组织。为减少植入窗与脊髓之间炎性细胞的浸润，根据伦理委员会建议，在植入术后前10天内每2天给予一次抗炎治疗。抗炎治疗停止后2-3周再诱导EAE模型。

采用该方法，我们在植入窗口的动物中成功诱导出87%的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型，并利用Thy1-CFP-23小鼠（背侧脊髓中的蓝色轴突）量化了EAE病程中轴突的丢失情况。综上所述，该实验方案可用于研究多种细胞群体的募集过程及其相互作用动态，实现亚细胞分辨率下长时间的活体观察。这种活体成像技术为开发治疗EAE等自身免疫性脱髓鞘疾病的治疗策略提供了有价值的工具。

引言

多发性硬化症是一种导致髓鞘和轴突进行性损伤的中枢神经系统自身免疫性疾病。研究中枢神经系统自身免疫性脱髓鞘疾病的常用模型是成年啮齿类动物的实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）。然而，EAE进展过程中涉及的动态细胞事件在很大程度上仍未被阐明。一种可行的方法是利用活体双光子显微镜，对患有EAE的成年小鼠脊髓中带有荧光标记的细胞群体进行长时间的实时观察。

活体双光子显微成像是研究活体动物中细胞生理学、细胞间相互作用以及疾病动态进展的有力方法，具有亚细胞分辨率1。然而，该技术面临的主要障碍在于需要对目标区域实现光学通路。例如，颅骨玻璃窗是一种成熟的方法，可用于在数周时间内重复观察大脑中相同的微结构2,3。然而，将该方法应用于脊髓成像并不直接可行，需要进行多项技术改进，以在活动的椎骨结构中固定背侧脊髓组织。

此前，每次成像前均需通过手术重新暴露脊髓，并在每次成像结束后缝合皮肤4-12这些重复的手术对动物具有创伤性，限制了成像实验的次数和持续时间，并增加了与手术相关的伪影发生概率，例如因机械扰动导致的炎症以及脊髓损伤。为克服这些不足，我们近期建立了一种实验方案，用于在患有创伤性脊髓损伤的成年荧光转基因小鼠暴露的脊髓上植入玻璃窗，以实现长期成像 体内 无需重复手术的双光子显微成像实验13本文详细介绍了在研究成年小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）进展过程中动态细胞事件的应用背景下，对该植入技术方案的详细优化与改进。

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方案

1. 窗口及支撑结构准备

  1. 窗体制备——准备多个不同尺寸的窗体用于植入（宽度 = 1.8–2.2 mm；长度 = 4.5–5.2 mm）。
    1. 制作改良钻头以切割盖玻片——使用足量牙科水泥将钻头固定在手柄上（本实验中使用旧的Bulldog止血钳）。确保钻头与手柄成约45°角，以便于操作。
      注意：金刚石刻划笔也可有效用于切割盖玻片。
    2. 制作载玻片A——取标准显微镜载玻片，在其底部贴一小段标尺纸（约2 cm），使透过玻片可看清刻度。然后，在标尺的0 mm刻度线边缘贴一条胶带，作为下一步中固定盖玻片的定位装置。
    3. 使用改良钻头、载玻片A和一个未改装的显微镜载玻片（载玻片B），将一片盖玻片（1.5号厚度）对齐至载玻片A的0 mm刻度处。用载玻片B固定盖玻片，并作为引导工具确定切割线。沿直线将盖玻片切割成约5 × 22 mm的长矩形。将切割后的玻片旋转90°，再将其切割为约2 × 5 mm的小矩形。
  2. 订书钉改装——将两个改装订书钉植入体内，用于支撑并固定窗室至椎骨（见第2.7–2.8节）。
    1. 取标准小型订书钉（钉冠 = 8 mm；钉腿 = 4 mm），将钉冠中部弯曲约90°，使两钉尖几乎接触。
    2. 在钉腿中点处将钉尖向外弯曲约45°，使钉腿远端部分保持平行。
    3. 将钉腿远端部分相对于订书钉平面再向上弯曲约30°。手术前将改装后的订书钉放入乙醇中以进行消毒。
      注意：订书钉也可采用环氧乙烷或高压灭菌法进行消毒。
  3. 回形针改装——准备一个改装回形针，作为窗室的一部分植入（见第2.9–2.10节），并在手术和成像过程中用作固定夹。
    1. 取标准25 mm回形针，去除小弯部分，形成一个拉长的U形结构。
    2. 使用镊子或持针器，将U形弯折部分的直径减小至约2 mm，同时保持两端平行。
    3. 从弯折处起约8–10 mm位置，将两端向外弯曲约90°。根据需要进行调整，使其能够平放。

2. 窗口植入

注意：所有外科手术和动物护理程序均遵循欧洲共同体理事会指令，并经法国国家动物研究委员会批准（许可编号：13,300）。

  1. 用麻醉剂（氯胺酮/赛拉嗪；诱导剂量：120 mg/kg，12 mg/kg；补充剂量：40 mg/kg，4 mg/kg）麻醉小鼠，并在眼睛上涂抹眼膏。
  2. 剃除小鼠背部约2 cm宽、5 cm长的毛发，区域以胸椎隆起为中心，然后用碘皂清洁暴露的皮肤，再用碘溶液处理。用90%乙醇喷洒手套进行清洁。 
  3. 使用组织剪沿T11至L1椎骨（约2 cm）纵向切开背部皮肤。使用手术刀在T11至L1节段的棘突与横突之间做双侧纵向切口。 注意：若手套或器械接触动物毛发或皮肤，应使用90%乙醇或Germ-X等冷消毒剂重新清洁手套或器械。
  4. 将小鼠固定于脊柱叉式立体定位仪中——首先将右上方脊柱叉夹紧固定。用Adson镊夹住T11，将T11横突置于固定的脊柱叉上。在保持椎骨位置的同时，将对侧脊柱叉固定于对侧横突下方。
  5. 参照步骤2.4的方法，将L1置于脊柱叉中。
  6. 使用手术刀（23号），轻轻刮除T11至L1节段棘突与横突之间的肌肉，使椎板清晰可见。为更好地观察T11的椎弓根，可切断从横突尖端向前突出的肌腱。
  7. 用PBS冲洗改造后的金属钉，然后将金属钉尖端插入T11和L1椎弓根外侧，调整两尖端间距，使其轻轻接触椎弓根。
    注意：仅使用含地塞米松（0.1%）、青霉素（1,000 U/ml）和链霉素（1 mg/ml）的PBS，以减少术后炎症并提高观察窗的透明度。
  8. 在每个金属钉插入点滴加少量氰基丙烯酸酯胶水固定金属钉，然后将小鼠从脊柱叉上取下。
  9. 在椎骨暴露区域周围的皮肤切缘和暴露肌肉上涂抹一层薄薄的氰基丙烯酸酯胶水，注意不要将椎骨粘住。弯曲改造后的回形针末端，使其插入植入金属钉的突出部分下方，并与分离出的脊柱长轴平行放置，保持该位置不变。
  10. 从皮肤-肌肉交界处开始，逐层涂抹牙科水泥，覆盖整个开口区域，仅暴露椎骨，并确保回形针牢固嵌入牙科水泥中。
  11. 待牙科水泥固化（5–15分钟）后，通过植入的回形针暴露部分将小鼠连接至“夹持器”。使用镊子清除暴露椎骨的棘突与椎板之间的肌肉及其他软组织。
    注意：任何能够牢固夹持回形针暴露部分而不对夹具或腔室造成应力，并可在手术过程中灵活调整小鼠方向的装置，均可作为“夹持器”使用。
  12. 使用骨切除钻头双侧磨薄T12和T13的椎板。去除背侧骨质时，用钝头镊夹住棘突并轻轻提起，注意避免对脊髓施加向下的压力。若骨质不易分离，继续磨薄椎板直至棘突可轻松移除。
  13. 继续使用骨切除钻头修整椎骨的侧缘，形成观察窗的支撑结构。用钝头镊小心清除所有接触硬脊膜的小骨碎片。务必使用PBS保持硬脊膜的湿润。
  14. 选择一个略宽于椎板切除开口的预制观察窗，测试其在暴露骨面上的贴合情况。理想情况下，观察窗应双侧稳定地架在两个椎骨上，且其中部轻触硬脊膜（图 1a）。即使将观察窗向脊髓方向轻压，也不应压迫脊髓。若观察窗不平衡或悬于硬脊膜上方，请重复步骤2.13。
  15. 完成满意的椎板切除后，将一小片浸有PBS的高压灭菌滤纸置于脊髓上，防止硬脊膜干燥，然后将小鼠暂置一旁。
  16. 清洁观察窗——将观察窗浸入清洁液中数秒。用显微镜镜头纸擦拭干燥。在手术显微镜下确认观察窗是否清洁，若不洁净则重复清洁步骤。将清洁后的观察窗放置于洁净且易于快速取用的位置，以便在步骤2.19中迅速安装。
  17. 取回小鼠并移除滤纸。用钝头镊轻轻清除硬脊膜上的任何碎屑，让硬脊膜干燥至微粘状态。
  18. 迅速填满硅胶（Kwik-sil）混合管，并在干净载玻片上挤出硅胶，直至尖端不再有气泡冒出。立即在暴露的脊髓中线上施加一小滴硅胶。
  19. 用钝头镊取回清洁后的观察窗，立即覆盖在硅胶上。用钝头镊对观察窗施加轻微压力，使硅胶扩散至观察窗边缘，并保持该位置约1分钟。
    注意：硅胶在混合前必须储存在27 °C以下，否则固化时间会显著延长，且无法良好粘附于观察窗或硬脊膜，导致光学清晰度下降。
  20. 缓慢释放对观察窗的压力。若观察窗未移动，则立即进入步骤2.21。若压力释放后观察窗上浮（即 椎骨发生移动），则在持续施压固定观察窗的同时进行步骤2.21。
  21. 在观察窗的头端和尾端涂抹氰基丙烯酸酯胶水。若胶水未完全覆盖观察窗的头端和尾端边缘，可用牙签引导液体胶水覆盖这些边缘。随后，沿观察窗的侧缘引导胶水（图 1a），覆盖周围所有肌肉组织。注意：氰基丙烯酸酯应覆盖观察窗外缘表面。胶水过多会影响光学清晰度，过少则会导致硅胶与观察窗之间产生气泡。
  22. 为保护氰基丙烯酸酯并增强腔室结构强度，在所有涂有氰基丙烯酸酯的区域涂抹牙科水泥（图1a）。与使用氰基丙烯酸酯类似，从头端和尾端边缘开始，用细木棒引导牙科水泥沿观察窗边缘涂布。

3. 术后护理、EAE 诱导及窗口维护

  1. 在骨盆区域皮下注射地塞米松（0.2 mg/kg）和瑞马唑（Rimadyl，5 mg/kg）。将小鼠转移至带有垫料的温暖笼子（约26 °C）中。在麻醉作用完全消退后（通常为2–3小时），小鼠应能完全活动，能够在笼内自由探索并进行理毛行为。术后前1–2天应单独饲养，并确保其能方便地获取食物和饮水。 一旦小鼠开始从麻醉中恢复，应皮下注射布托啡诺（buprenorphine，0.05 mg/kg）。在完全恢复麻醉后，小鼠应无任何疼痛表现。 注意：若小鼠完全恢复麻醉后仍出现疼痛或异常运动行为，表明窗口植入不正确。
  2. 术后前10天内，每2天注射一次地塞米松（0.2 mg/kg）和瑞马唑（Rimadyl，5 mg/kg）（图 1a）。对植入窗口的小鼠进行注射时，先在诱导室中使用异氟烷进行轻度镇静（空气中异氟烷浓度约1.75%，持续1–2分钟）。将小鼠从诱导室中取出后立即注射药物。小鼠应在<1分钟内完全清醒。
    注意：切勿抓握植入窗口小鼠的颈背部皮肤，以免导致皮肤与植入物分离。 也可在不使用镇静的情况下通过腹腔注射（i.p.）给药，方法是让小鼠前肢抓住笼盖，轻轻抬起其后肢。然而，在此姿势下，小鼠有时会挣脱，从而对植入的窗口造成应力，可能导致窗口与脊髓之间出血，进而影响光学清晰度。
  3. 在停止抗炎治疗后2–3周（即术后约3–4周）可诱导EAE模型。按照步骤3.2所述方法对小鼠进行轻度镇静。将小鼠从诱导室中取出后，通过覆盖于鼻部的异氟烷面罩维持镇静状态。
  4. 将MOG35-55肽（75 µg溶于含800 µg结核分枝杆菌的弗氏佐剂中）注射至三个不同的皮下部位（股骨两侧及尾根部），并腹腔注射百日咳毒素（400 ng）14,15。
    注意：与仅植入窗口的小鼠相比，EAE小鼠需要额外护理。应每日称重，并始终确保其能方便获取食物和饮水。补充含有3%琼脂糖的凝胶以维持动物的水合状态和体重。还可向凝胶中添加葡萄糖（1–3%）以提供额外热量。
  5. 在EAE诱导后第2天，重复步骤3.2所述的镇静方案，并再次腹腔注射百日咳毒素（400 ng）。
  6. 为进行脊髓成像，首先按照步骤3.2所述方法对动物进行镇静，然后通过腹腔注射氯胺酮/赛拉嗪（ketamine/xylazine，100 mg/kg；10 mg/kg）进行轻度麻醉。此方案可支持约1小时的成像时间。
  7. 对于持续时间<2小时的成像实验，可通过每45–60分钟追加一次氯胺酮/赛拉嗪（50 mg/kg；5 mg/kg）来维持轻度麻醉。对于更长时间的成像实验，可使用异氟烷（0.75–1.25%异氟烷通入湿化空气中）持续镇静。
    注意：可在手术显微镜下清洁窗口，用组织纸角或棉签轻轻擦拭表面碎屑即可。切勿使用酒精清洁窗口，因其可能降解某些类型的牙科水泥，并可能导致脊髓冷却。
  8. 在轻度麻醉后，通过植入的回形针外露部分将小鼠牢固固定于夹持器上（图 1b）。
  9. 通过调节夹持器内夹子的位置、夹持器本身的位置以及载物台的位置，使脊髓与物镜垂直对齐。快速成像脊髓背侧区域，并利用背侧血管结构确定脊髓的方向。

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结果

结合慢性植入的玻璃窗、活体双光子显微镜和EAE模型，可能是研究自身免疫性脱髓鞘疾病病理背后细胞机制的有力工具。采用我们的植入方法发现，大多数玻璃窗在诱导EAE时保持透明，并在整个EAE病程中持续清晰（图1c）。通过该方法，我们发现玻璃窗在整个植入后时期均保持透明（平均约68天±7标准误；n = 21只小鼠），在我们的操作中，可在EAE诱导前或后每36天内重复进行多达12次的双光子成像。

为了初步验证该方法的可行性，我们比较了植入窗口与未植入窗口动物的EAE临床进展（图1d）。我们发现，EAE小鼠的临床症状 onset 略有延迟（图1e），但在症状出现后，总体疾病进展或峰值临床评分均无显著差异（图1f）。

实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是一种以髓鞘和轴突丢失为特征的进行性神经退行性疾病。因此，我们通过植入的窗口利用活体双光子显微镜，观察了EAE病程中脊髓轴突变性的时程变化。与先前的研究结果相...

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讨论

我们描述了一种在成年小鼠暴露的脊髓上植入并维持玻璃窗的方法，以随时间动态观察实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的进展过程。类似的玻璃窗植入技术已被用于研究脊髓损伤模型13 ，也可能适用于研究其他脊髓病理状态，如胶质母细胞瘤 、脑膜炎，或正常脊髓的细胞生理学。在本方法中，通过在四个牢固固定的椎骨周围构建一个外骨骼来实现椎体稳定，同时将玻璃窗锚定于该外骨骼上。在这些实验中，玻璃窗植入位置位于T13-L1椎体水平。在一些初步实验中，我们也尝试了更靠头侧和尾侧的植入位置，但这些位置玻璃窗稳定性的系统评估仍有待完成。通过使用一层透明硅胶将硬脊膜粘附于玻璃窗上，可减少椎管内脊髓组织的移动。这种结合水泥、胶水和硅胶的方法因此提供了独特的可调节性，能够在每个动物的腔室各个接触点实现严密的密封。通过避免气泡产生和粘附失效，我们不仅最大限度地减少了组织移动，也抑制了可能阻碍荧光成像的纤维化组织形成。结果表明，使用该方法可成功通过植入的玻璃窗进行平均近10周的成像，而其他技术在仅五周时的成功率仅为50%16。

硅胶与硬脊膜之间和/或脊髓内部...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

感谢 C. Ricard、M-C. Amoureux、A. Jaouen 和 S. Meijia-Gervacio 的有益讨论；感谢 M. Hocine 和 C. Meunier 以及 IBDML 动物实验中心和 PicSIL 成像平台工作人员提供的技术支持。本研究得到了法国国家科学研究中心（CNRS）的机构资助，以及多发性硬化研究协会（ARSEP）（资助对象：G.R. 和 K.K.F.）、法国国家科研署（ANR JCJC）、脑科学研究联合会（FRC）和脊髓研究研究所（IRME）（资助对象：F.D.）的项目资助。K.K.F. 获得多发性硬化研究协会（ARSEP）博士后奖学金支持。成像实验在 IBDML 的 PIcSIL 成像平台完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
骨去除钻头World Precision InstrumentsIDEAL MICRO-DRILL亦由 Harvard Apparatus 销售。
任何高质量的外科骨钻均可使用。
钻头（#1/4 或 1/2 碳化钨圆钻头）World Precision Instruments501860 (#1/4)
501860 (#1/2)		亦由 Harvard Apparatus 销售
订书钉Lyreco5.002.567钉帽 = 8 mm
钉腿 = 4 mm
回形针任意标准 25 mm 回形针
持针器Fine Science Tools12003-15
组织剪Fine Science Tools14028-10
Adson 镊子Fine Science Tools11027-121 × 2 齿
钝头镊子Fine Science Tools11293-00
脊柱叉Harvard Apparatus724813
牙科水泥GACD12-565 & 12-568
硅胶弹性体World Precision InstrumentsKWIK-SIL亦可通过 Coherent Scientific 和 Fisher Scientific 购得
氰基丙烯酸酯胶Eleco-EFDCyanolit 201
显微镜Zeiss7MP我们的显微镜为直立式配置，配备 5 个 NDD 探测器。
物镜ZeissW Plan-Apochromat 20x/1.0 DIC M27 75mm工作距离 = 1.8 mm

参考文献

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