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非复制型犬腺病毒2型载体的制备与纯化

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DOI：

10.3791/50833

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2013年12月3日

 ,  ,  , 
1INSERM UMR 1043, CNRS UMR 5282, Université Toulouse 3, 2UMR Viroligie, INRA ENVA ANSES

本文内容

摘要

近15年来，犬腺病毒2型（CAV2）衍生载体已证实具有高效转导细胞的能力 体外 和 体内 并广泛用于疫苗接种和基因治疗。本文描述了一种构建、生产和纯化CAV2载体的方法，可获得高滴度的病毒悬液。

摘要

腺病毒（Ad）来源的载体已被广泛用于短期或长期的基因转移，适用于基因治疗和疫苗开发。由于人体内常存在针对经典的人腺病毒5型的预存免疫，犬腺病毒2型（CAV2）被提出作为人类基因转移的替代载体。CAV2具有明确的生物学特性，并易于进行遗传操作，因此具有显著优势，尤其适用于向中枢神经系统进行基因转移，或诱导从体液免疫到细胞免疫的广泛保护性免疫反应。如今，CAV2已成为最有吸引力的非人腺病毒之一，可用作疫苗载体。本实验方案描述了一种构建、生产和滴定重组CAV2载体的简便方法。首先将目的基因的表达盒克隆至穿梭质粒中，然后通过同源重组在大肠杆菌BJ5183菌株（E. coli BJ5183）中获得重组基因组质粒。将所得的基因组质粒转染至表达互补CAV2-E1基因的犬肾细胞（DK-E1）中。通过病毒扩增可产生大量病毒原液，再经氯化铯梯度超速离心纯化，并通过透析脱盐。最终获得的病毒悬液通常滴度超过每毫升1010个感染性颗粒，可直接用于体内给药（in vivo）。

引言

数十年来，腺病毒（Ads）来源的载体已在基因治疗、疫苗接种以及溶瘤病毒治疗1中证明了其有效性。Ads 是无包膜的二十面体病毒，属于Adenoviridae科，已从哺乳动物、鸟类、爬行动物、两栖动物和鱼类中分离获得。自1953年被发现以来，Ads 被广泛用作研究病毒/细胞相互作用的模型，近年来更被用作基于载体的基因递送系统2。事实上，基于 Ads 的载体具有多种优势，例如广泛的宿主范围、明确的生物学特性，以及易于进行遗传操作和大规模扩增的特点。

为克服人群中针对源自人腺病毒（human Ads）载体的预存免疫所导致的临床难题 3，我们及其他研究者开始从非人类腺病毒中衍生出载体 4此外，非人源腺病毒载体似乎比传统使用的5型腺病毒（Ad5）更适用于兽医学中的大规模疫苗接种，因为它们在国家监管机构进行风险评估时更符合安全与安保要求。在20世纪90年代后期，我们首次描述了重组犬腺病毒2型（CAV2）作为一种非人源的Ad5衍生载体替代方案。 5自那时以来，大量研究已证实CAV2载体在治疗性或抗原性基因转移方面的潜力（详见综述 6,7）。与其他腺病毒（Ads）类似，CAV2来源的载体具有稳定性，且可高滴度生产，这有利于其 体内 使用。它们还具有安全性，因为不具备整合性，尽管能够实现持久的外源基因表达 体内 (>1年） 8值得注意的是，与人类腺病毒血清型相比，CAV2 载体表现出高度的嗜神经性，并能在轴突中实现高效的逆向转运。 9,10这一固有特性促使人们提出利用重组CAV2载体转导特定脑区神经元的想法，而这些脑区迄今为止难以通过常用于中枢神经系统基因转移的慢病毒载体实现有效转导。 11.

在此，我们描述一种简单且经典的方案，用于构建、生产和纯化来源于曼哈顿株的非复制型犬腺病毒2型（CAV2）载体。通过将目的基因（GOI）克隆至巨细胞病毒（CMV）早期启动子下游的表达盒中，构建重组CAV2基因组，该启动子可驱动目的基因的泛表达。CAV2载体具有约4.2 kbp的克隆容量，能够表达较大的cDNA片段。在第二步中，该表达盒通过同源重组取代CAV2基因组中的E1区，从而获得非复制型病毒（dlE1），该方法最初由Chartier等人描述。 等.12 最后，将基因组质粒转染至表达CAV2-E1的犬肾细胞系（DK-E1）中以产生病毒颗粒，随后对病毒进行连续扩增，并在浓缩和纯化前进行收获。本文所述方法采用两步法氯化铯（CsCl）梯度超速离心，可有效富集具有高终末滴度（通常超过10）的感染性病毒颗粒10 每毫升感染性颗粒数）。随后通过一次性 Sephadex G-25 柱层析对病毒悬液进行脱盐，使其最终纯度足以直接使用 体内

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方案

1. 非复制型 CAV2 基因组质粒的构建

注意：本方案中描述的所有质粒此前已有报道7 ，可应要求提供。

  1. 使用适当的限制性内切酶将目的基因（GOI）克隆至pShuttle质粒中，构建pShuttle-GOI质粒（图1A).
  2. 用限制性内切酶消化2 μg pShuttle-GOI AscI/PacI消化反应将Shuttle-GOI片段（约2.9 kbp + GOI ORF序列）从质粒骨架（2.8 kbp）上释放出来。
  3. 使用 NucleoSpin Gel 和 PCR Clean-up 试剂盒对琼脂糖凝胶电泳后的 Shuttle-GOI 片段进行纯化。
  4. 同时，用限制性内切酶消化1 μg pCAV2基因组质粒 SwaIpCAV2 质粒包含一个独特的 SwaI 位于E1区域内的位点（图1B). 在65 °C下加热20分钟以灭活该限制性内切酶。
  5. 转化感受态细胞 大肠杆菌 BJ5183 细菌中加入 500 ng 纯化的 Shuttle-GOI 片段和 100 ng 线性化的 pCAV2 质粒，用于同源重组（F图1B在LB-Amp平板上涂布，于37 °C培养至少20小时。
  6. 使用EmeraldAmp预混液，针对菌落直接进行PCR分析，引物序列如下：上游引物（5'-CACGAGGCCCTTTCGTCTTCAA-3'），下游引物（5'-GCGGTAGTTTATCACAGTTAAATTGC-3'）。扩增程序为：95 °C预变性10 min（1个循环）；随后进行39个循环：95 °C变性1 min，58 °C退火1 min，72 °C延伸1 min/kbp；最后72 °C终延伸5 min。pCAV-GOI阳性克隆可扩增出大小为1 kbp加上目的基因开放阅读框（GOI ORF）序列的产物，而阴性克隆则无PCR产物。
  7. 在37 °C、220 rpm摇床条件下，将至少两个阳性菌落分别接种于5 ml LB-amp培养基中，过夜培养。
  8. 使用 Nucleospin 质粒试剂盒提取质粒 DNA。将感受态细胞转化 E. coli 将每份DNA样品分别加入DH5α菌中，将菌液涂布于LB-氨苄平板，37 °C过夜培养。
  9. 将每个阳性克隆的两个菌落分别接种于3 ml LB-amp培养基中，37 °C摇床（220 rpm）过夜培养。使用Nucleospin质粒提取试剂盒提取质粒DNA。
  10. 将获得的DNA与亲本pCAV2质粒（作为对照）用 NdeI亲本pCAV2的酶切图谱为14.8 kbp、9 kbp、7.9 kbp和1.6 kbp。目的基因表达盒插入于7.9 kbp片段内，并包含至少一个 NdeI 位点， 即 一个位于盒式结构中，另一个位于目的基因（GOI）中存在的潜在位点。
  11. 选择阳性克隆，并至少取2个独立克隆进入步骤2。

2. 将重组CAV2基因组质粒转染至DK-E1细胞

注意：源自CAV2的非复制型载体属于被归类为生物安全等级2级（BSL-2）的基因改造生物，而其在动物模型上的使用则被归类为BSL-1。请采取适当的 containment 措施和废弃物处理措施，包括使用个人防护装备，并在BSL-2级超净工作台内操作。

  1. 转染前一天，将DK-E1细胞接种于6孔板中。在37 °C、5% CO2条件下，使用含高糖的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM），并添加7%热灭活胎牛血清（FCS）、1 mM丙酮酸钠以及100 U/ml青霉素/100 μg/ml链霉素进行细胞培养。转染时细胞融合度应达到70–80%。
  2. 用AscI酶切2 μg pCAV-GOI质粒，以释放质粒中的非病毒序列。通过0.8%琼脂糖凝胶电泳检测酶切后的限制性酶切图谱。酶切应产生一个约31 kbp的片段（包含重组基因组）和一个2 kbp的片段（对应质粒骨架）。
  3. 将酶切后的DNA与200 μl Jet Prime缓冲液混合，涡旋振荡10秒。加入4 μl Jet Prime试剂，再次涡旋振荡10秒。短暂离心以去除管壁液滴，并在室温下孵育10分钟。
  4. 将转染混合物逐滴加入细胞中。轻轻摇动培养板使液体均匀分布，随后在37 °C下孵育。

3. 重组CAV2的扩增

  1. 转染后一周，收集细胞及培养基至15 ml聚丙烯管中。通过三次冻融循环（-80 °C/37 °C）裂解细胞，并在1,800 × g离心10分钟以澄清裂解物。
  2. 收集上清液，于-20 °C保存，用于后续病毒扩增。
  3. 用0.5 ml含病毒的上清液感染6孔板中一个孔内生长至80–90%汇合度的DK-E1细胞单层。在37 °C轻柔振荡条件下孵育1小时。移除接种物，更换为1.5 ml含5%热灭活胎牛血清的完全DMEM培养基。
  4. 将细胞在37 °C继续孵育3–4天。应每日观察细胞是否出现细胞病变效应（CPE，图2A-B）。若未见明显CPE，则在培养4天后收获细胞，并重复步骤3.1–3.4。
  5. 当大多数细胞出现明显CPE时（通常经过2–4轮病毒扩增后），连同培养基一起收集细胞，按上述方法进行三次冻融循环。每次使用0.5 ml含病毒的上清液，感染三个10 cm直径培养皿中生长至80–90%汇合度的DK-E1细胞。
  6. 3–4天后（当CPE完全时），从这些10 cm培养皿中收获细胞，再次通过三次冻融循环裂解细胞，在1,800 × g离心10分钟以澄清裂解物，收集上清液并储存于-20 °C，用于大规模CAV2扩增。

4. CAV2 大规模纯化

  1. 在40个直径10 cm的培养皿中，接种生长至80-90%汇合度的DK-E1细胞单层。每个培养皿使用0.1 ml含病毒的上清液，用1 ml不含FCS的完全DMEM稀释后进行感染。在37 °C、轻度振荡条件下孵育3至4小时。随后加入5 ml含5% FCS的完全DMEM。
  2. 继续孵育3天。将40个10 cm培养皿中的感染细胞收集至50 ml聚丙烯管中。在4 °C条件下，以1,200 × g离心10分钟沉淀细胞，并用15 ml DMEM培养基重悬细胞。
  3. 通过三次冻融循环（-80 °C/37 °C）裂解细胞。在1,800 × g离心10分钟以去除细胞碎片，将上清液收集后于-20 °C保存，用于后续病毒颗粒的纯化。
  4. 在14 ml Ultra-Clear离心管中制备不连续CsCl梯度。首先，在管底加入2 ml CsCl溶液（1.40 g/ml 溶于磷酸盐缓冲液）。然后，缓慢地将2 ml CsCl溶液（1.25 g/ml 溶于磷酸盐缓冲液）加在第一层溶液之上。
  5. 小心地将病毒上清液加至CsCl梯度顶部。用矿物油填充离心管至距管顶2-3 mm处。在SW40摆动转子中，于130,000 × g、18 °C条件下离心1.5小时。
  6. 离心后，在两层CsCl溶液的界面处可清晰观察到两条白色条带（图2C）。使用21 G针头和注射器，通过侧壁穿刺收集下层含有成熟CAV2颗粒的条带。应尽可能避免收集上层条带，因其对应的是空病毒颗粒。
  7. 在14 ml透明离心管中，通过将收集的病毒颗粒与CsCl溶液（1.34 g/ml 溶于磷酸盐缓冲液）混合，制备连续CsCl梯度。用矿物油填充离心管至距管顶2-3 mm处。在SW40摆动转子中，于130,000 × g、18 °C条件下离心18小时。
  8. 离心后，如上所述，用注射器通过侧壁穿刺收集含有白色CAV2的条带。同样应尽量避免收集残留的上层条带。在连续梯度中，两条带分离更充分，因此操作应更为容易。收集的悬浮液体总体积不应超过2 ml。
  9. 用30 ml PBS平衡Sephadex G-25 PD-10层析柱。
  10. 上样病毒悬浮液，并弃去穿流液。
  11. 用500 μl PBS分步洗脱。收集第5至第7管洗脱液，这些通常含有去盐的CAV2颗粒。含病毒的洗脱液因呈乳白色而易于识别。向1.5 ml CAV2悬浮液中加入150 μl甘油，分装后于-80 °C保存。

5. 通过终点稀释法滴定 CAV2

  1. 将纯化的病毒分装样品置于冰上解冻，并用无血清DMEM进行10倍系列稀释（稀释范围为10-2-10-12）。
  2. 将每种病毒稀释液各50 μl加入96孔板的5个孔中，每孔接种1.5 × 104个DK-E1细胞。将培养板置于37 °C、5% CO2条件下培养5天。
  3. 感染后第5天，通过显微镜观察细胞病变效应（CPE）的出现情况（图2A-B）。采用Reed和Muench统计法13计算半数组织培养感染剂量（TCID50）以确定病毒感染滴度。

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结果

重组CAV2载体的制备依赖于基础但重要的分子生物学技术。在制备病毒载体之前，必须首先构建携带目的基因表达盒的重组CAV2基因组。该构建过程包括两个步骤：首先，将目的基因（GOI）克隆至穿梭质粒中形成表达盒（i.e. 包含启动子和多聚腺苷酸化信号）。该功能元件两侧分别连接来源于CAV2基因组的上游和下游同源重组区域序列（图1A）。第二步，通过同源重组将表达盒从穿梭质粒插入至CAV2基因组中（图1B）。对两种DNA组分进行线性化处理可提高该步骤的成功率（参见pShuttle上的AscI和PacI酶切位点以及pCAV2上的SwaI酶切位点，如图1所示）。目的基因表达盒的插入将导致重组基因组中E1区的缺失。

获得重组基因组质粒后，使用可互补CAV2-E1的DK-E1细胞来产生病毒颗粒。由于感染细胞中产生了大量病毒颗粒，可通过明场显微镜观察到明显的细胞病变效应（图2A），或通过报告基因表...

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讨论

本文所述的简便方法源自已有充分文献记录的Ad5技术，可高效地生产非复制型CAV2载体，其典型的克隆容量约为4.2 kbp。在时间方面，通常需要两周时间构建重组CAV2基因组，随后还需额外五周时间进行病毒悬液的扩增、纯化及滴度测定。

尽管首批CAV2衍生载体的制备看似耗时，但需注意的是，CAV2的生产仅需最初转染6孔板中的一个孔，从而最大限度地降低了质粒制备、转染试剂的成本， 等等此外，一旦获得第一批病毒颗粒，即可通过简单感染DK-E1互补细胞系进行扩增。本文提出了一种基于超速离心的犬腺病毒2型（CAV2）颗粒纯化方法，该技术在许多实验室中均常见。然而，也有文献报道使用层析法纯化CAV2病毒颗粒14大多数纯化的CAV2病毒悬液的感染性滴度高于1010 TCID50/毫升。病毒颗粒也可通过定量实时荧光定量PCR进行滴定15CAV2 制剂在含 10% 甘油（体积比）的溶液中于 -80 °C 保存时可稳定数年，因此可直接使用这些载体进行给药 体内，前提是使用至少两倍的...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作获得了法国国家健康与医学研究院（INSERM）、法国国家科学研究中心（CNRS）、法国医学研究基金会以及法国国家科研署（ANR-10-Blanc-1322）向 D.G-D 提供的资助；B.K. 获得了欧盟第七框架计划的资助；M.S. 获得了法国医学研究基金会（FRM）博士后奖学金的支持（项目"Equipe FRM 2009"）；C.B. 在欧盟资助协议号 245266（Orbivac）下获得了博士后奖学金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
限制性内切酶New England BiolabsVarious
Jet Prime 转染试剂盒Polyplus114-01
DMEMGibco (Life Technologies)10567014
E. coli BJ5183 细菌Agilent200154
PD-10 脱盐柱GE Healthcare17-0851-01
EmeraldAmp 聚合酶TakaraRR320A
Nucleospin 质粒提取试剂盒Macherey-Nagel740558.250
NucleoSpin 凝胶回收与 PCR 产物纯化试剂盒Macherey-Nagel740609.50
14 ml 管，Ultra ClearBeckman344060

参考文献

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