本文介绍了如何通过单细胞显微注射 Lucifer Yellow 来观察活细胞中经由间隙连接的细胞间通讯，并提供了一些实用技巧。我们期望本文能够帮助研究人员评估功能性间隙连接所介导的细胞耦合程度。文中所述方法原则上可适用于其他分子量低于 1,000 道尔顿的荧光染料。
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本文内容
摘要
摘要
间隙连接是细胞间的通道，允许相邻细胞之间进行通讯。这种通讯依赖于每个相邻细胞各自贡献一个半通道来形成间隙连接。在哺乳动物细胞中，半通道由六个连接蛋白（connexin）组成，每个连接蛋白单体含有四个跨膜结构域，其C端和N端均位于胞质内。间隙连接允许离子、第二信使以及小分子代谢物的交换。此外，它们在多种生理过程中的细胞通讯中发挥重要作用，例如突触传递、心脏收缩、细胞生长和分化。本文详细介绍了如何对单个细胞进行 Lucifer Yellow 的显微注射，以在活细胞中可视化通过间隙连接的细胞间通讯。在功能正常的间隙连接中，染料将从被注射的细胞扩散至与其相连的细胞。该技术非常适用于研究间隙连接，因为可以实时观察荧光的扩散情况。我们讨论了如何准备细胞和微移液管，如何使用显微操作器，以及如何向一种上皮细胞系中注射低分子量的荧光染料。
引言
间隙连接是细胞间的通道，允许相邻细胞之间进行相互通讯1。这种通讯连接两个或多个相邻细胞，每个细胞各贡献一个连接子（connexon）或半通道，共同形成细胞间通道。在哺乳动物细胞中，连接子由六个连接蛋白（connexin）单体组成，每个单体具有四个跨膜结构域，其C端和N端均位于胞质内2。间隙连接不仅允许离子、第二信使和小分子代谢物的流通，还在多种生理过程中参与多种形式的细胞通讯，例如突触传递、心脏收缩、细胞生长和分化3,4,5,6,7,8。此外，间隙连接还与多种疾病相关，包括癌症9,10、肌肉萎缩11、某些遗传性疾病以及脱髓鞘疾病12。
这种细胞间串扰可通过多种方法进行评估13,14,15,16。本文中，我们展示了如何通过单细胞显微注射 Lucifer Yellow，以在活细胞中可视化缝隙连接介导的细胞间通讯。我们讨论了细胞和微移液管的制备方法、显微操作仪的使用，以及在胸腺上皮细胞系中注射 Lucifer Yellow 染料的步骤。通常，该实验可通过统计与染料加载细胞相连的细胞平均数量来进行分析。此外，该方法也可用于其他分子量低于缝隙连接通透性阈值（约 1,000 道尔顿）的荧光染料。
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方案
1. 细胞准备
- 在培养箱（37°C/5% CO2）中培养胸腺上皮细胞系（IT76M1）或待测细胞。
- 用1× PBS洗涤细胞（重复此步骤3次）。
- 向细胞中加入胰蛋白酶，作用5分钟。
- 向含胰蛋白酶的细胞中加入含10%胎牛血清（FBS）的培养基（体积为步骤1.3中所加胰蛋白酶体积的两倍），然后离心（800 × g，5分钟）。
- 用血细胞计数板对细胞进行计数。
- 根据细胞类型调整细胞密度，确保细胞之间紧密接触，以利于细胞偶联。注意：在本实验中，我们每35 mm培养皿使用3 × 105个细胞。
2. 微量移液器准备
- 按照指定方法将玻璃毛细管微量移液器（直径1.5 mm）拉制成末端直径为0.2 µm的微电极，使其最终电阻约为30 MΩ17,18。
注意：也可直接购买注射用微电极。电阻值取决于细胞大小，例如，胰腺腺泡细胞需要更高电阻的微电极（100–150 MΩ）19。可能出现的一个常见问题是 Lucifer Yellow 溶液发生沉淀，从而堵塞微电极，因此可能需要预先进行过滤或离心处理。在注射前，应在显微镜下检查微电极，以确认是否存在堵塞或其他类型的破损13。可通过将微电极尖端置于生理盐水中并注入LY来测试其是否通畅。
3. 测试微量移液器
- 在 150 mmol/L LiCI 中配制 5% 的 Lucifer Yellow 溶液，并使用注射器或反向填充法将该溶液注入微量移液管中。
- 将微量移液管置于含有 IT76M1 细胞的 35 mm 培养皿上方的显微注射工作站上，将玻璃微量移液管的尖端浸入细胞培养基中。聚焦于微量移液管，并通过施加脉冲进行染料流动测试。
4. 单细胞 Lucifer Yellow 微注射
- 使用高倍镜（40X）将显微镜聚焦于细胞层正上方，然后利用显微操作器缓慢将移液管下降至细胞表面。
- 当移液管尖端接近并接触细胞膜时穿刺目标细胞，并施加一个微小的超极化脉冲，以将LY注入细胞内。所施加的电压取决于待注射染料的净电荷。 此外，也可使用其他染料进行该技术操作，如表1所示。
注意：原则上，任何分子量小于1 KDa的亲水性染料均可使用。然而，染料的转移速率可能因其分子量和亲水性而异。此外，必须评估所用染料是否存在非特异性转移。 - 染料注射后3分钟采集细胞图像，或使用延时显微镜（30帧/秒）拍摄一段短片。
注意：类似方法可参见Hitomi等（2015）20。为避免通过细胞间桥（未完全分裂）发生的通讯，建议共注射罗丹明标记的葡聚糖（2–10 KDa），该染料不能通过间隙连接，但可经由细胞间桥及某些类型的纳米管传递，如图2所示。
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结果
胸腺上皮细胞系 IT-76MI 被用于评估缝隙连接介导的染料偶联，因为已有文献描述该细胞表达由连接蛋白 43（connexin 43）构成的功能性缝隙连接21。图1显示了将 Lucifer Yellow 注入位于移液管尖端下方的一个细胞时的情况。数分钟后，与之相连的细胞出现荧光（星号标记），表明荧光染料通过缝隙连接发生了扩散。出现荧光的细胞数量及所需时间与这些细胞间的通讯程度直接相关。图2展示了在胸腺上皮细胞中注入 LY 的结果，其中插图（插图 d）显示了 LY 与罗丹明葡聚糖（Rhodamine Dextran，10KDa）的共注射。如预期所示，LY 可转移至相邻细胞，而由于分子量较高，罗丹明葡聚糖则不能通过。此外，当存在缝隙连接阻断剂（插图 f）辛醇（octanol）时，染料向周围细胞的传递被抑制。此外，也可用于评估特定细胞的偶联程度，或某种药物对缝隙连接功能的影响。图3A 显示了在有或无地塞米松存在下对胸腺上皮细胞（TEC）进行 LY 注射的结果。共注射了100个细胞，在地塞米松存在条...
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讨论
为了验证功能性细胞间缝隙连接的存在，需要使用不能透过细胞膜但可经由细胞间通道透过的示踪剂16。荧光素是首个用于观察细胞间偶联的荧光染料22，但它可透过非连接区域的膜结构3，因此已被荧光黄染料所取代15。目前，在多种不同类型的荧光示踪剂中选择最合适的一种，需根据实验的具体目的和条件而定。通过荧光染料对细胞进行负载的实验步骤，可用于评估单个细胞的形态、功能以及细胞间物质转移的动力学速率。此外，染料显微注射有助于更深入理解细胞间缝隙连接的生理作用21,23，因为细胞间通讯的程度与偶联细胞的数量密切相关。
成功获取显微注射数据需要考虑多个关键因素。必须维持细胞正常的稳态和完整性，因此需要在短时间内（<1 秒）完成染料注射，并具备熟练的显微注射技术。要获得更高分辨率的成像结果，关...
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致谢
作者们将本文献给吉尔贝托·奥利维拉-卡斯特罗教授，以纪念他在巴西开创了间隙连接介导的细胞间通讯研究。本研究由卡佩斯基金会、国家科学技术发展委员会和法佩基基金会资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 荧光黄 | Sigma | L0259 | |
| 氯化锂 | Sigma | L4408 | |
| PBS 片剂 | Sigma | P4417 | |
| RPMI 培养基 | Sigma | R4130 | |
| 胎牛血清 | Cultilab | ||
| 胰蛋白酶 | Sigma | T4799 | |
| 防震台 | Newport | VH3036W-OPT | 需要使用防震台以保护实验免受振动影响，避免细胞损伤 |
| 显微操作器 | Narishige | MMO-203 | 该设备可对微移液管进行精确调节，是细胞显微注射所必需的 |
| 电流发生器 | Digitimer | DS2 | 为使染料通过微移液管，可使用内置电极的电流发生器、具有电容补偿电路的放大器（旧式电位计）或新型膜片钳放大器的电流注入功能，在微移液管内施加低于一纳安的电流，同时将接地导线浸入培养皿中。或者，也可按照厂家推荐方法使用气动显微注射仪进行染料注射。 |
参考文献
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