Cell的传播分析单细胞显微注射

Summary

在这里，我们将介绍如何执行路西法黄色的单细胞显微注射可视化在活细胞通过缝隙连接处蜂窝通信，并提供一些有用的提示。我们希望本文可以帮助大家来评估细胞耦合程度由于功能间隙连接。这里所描述的一切可能的，在原则上，适合于与低于1,000道尔顿分子量其它荧光染料。

Abstract

间隙连接是允许相邻细胞进行通信的细胞间通道。这种通信取决于每个相邻单元对形成间隙连接的贡献。在哺乳动物细胞中，半通道由六个连接蛋白形成，这些连接蛋白是具有四个跨膜结构域的单体以及细胞质内的 C 和 N 末端。间隙连接允许离子、第二信使和小代谢物的交换。此外，它们在突触传递、心脏收缩、细胞生长和分化等生理过程中的许多形式的细胞通讯中也起着重要作用。我们详细介绍了如何进行 Lucifer Yellow 的单细胞显微注射，以可视化通过活细胞中间隙连接的细胞通讯。预计在功能性间隙连接中，染料将从负载细胞扩散到连接的细胞。这是研究间隙结的一种非常有用的技术，因为您可以实时评估荧光的扩散。我们讨论了如何制备细胞和微量移液器，如何使用显微作器并在上皮细胞系中注射低分子量荧光染料。

Introduction

间隙连接是细胞间的通道，使相邻小区间¹的互通。该通信连接的两个或更多个相邻小区，其中，每一个与一个连接子或半通道有助于形成细胞间通道。在哺乳动物细胞中，所述连接子由六个连接蛋白，单体与细胞质²内4个跨膜结构域和C和N末端形成。间隙连接不仅允许离子，第二信使和小的代谢物的流动，同时也有助于在许多生理过程许多形式的蜂窝通信，诸如突触传递，心脏收缩，细胞生长和分化^{3，4，5，6， 7，8。}除了间隙连接已与相关联许多疾病，包括癌症^9，10，肌萎缩^11，某些遗传性疾病和脱髓鞘疾病^12。

这种类型的细胞间的串扰可以通过多种方法

Protocol

1.细胞的制备

1. 保持胸腺上皮细胞系（IT76M1）或细胞的培养，以在培养箱进行测试（37℃/ 5％CO _2）。
2. 用PBS洗涤1X细胞（重复此项目3倍）。
3. 添加胰蛋白酶到细胞5分钟。
4. 添加培养基（两次胰蛋白酶的项1.3添加的量的）有10％FBS（胎牛血清）与胰蛋白酶和离心机（800×g离心5分钟）的细胞。
5. 算在血球细胞。
6. 根据细胞类型的细胞具有在彼此紧密接触，以允许耦合调节细胞的密度。注：在我们的例子中，我们使用，有35毫米的培养皿3×10 ^5个细胞。

2，微管的制备

1. 如从玻璃毛细管微量（直径为1.5mm）至最终为0.2μm直径的规定拉出微量以便达到大约30兆欧的最终电阻F“> ^17,18。
   注：另外，注射吸管就可以买到。的电阻依赖于细胞大小，例如更高的电阻微小电极将是必要的胰腺腺泡细胞，例如^{（100-150MΩ）19。}可能出现的一个共同问题是萤光黄溶液然后可以妨碍微管，并且可能需要先过滤或离心沉淀。注射前，将微管应该在显微镜下进行分析，以检测是否存在障碍物或任何类型的中断^13。微量可以通过用生理盐水溶液内的....

Results

胸腺上皮细胞系IT-76MI用于通过缝隙连接来评估染料耦合，因为这些细胞被描述来表达连接蛋白43 ²¹形成功能性缝隙连接。图1示出了当在吸液管的尖端下方的一个小区施加萤光黄的注入。几分钟后，连接的电池变成指示荧光染料通过间隙连接的扩散荧光（星号）。细胞和时间成为荧光的数量直接与这些细胞中的蜂窝通信的程度相关联。 图2示出LY的胸腺上皮细胞的注射和插入件（插入d）示LY和罗丹明葡聚糖（10KDa）的共注射。如预期的那样LY传递到相邻小区，尽管若丹明葡聚糖不其分子量高，因为。此外，GJ阻塞的存在（插入f）中，辛醇，一个BLOcked染料到周围细胞的通过。另外，可以评估一个特定的细胞或药物对GJ的功能的影响的耦合度。图3A示出LY的了TEC细胞有或无地塞米松的注入。然后100细胞注射，在地塞米松存在下和1或2个细胞进行通信的百分率是相对于无药物对照相似。然而相比，控制时3或4个细胞进行通信的数量较高。五个或6个细胞和7或8细胞与地塞米松存在下GJ通信中的控制，没有观察到，因此表明塞米松增加耦合了T.......

Discussion

为了验证功能间的间隙连接的情况下，使用示踪剂，这是膜不可渗透的，尽管由间通道可渗透需要^16。荧光素，所述第一荧光染料来观察细胞至细胞耦合^22，是非交界膜³之间可渗透并因此被荧光黄染料¹⁵取代的。目前，要找到许多不同类型的荧光示踪剂之间的最佳选择取决于范围和实验条件。用荧光染料小区负载的过程允许形态学的评价中，单个细胞的功能和细胞之间转移的动力学速率。此外，染料显微注射可以更好地了解细胞^21，23之间的间隙连接的生理作用，因为C的程度ellular通信与耦合单元的数量有关。

几个关键因素是成功获取显微注射的数据是至关重要的。正常细胞稳态和完整性必须保持，因而一个短的喷射时间（<1秒）染料并用显微注射技术专长的是必要的。在得到一个更好的分辨率的拍摄图像的关键因素是有一个冷却的.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
路西法黄	Sigma	L0259
氯化锂	Sigma	L4408
PBS 片	Sigma	P4417
RPMI	Sigma	R4130
牛胎血清	Cultilab
胰蛋白酶	Sigma	T4799
隔振台	Newport	VH3036W-OPT	需要一个隔振台来保护实验免受振动并避免细胞损伤
显微作器	Narishige	MMO-203	该设备允许精确调整微量移液器，这是细胞显微注射所需的。
电流发生器	Digitimer	DS2	为了产生流经微量移液器的染料流，使用微量移液器内部带有电极的电流发生器或具有电容补偿电路（旧静电计）或新膜片钳放大器的电流注入功能的放大器，以及浸入板皿中的接地线。或者，可以按照工厂的建议通过气动显微注射器注射染料。