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芯片上应激诱导的抗生素敏感性测试

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DOI：

10.3791/50828

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2014年1月8日

 ,  ,  ,  , 
1Fraunhofer USA Center for Manufacturing Innovation, 2Division of Infectious Diseases, Department of Medicine, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Mechanical Engineering, Boston University, 4Department of Biomedical Engineering, Boston University

本文内容

摘要

我们开发了一种用于快速抗生素药敏试验的微流控平台。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在压力和抗生素存在的情况下，敏感菌株的细菌会迅速死亡。然而，耐药细菌则能够在这些应激条件下存活。

摘要

我们开发了一种在应激环境下用于抗生素敏感性检测的快速微流控方法。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在应激和抗生素同时存在的情况下，敏感菌株会迅速死亡，而耐药菌株则能在这些应激条件下存活。该方法背后的假设是全新的：抗生素作用靶点相关的生化通路在应激激活后，可加速抗生素敏感性检测过程。与传统的抗生素敏感性检测方法相比，该方法在抗生素作用期间省略了限速步骤—— 细菌生长—— 。该方法的技术实现结合了标准技术与创新手段。标准部分包括细菌培养方案、在聚二甲基硅氧烷 (PDMS)中构建微流控通道、利用荧光监测细胞活力，以及通过批量图像处理进行细菌计数。创新部分则包括利用培养基流动施加机械应激、使用酶类对细菌造成损伤但不致其死亡，以及采用微阵列基底实现细菌附着。所开发的平台可用于抗生素及非抗生素类药物的研发与测试。与传统的细菌悬浮实验相比，该方法可在精确控制的时间段内反复开启和关闭药物作用，从而在同一个实验过程中对同一细菌群体进行重复观察。

引言

细菌耐药性的上升加剧了对快速基于表型的抗生素敏感性检测的需求，以保护我们的最后一道防线药物。标准的敏感性检测依赖于在抗生素存在下细菌生长抑制的情况，通常需要多个（8-24）小时才能完成。我们开发了一种基于微流控平台的新型抗生素敏感性检测方法，该方法利用生物合成途径的应激激活来加速抗生素的作用。

微流控尺度的抗生素敏感性测试具有高效利用样本的优势，因其仅需少量细菌。此外，微流控装置可实现多重化，以便在多种条件下同时检测多个样本1,2最近，已有多种用于抗生素药敏试验的微流控方法被报道3-9在这些方法中，细菌在纳升和皮升级别的液滴内生长3,7微流控通道的整个体积中4-6,8，或作为单个细菌在电学上定位于通道底部表面9尽管这些检测在微流控通道中进行，但它们均通过监测微生物在有无抗生素条件下的生长情况来评估，与传统方法类似。生长情况的测量通过以下方式获取 通过 光密度、pH敏感性染料，或明场/相差或荧光图像。尽管其中一些检测方法比传统方法更快，但它们均属于被动检测抗生素耐药性。换句话说，这些方法仍需要用户等待细菌生长作为最终的读数结果。

相比之下，我们开发了一种方法，利用剪切力与酶解应激的组合来激活对抗生素敏感的生化通路10。通过抗生素对处于应激状态的细菌进行挑战，可实现更快速的敏感性检测。对抗生素耐药的细菌能够耐受这些应激条件，而敏感细菌则会因复合应激而迅速死亡。通过显微镜结合荧光死细胞染料，在一小时后测定的细菌死亡百分比，可确定其表型（耐药性与敏感性）。

要成功实施本方法，必须将细菌固定在微流控通道的底面。通过这种方式，可对细菌施加多种应力，并在同一平面上通过显微镜同时进行成像观察。细菌固定采用经过涂层处理的显微镜玻片。该玻片由制造商预先包被了环氧基团，用于非特异性蛋白结合。这些环氧基团与细菌表面蛋白发生非特异性结合，从而通过共价作用将细菌固定在玻片表面。

在无抗生素（对照）和有抗生素（实验）的条件下，对菌株进行相同的测试环境（剪切力+酶解压力）处理。每两分钟自动拍摄一次每个通道的相差显微镜和荧光显微镜图像，持续一小时。通过比较实验通道与对照通道中死亡细菌的百分比，确定耐药性判定结果。一小时后，若样本的细胞死亡率大于1%，则判定为敏感；若死亡率小于0.5%，则提示具有耐药性。介于这两个阈值之间的百分比结果视为不确定，需重新检测该样本。

微流控通道由聚二甲基硅氧烷（PDMS）定义，PDMS 是微流控装置的首选材料11。PDMS 在较宽的波长范围内具有光学透明性，且具备生物相容性、化学惰性、气体可渗透性以及对液体的低渗透性；因此非常适合用于这些实验。

通过室温培养基在固定化的细菌表面流动产生机械/剪切应力。（注意：将培养基预热至 37 °C 对检测结果无显著影响。）自动注射泵将培养基（含死细胞染料 +/- 抗生素，以及可选的酶促应激剂）以 1 ml/min 的流速泵入微流控通道（200 µm x 400 µm），从而产生 6.25 kPa 的剪切力或 6,000 sec-1 的剪切速率。该速率等于或超过先前对Staphylococci研究中所施加的剪切应力。

选择溶葡球菌酶（lysostaphin）进行初步实验，是因为该酶可直接破坏Staphylococcus的细胞壁。溶葡球菌酶的浓度（0.7 ng/ml）足以引起细菌细胞壁损伤，但在实验时间范围内，若无抗生素存在，则不足以导致细菌细胞死亡。溶葡球菌酶对于正确判定细菌敏感性并非必需，但可增强实验结果，导致敏感菌株的细胞死亡增加。相比之下，剪切应力对检测功能至关重要。当甲氧西林敏感的Staphylococcus aureus菌株在无流动条件下用溶葡球菌酶和苯唑西林处理时，在整个实验过程中未记录到细胞死亡现象。

细胞活力通过荧光死细胞染料进行监测12。染料的选择基于其仅能特异性染色受损细胞、对活细胞无毒性以及背景荧光低等特性，因此可直接加入细胞培养基中，无需额外步骤。选择0.25 µM的荧光染料浓度，是为了在1.6秒的荧光激发光照射时间内获得可接受的信号水平。

在我们的初步研究中使用了β-内酰胺类抗生素苯唑西林。S. aureus（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，MRSA）对苯唑西林具有耐药性，在实验时间范围内不会表现出明显的细胞死亡。50 µg/ml 的浓度是在初步研究中确定的。较低的抗生素浓度导致耐药株与敏感株之间的区分度降低，而较高的浓度则不会对实验结果产生明显差异。

我们此前已报道了一种成功开发的检测方法，该方法结合了直接影响细菌细胞壁的机械和酶解压力13 ，以及一种抑制细胞壁生物合成的抗生素14,15。这些原理验证实验是在一系列耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和甲氧西林敏感型金黄色葡萄球菌（S. aureus，MSSA）菌株上进行的。然而，通过选择合适的实验参数，该方法应可适用于多种细菌物种及多种类型的抗生素。

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方案

1. 制备PDMS层（图1）

  1. 按10:1的比例充分混合PDMS和固化剂。为去除气泡，将粘稠的混合物在室温下置于真空箱中脱气1小时。
  2. 在天平上，将PDMS缓慢倒入铝制模具中。从中心开始倾倒，并保持模具水平。确保销钉部分不被覆盖。达到目标重量后即停止倾倒。
    我们的模具需要4 g PDMS和0.4 g固化剂。
  3. 将模具放入烘箱中调平，于37 °C下过夜固化。
    也可选择在60 °C下固化2小时，或在90 °C下固化1小时。
  4. 沿模具边缘切开固化的PDMS层，并用镊子小心地从模具表面剥离。用70%乙醇和棉签清洁模具表面。

2. 根据图2组装流路池

PDMS与载玻片的标准组装通常通过氧气等离子体处理两个表面来实现，以确保PDMS与显微镜载玻片之间无泄漏的键合。在本方案中，等离子体处理会破坏载玻片上的化学涂层。因此，载玻片采用压力密封而非等离子体处理。

  1. 将玻璃窗放入流动池的插槽中。
  2. 将涂覆过的载玻片活性面向上置于流动池插槽内的玻璃窗上，再将带有微通道的PDMS层通道面向下放置于其上。放置PDMS片时，应使通道入口与金属板上的通孔对齐。轻轻挤压以排出各层之间的空气。
  3. 翻转PDMS/载玻片组件，使PDMS面朝向玻璃窗，并将PDMS通道入口与金属板上的通孔对齐。
  4. 将压力板置于顶部并拧紧螺丝。
  5. 将组装好的流动池置于显微镜下，将显微镜放大倍数设为60倍，并预先对准通道位置。

3. 准备对数生长期细菌

  1. 实验前一天：取一细菌菌落接种于50 ml含2% NaCl的Mueller Hinton肉汤（MH2）中，于37 °C、250 rpm条件下振荡培养过夜。
    在本实验设置中，一次实验可同时研究一种或两种细菌菌株。
  2. 实验前：将50 µl过夜培养的细菌菌液加入50 ml MH2培养基中，于37 °C、250 rpm条件下振荡培养3小时，以确保细菌处于对数生长期。

4. 实验溶液组分使用前至少预热10分钟

  1. 在室温下解冻荧光染料（5 mM 储液）和溶葡球菌酶（10 µg/ml 储液）。
  2. 将苯唑西林粉末 warming 至室温。

5. 准备并加载细菌悬液

  1. 3小时亚培养结束后：取10 ml细菌培养液，于1,650 x g离心2分钟。
  2. 移除上清液，并将细菌重悬于 1 ml 新鲜 MH2 培养基中。
  3. 将一段短管连接到1 ml鲁尔锁式注射器上。用1 ml培养基冲洗注射器和管路。在管路中保留少量培养基，以避免吸取细菌悬液时产生气泡。
  4. 将0.7 ml细菌类型1加入注射器中。用细菌类型1填充流式细胞仪的两个通道。观察液体是否出现在通道另一侧 ca. 150 µl.
    随着细菌填充通道，其透明度发生变化。
  5. 若同时实验多种细菌，将细菌类型2的加样步骤重复用于流式细胞仪中剩余的两个通道。
  6. 将流动池放入孵育箱内 37 °C 孵育45分钟，以使细菌沉降并附着于载玻片表面。

6. 准备并加载实验溶液

  1. 通过将14 µl荧光染料原液（5 mM）与126 µl MH2培养基混合，配制140 µl的0.5 mM荧光染料溶液。
  2. 将10 mg苯唑西林溶于40 ml MH2培养基中，得到终浓度为250 µg/ml的苯唑西林溶液。
  3. 配制130 ml对照溶液，终浓度为0.25 µM荧光染料和0.7 ng/ml溶葡萄球菌素。具体操作为：将65 µl荧光染料溶液（0.5 mM）、9.12 µl溶葡萄球菌素原液（10 µg/ml）与130 ml MH2培养基混合。
  4. 配制130 ml抗生素溶液，终浓度为0.25 µM荧光染料、0.7 ng/ml溶葡萄球菌素和50 µg/ml苯唑西林。具体操作为：将65 µl荧光染料溶液（0.5 mM）、9.12 µl溶葡萄球菌素原液（10 µg/ml）、26 ml苯唑西林溶液（250 µg/ml）与104 ml MH2培养基混合。
  5. 用对照溶液填充两个60 ml注射器，另用抗生素溶液填充两个60 ml注射器。将溶液用铝箔包裹，避免光照导致试剂降解。
    注射器应过量填充，以补偿管道冲洗过程中的液体损耗。
  6. 轻弹注射器以去除气泡。将进样管连接至注射器出口，并用实验溶液充满管道。
  7. 将注射器安装至泵上。先安装体积最小的注射器，并固定其推杆位置。再依次安装其余注射器，必要时挤压推杆以确保密合。
  8. 将泵的流速设为1 ml/min，泵送体积设为60 ml。启动泵进行冲洗，直至所有注射器均流出稳定的液流。

7. 在显微镜下设置流动池

  1. 从离心机中取出流动池，并将其安装到显微镜载物台上（图3）。
  2. 将输入/输出管路连接到每个流动池通道（每个通道各有一个输入和一个输出）。
    将输出液分别收集到四个不同的容器中，以便测量各个通道的输出体积。

8. 运行60分钟实验

  1. 检查步骤 2.5 中的预对准位置。如果显微镜视野未居中于通道和/或处于失焦状态，请调整设置并保存新的位置。
    由于加载的细菌密度较高，可能在流动开始前无法实现精确对焦。
  2. 将相差图像的采集时间设置为 10 msec，荧光图像的采集时间设置为 1,600 msec。
  3. 在启动流动之前，获取每个位置的相差和荧光图像。
    这可对加载的细菌密度进行定性评估。
  4. 启动液体流动，并立即检查显微镜是否聚焦在通道底部。
  5. 在流动开始后的第一分钟内，获取目标区域的相差和荧光图像。
  6. 在获取第一组图像后，每隔 2 分钟采集一次图像，直至流动持续 60 分钟。根据需要重新对焦。

9. 对流动池进行消毒

  1. 在烧杯中配制10%的漂白剂溶液（100 ml）。用该混合液填充4个20 ml注射器，每个注射器装入10 ml。去除注射器中的气泡，并将其连接至流动池。
    通道内的细菌将在约1–2分钟内被清除。
  2. 将泵的流速设为1 ml/min，泵体积设为3 ml。运行3分钟。
  3. 用去离子水填充4个60 ml注射器，每个注射器装入60 ml。去除注射器中的气泡，并将其连接至流动池。
  4. 将泵的流速设为1 ml/min，泵体积设为30 ml。运行30分钟。
  5. 在显微镜下监测通道的清洗情况。
  6. 拆卸流动池。丢弃已使用的环氧树脂载玻片。将流动池组件浸泡在去离子水中20分钟，然后自然晾干。

10. 分析图像并生成数据

  1. 统计每张图像中的细菌数量。
    使用开源软件 CellProfiler 进行批量图像处理16。CellProfiler 操作流程的高级概述见表1。相位对比图像中检测到的细菌数量（Np）代表总细菌数。荧光图像中可见的细菌数量（Nf）代表死亡细菌数。
  2. 计算随时间变化的归一化细菌细胞死亡百分比。
    1. 将单个图像的 Nf 和 Np 导入数据分析软件。
    2. 计算在特定时间点（t = T）每个通道中死亡细菌所占比例，即 (Nf / Np) 的比值。
    3. 从实验组和对照组各时间点的数据中减去实验开始时（t = 1 min）已存在的死亡细菌比例。
    4. 在每个时间点，使用以下公式从实验通道的死亡细菌比例中减去对照通道的死亡细菌比例：

      细菌细胞死亡分析示意图；抗生素存在与缺失；荧光计数。

    5. 绘制整个实验过程中 DPnorm 随时间 t 的变化曲线。
      注意：若样品的细胞死亡率大于1%，则判定为敏感；若死亡率小于0.5%，则提示具有耐药性。介于这两个阈值之间的结果视为不确定，需重新检测该样品。
    6. 使用电子表格汇总并分析不同实验的结果。

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结果

所呈现的数据 图4 显示易感性的反应 金黄色葡萄球菌 aureus 在含抗生素的微流控通道中随时间推移的菌株变化。显示了实验开始1分钟及1小时实验结束时采集的相差图像 图4A 和 B分析的1小时数据如图所示 图 4C 细菌以红色突出显示（共5,828个）。相应的荧光图像如下所示 图4D 和 E1小时的分析数据如图所示 图4F 红色突出显示发出荧光的细菌（174个已死亡）。

这组图像说明了几个要点。最重要的是，实验结束时观察到发出荧光的细菌数量显著增加（比较图4D和E中1分钟和60分钟时明亮荧光点的数量），表明微通道内发生了细胞死亡。这些结果提示该菌株为敏感菌株。

另一个需要注意的重要问题是上...

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讨论

所展示的方案已在一系列实验中进行了验证和优化，实验涉及甲氧西林敏感和甲氧西林耐药 Staphylococcus aureus 菌株10. 因此，本方案在未经修改的情况下应可直接适用于其他菌株 S. aureus 以及其他作用机制为影响细菌细胞壁生物合成的抗生素。除以下细菌类型外 S. aureus 可能需要调整应力参数：可溶性（酶解性）应力和机械应力。如果希望在测试除……以外的细菌种类时使用可溶性应激因子 金黄色葡萄球菌， 需要另一种应激试剂，因为溶葡球菌酶是一种葡萄球菌来源的-特异性酶。

剪切应力的大小与液体的流速成正比，与通道尺寸成反比，因此原则上可在较大范围内调节。实际达到的应力值受到以下实验因素的限制：固定化基底在较高流速下固定细菌的能力、微流控装置在高压下不发生泄漏的耐受性、系统内部的液体流动阻力，后者可能导致流速不稳定，甚至在较低流速时完全阻断流动。当前的结合强度足以满足金黄色葡萄球菌（S. aureus）的实验需求，但若提高流速或...

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披露

微流控方法正在申请专利： Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, 发明人；细菌抗生素耐药性/敏感性的快速检测方法及装置，专利号 PCT/US10/33523。

致谢

我们感谢弗劳恩霍夫制造创新中心的工程师和学生们。感谢安德烈亚斯·普林岑、霍尔格·维尔茨、道格·福斯、大卫·查金以及舒苏东博士在实验系统的设计、加工和自动化方面提供的帮助。感谢朱莉娅·库查茨、梅兰妮·齐默尔曼、尼科·克雷茨马尔、蒂姆·甘贝尔、乔希·维拉纽瓦、岛津美诺里以及卡塔日娜·库里加在实验方案测试和数据收集方面提供的协助。我们感谢哈佛大学和麻省理工学院布罗德研究所影像平台的安妮·E·卡彭特博士和马克-安东尼·布雷博士，他们在使用CellProfiler开发图像分析流程方面提供了帮助。本项目部分得到了美国国家过敏与传染病研究所资助项目R21AI079474和1R01AI101446的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家过敏与传染病研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。该项目还得到了美国弗劳恩霍夫协会的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
SYTOX GreenInvitrogen CorporationS7020死细胞荧光染料
牛血清白蛋白（BSA）Sigma Aldrich, IncA9418-5G用于溶葡萄球菌酶的储存
乙酸钠Sigma Aldrich, IncS8750-500G用于溶葡萄球菌酶的储存
溶葡萄球菌酶 Cell SciencesCRL309A以1 mg固体形式送达。储存方法：溶于20 mM乙酸钠溶液中，再与BSA溶液混合，最终浓度为1% BSA和100 µg/ml  溶葡萄球菌酶 
氯唑西林钠盐Sigma Aldrich, Inc28221-1G抗生素
穆勒-欣顿肉汤（Mueller Hinton Broth）Fisher ScientificDF0757-17-6
氯化钠Sigma AldrixhS3014-500G在高压灭菌前加入至穆勒-欣顿肉汤中，终浓度为2%
1 ml，鲁尔锁扣注射器 BD (Beckton, Dickinson and Comp.)14-823-2F
2 oz，鲁尔锁扣注射器BD (Beckton, Dickinson and Comp.)309653 - 60 mL过量填充至约65 ml
显微镜
倒置荧光显微镜 Olympus IX-70Cambridge Scientific9349
60倍，荧光/相差物镜Olympus Corp.LCPlan F1 60x/0.70 Ph2
Retiga 12位单色CCD相机QImagingRET-4000R-F-M-12-C
显微镜自动化系统
相差/荧光快门控制器PRIOR ScientificH204/H202
X/Y 载物台 PRIOR ScientificH107AENN
聚焦电机PRIOR ScientificH122
用于XYZ控制的操纵杆PRIOR ScientificCS152EF
Proscan 控制器PRIOR ScientificH3-XY2
图像采集软件Fraunhofer CMI
流动池组件与PDMS
流动池BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI3333-1044工程图纸由Fraunhofer CMI设计
玻璃窗口Fraunhofer CMI3333-1054玻璃窗口由Fraunhofer CMI按适当尺寸切割
BOROFLOAT 窗口 50 mm x 50 mmEdmund Optics Inc.NT48-543
密封板BU Scientific Instruments Facility3333-1045
环氧涂层载玻片Arrayit CorporationSuperEpoxy 2
PDMS模具Fraunhofer CMI3333-1053使用UPM-0005（超精密飞刀切削机）在铝或黄铜上加工而成
PDMS载片设计Fraunhofer CMI3333-1053
管路
螺母，超无法兰Tinytight，无头，1/16英寸，PEEK材质，绿色 IDEX Health ScienceM-644-03流动池的输入/输出端口为此卡套设计攻丝
卡套，Tinytight，1/16英寸，6-40，.030英寸管厚，PEEK材质带不锈钢锁环，黑色IDEX Health ScienceM-657
螺母，超无法兰Tinytight，无头，1/16-1/32英寸，1/4-28，PEEK材质，本色IDEX Health ScienceP-255
卡套，超无法兰，1/16英寸，Tefzel (ETFE)材质，黄色IDEX Health ScienceP-259适配鲁尔锁扣接头
管路，Teflon FEP材质，.030英寸 x 1/16英寸 x 20英尺，绿色 IDEX Health Science1520G
接头，快接式母鲁尔接母1/4-28，PEEK材质，红色 IDEX Health ScienceP-658

参考文献

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PDMS

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