我们开发了一种用于快速抗生素药敏试验的微流控平台。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在压力和抗生素存在的情况下，敏感菌株的细菌会迅速死亡。然而，耐药细菌则能够在这些应激条件下存活。
我们开发了一种用于快速抗生素药敏试验的微流控平台。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在压力和抗生素存在的情况下，敏感菌株的细菌会迅速死亡。然而，耐药细菌则能够在这些应激条件下存活。
我们开发了一种在应激环境下用于抗生素敏感性检测的快速微流控方法。液体以高速流过固定在微流控通道底部的细菌。在应激和抗生素同时存在的情况下，敏感菌株会迅速死亡，而耐药菌株则能在这些应激条件下存活。该方法背后的假设是全新的：抗生素作用靶点相关的生化通路在应激激活后，可加速抗生素敏感性检测过程。与传统的抗生素敏感性检测方法相比，该方法在抗生素作用期间省略了限速步骤—— 细菌生长—— 。该方法的技术实现结合了标准技术与创新手段。标准部分包括细菌培养方案、在聚二甲基硅氧烷 (PDMS)中构建微流控通道、利用荧光监测细胞活力，以及通过批量图像处理进行细菌计数。创新部分则包括利用培养基流动施加机械应激、使用酶类对细菌造成损伤但不致其死亡，以及采用微阵列基底实现细菌附着。所开发的平台可用于抗生素及非抗生素类药物的研发与测试。与传统的细菌悬浮实验相比，该方法可在精确控制的时间段内反复开启和关闭药物作用，从而在同一个实验过程中对同一细菌群体进行重复观察。
细菌耐药性的上升加剧了对快速基于表型的抗生素敏感性检测的需求，以保护我们的最后一道防线药物。标准的敏感性检测依赖于在抗生素存在下细菌生长抑制的情况，通常需要多个（8-24）小时才能完成。我们开发了一种基于微流控平台的新型抗生素敏感性检测方法，该方法利用生物合成途径的应激激活来加速抗生素的作用。
微流控尺度的抗生素敏感性测试具有高效利用样本的优势，因其仅需少量细菌。此外，微流控装置可实现多重化，以便在多种条件下同时检测多个样本1,2最近，已有多种用于抗生素药敏试验的微流控方法被报道3-9在这些方法中，细菌在纳升和皮升级别的液滴内生长3,7微流控通道的整个体积中4-6,8，或作为单个细菌在电学上定位于通道底部表面9尽管这些检测在微流控通道中进行，但它们均通过监测微生物在有无抗生素条件下的生长情况来评估，与传统方法类似。生长情况的测量通过以下方式获取 通过 光密度、pH敏感性染料，或明场/相差或荧光图像。尽管其中一些检测方法比传统方法更快，但它们均属于被动检测抗生素耐药性。换句话说，这些方法仍需要用户等待细菌生长作为最终的读数结果。
相比之下，我们开发了一种方法，利用剪切力与酶解应激的组合来激活对抗生素敏感的生化通路10。通过抗生素对处于应激状态的细菌进行挑战，可实现更快速的敏感....
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1. 制备PDMS层（图1）
2. 根据图2组装流路池
PDMS与载玻片的标准组装通常通过氧气等离子体处理两个表面来实现，以确保PDMS与显微镜载玻片之间无泄漏的键合。在本方案中，等离子体处理会破坏载玻片上的化学涂层。因此，载玻片采用压力密封而非等离子体处理。
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所呈现的数据 图4 显示易感性的反应 金黄色葡萄球菌 aureus 在含抗生素的微流控通道中随时间推移的菌株变化。显示了实验开始1分钟及1小时实验结束时采集的相差图像 图4A 和 B分析的1小时数据如图所示 图 4C 细菌以红色突出显示（共5,828个）。相应的荧光图像如下所示 图4D 和 E1小时的分析数据如图所示 图4F 红色突出显示发出荧光的细菌（174个已死亡）。
这组图像说明了几个要点。最重要的是，实验结束时观察到发出荧光的细菌数量显著增加（比较图4D和E中1分钟和60分钟时明亮荧光点的数量），表明微通道内发生了细胞死亡。这些结果提示该菌株为敏感菌株。
另一个需要注意的重要问题是上.......
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所展示的方案已在一系列实验中进行了验证和优化，实验涉及甲氧西林敏感和甲氧西林耐药 Staphylococcus aureus 菌株10. 因此，本方案在未经修改的情况下应可直接适用于其他菌株 S. aureus 以及其他作用机制为影响细菌细胞壁生物合成的抗生素。除以下细菌类型外 S. aureus 可能需要调整应力参数：可溶性（酶解性）应力和机械应力。如果希望在测试除……以外的细菌种类时使用可溶性应激因子 金黄色葡萄球菌， 需要另一种应激试剂，因为溶葡球菌酶是一种葡萄球菌来源的-特异性酶。
剪切应力的大小与液体的流速成正比，与通道尺寸成反比，因此原则上可在较大范围内调节。实际达到的应力值受到以下实验因素的限制：固定化基底在较高流速下固定细菌的能力、微流控装置在高压下不发生泄漏的耐受性、系统内部的液体流动阻力，后者可能导致流速不稳定，甚至在较低流速时完全阻断流动。当前的结合强度足以满足金黄色葡萄球菌（S. aureus）的实验需求，但若提高流速或.......
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微流控方法正在申请专利： Sauer-Budge A, Sharon A, Kalashnikov M, Wirz H, 发明人；细菌抗生素耐药性/敏感性的快速检测方法及装置，专利号 PCT/US10/33523。
我们感谢弗劳恩霍夫制造创新中心的工程师和学生们。感谢安德烈亚斯·普林岑、霍尔格·维尔茨、道格·福斯、大卫·查金以及舒苏东博士在实验系统的设计、加工和自动化方面提供的帮助。感谢朱莉娅·库查茨、梅兰妮·齐默尔曼、尼科·克雷茨马尔、蒂姆·甘贝尔、乔希·维拉纽瓦、岛津美诺里以及卡塔日娜·库里加在实验方案测试和数据收集方面提供的协助。我们感谢哈佛大学和麻省理工学院布罗德研究所影像平台的安妮·E·卡彭特博士和马克-安东尼·布雷博士，他们在使用CellProfiler开发图像分析流程方面提供了帮助。本项目部分得到了美国国家过敏与传染病研究所资助项目R21AI079474和1R01AI101446的支持。本内容仅由作者负责，不一定代表美国国家过敏与传染病研究所或美国国立卫生研究院的官方观点。该项目还得到了美国弗劳恩霍夫协会的支持。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| SYTOX Green | Invitrogen Corporation | S7020 | 死细胞荧光染料 |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma Aldrich, Inc | A9418-5G | 用于溶葡萄球菌酶的储存 |
| 乙酸钠 | Sigma Aldrich, Inc | S8750-500G | 用于溶葡萄球菌酶的储存 |
| 溶葡萄球菌酶 | Cell Sciences | CRL309A | 以1 mg固体形式送达。储存方法：溶于20 mM乙酸钠溶液中，再与BSA溶液混合，最终浓度为1% BSA和100 µg/ml 溶葡萄球菌酶 |
| 氯唑西林钠盐 | Sigma Aldrich, Inc | 28221-1G | 抗生素 |
| 穆勒-欣顿肉汤（Mueller Hinton Broth） | Fisher Scientific | DF0757-17-6 | |
| 氯化钠 | Sigma Aldrixh | S3014-500G | 在高压灭菌前加入至穆勒-欣顿肉汤中，终浓度为2% |
| 1 ml，鲁尔锁扣注射器 | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 14-823-2F | |
| 2 oz，鲁尔锁扣注射器 | BD (Beckton, Dickinson and Comp.) | 309653 - 60 mL | 过量填充至约65 ml |
| 显微镜 | |||
| 倒置荧光显微镜 Olympus IX-70 | Cambridge Scientific | 9349 | |
| 60倍，荧光/相差物镜 | Olympus Corp. | LCPlan F1 60x/0.70 Ph2 | |
| Retiga 12位单色CCD相机 | QImaging | RET-4000R-F-M-12-C | |
| 显微镜自动化系统 | |||
| 相差/荧光快门控制器 | PRIOR Scientific | H204/H202 | |
| X/Y 载物台 | PRIOR Scientific | H107AENN | |
| 聚焦电机 | PRIOR Scientific | H122 | |
| 用于XYZ控制的操纵杆 | PRIOR Scientific | CS152EF | |
| Proscan 控制器 | PRIOR Scientific | H3-XY2 | |
| 图像采集软件 | Fraunhofer CMI | ||
| 流动池组件与PDMS | |||
| 流动池 | BU Scientific Instruments Facility/Fraunhofer CMI | 3333-1044 | 工程图纸由Fraunhofer CMI设计 |
| 玻璃窗口 | Fraunhofer CMI | 3333-1054 | 玻璃窗口由Fraunhofer CMI按适当尺寸切割 |
| BOROFLOAT 窗口 50 mm x 50 mm | Edmund Optics Inc. | NT48-543 | |
| 密封板 | BU Scientific Instruments Facility | 3333-1045 | |
| 环氧涂层载玻片 | Arrayit Corporation | SuperEpoxy 2 | |
| PDMS模具 | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | 使用UPM-0005（超精密飞刀切削机）在铝或黄铜上加工而成 |
| PDMS载片设计 | Fraunhofer CMI | 3333-1053 | |
| 管路 | |||
| 螺母，超无法兰Tinytight，无头，1/16英寸，PEEK材质，绿色 | IDEX Health Science | M-644-03 | 流动池的输入/输出端口为此卡套设计攻丝 |
| 卡套，Tinytight，1/16英寸，6-40，.030英寸管厚，PEEK材质带不锈钢锁环，黑色 | IDEX Health Science | M-657 | |
| 螺母，超无法兰Tinytight，无头，1/16-1/32英寸，1/4-28，PEEK材质，本色 | IDEX Health Science | P-255 | |
| 卡套，超无法兰，1/16英寸，Tefzel (ETFE)材质，黄色 | IDEX Health Science | P-259 | 适配鲁尔锁扣接头 |
| 管路，Teflon FEP材质，.030英寸 x 1/16英寸 x 20英尺，绿色 | IDEX Health Science | 1520G | |
| 接头，快接式母鲁尔接母1/4-28，PEEK材质，红色 | IDEX Health Science | P-658 |
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