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体内 通过过表达山中因子将成体体细胞重编程为多能性

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DOI：

10.3791/50837

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2013年12月17日

 ,  ,  , 
1Nanomedicine Lab, UCL School of Pharmacy, University College London, 2Nanomedicine Lab, Faculty of Medical & Human Sciences, University of Manchester

本文内容

摘要

本研究展示了体细胞向多能性的重编程 体内 不会形成畸胎瘤。我们采用水动力尾静脉注射编码山中因子的质粒DNA来诱导 体内 成年肝细胞重编程为多能性增强的细胞

摘要

通过强制表达特定因子将体细胞重编程为多能状态而获得的诱导性多能干细胞（iPS细胞）为再生医学提供了新的机遇。然而，iPS细胞的临床应用迄今仍受到限制，主要原因是现有重编程方法的效率较低，以及移植后生成的iPS细胞具有形成肿瘤的风险。

我们假设，体细胞向多能性的重编程可以实现 体内 通过重编程因子的基因转移。为了高效地重编程细胞 体内，需要在靶组织中表达高水平的山中（OKSM）转录因子。根据靶组织的不同，可通过使用不同的病毒或非病毒基因载体来实现这一目标。在本项研究中，采用经尾静脉水动力注射质粒DNA的方法将OKSM因子递送至小鼠肝细胞。该方法提供了概念验证证据 体内 成体体细胞向多能状态的重编程具有高效率和快速动力学特征，且未观察到肿瘤或畸胎瘤的形成 原位

可以得出结论，重编程体细胞 体内 与现有方法相比，可能提供一种快速、高效且安全地诱导增强型多能性的潜在途径 体外 执行的实验方案，未来可应用于不同类型的组织。

引言

关于胚胎干细胞使用的伦理问题一直是干细胞研究发展中的限制因素之一。然而，山中伸弥及其同事发现，强制表达四种转录因子（即：Oct3/4、Klf4、Sox2、c-Myc（OKSM））可导致 体外 体细胞重编程为多能细胞，即诱导性多能干细胞（iPS细胞），已开辟了新的研究机遇。病毒1-5 和非病毒性6-10 基因转移，蛋白质胞质转位11,12，以及miRNA13-16 转染是目前用于生成诱导多能干细胞（iPS细胞）的多种方法之一。然而，此类重编程技术存在若干问题，限制了其向临床应用的转化，包括：a）细胞重编程效率严重受限；b）主要依赖病毒载体；c）培养条件所需的操作流程冗长且步骤繁多；d）移植后存在致瘤风险 体外 诱导多能干细胞17-20.

通过逆转录病毒介导的特定转录因子基因转移3-5是重编程体细胞最常用的方法。然而，该方法存在插入突变、稳定转导以及原癌基因长期表达等风险21,22。非病毒基因转移载体，如质粒DNA6,7,23或RNA10，可通过脂质体转染或电穿孔方式进行递送，也已被探索应用。尽管相较于病毒载体更安全，但这些载体的转导效率和重编程效率显著受限24,25。

这一新兴领域的核心教条之一是 体内 iPS细胞的植入将导致其不受控制地分化，并形成由三个不同胚层组织构成的类肿瘤样肿块（畸胎瘤）。因此，重编程至多能性的概念主要集中在 体外 对原代提取的体细胞（最常见为成纤维细胞）进行操作。然而，如上所述，该方法存在培养周期长、细胞培养流程复杂等问题，需经历多轮处理（基因转导、生长因子、抗生素、抗氧化剂），而这些处理本身可能增加细胞移植后畸胎瘤形成或其他类型肿瘤发生的风险24-28.

我们提出，对成年体细胞进行重编程 体内 通过瞬时过表达OKSM转录因子不会导致畸胎瘤的后续形成29实现这一目标的方法将取决于以尽可能安全的方式在目标组织内实现高水平的转录因子表达。在本研究中，我们选择了一种已建立的无病毒基因转导技术，该技术已被证明可高效靶向肝脏，以实现细胞重编程为多能性状态 体内该技术涉及通过大容量、快速水动力尾静脉（HTV）注射质粒DNA30,31转染基因在成年肝细胞中可通过该非病毒基因转移方法实现高水平表达。此外，该技术可最大限度降低使用病毒载体所带来的潜在风险。例如 永久基因组插入，插入突变

方案

1. 在体 通过HTV给药pDNA实现肝组织重编程

  1. 让6周龄的雌性Balb/C小鼠在进行任何操作前，先在动物房适应环境一周。
  2. 用蒸馏水配制0.9%生理盐水，并通过0.22 μm微孔滤膜过滤。
  3. 每只小鼠用1.5 ml 0.9%生理盐水溶解75 μg pCX-OKS-2A和75 μg pCX-cMyc质粒DNA，配制成溶液。注意：注射总体积必须为小鼠总体重的8-10%。
    注意：注射前，将小鼠置于37 °C加热舱内，直至尾静脉清晰可见并明显扩张。
  4. 在注射前（加热舱内）及注射过程中，使用异氟烷诱导麻醉（通过麻醉面罩）。
  5. 使用27 G注射器经尾静脉高压注射（HTV）方式给予质粒DNA溶液或生理盐水对照。注意：为确保转染成功，总注射体积应在5-7秒内完成。
  6. 监测动物注射后的恢复情况。

2. 用于qRT-PCR研究的肝脏灌注与原代肝细胞分离

  1. 在HTV注射后的不同时间点（包括2、4、8、12和24天），使用异氟烷诱导深度麻醉。
  2. 用70%乙醇喷洒动物腹部，用手术剪在腹侧中线处切开皮肤，并分离腹肌层以暴露内脏。
  3. 用剪刀剪开膈肌以暴露胸腔，并用止血钳夹闭下腔静脉。
  4. 将内脏向右推移，并移动肝叶，使下腔静脉和门静脉易于操作。
  5. 用22 G导管插管下腔静脉，并剪开门静脉以避免压力过高。
  6. 开始以预热至37 °C的10 ml HBSS缓冲液（无Ca2+和Mg2+，含碳酸氢盐）进行灌注。使用10 ml注射器缓慢灌注缓冲液，直至肝脏变白（约3分钟）。
  7. 继续以预热至37 °C的肝脏消化液进行灌注，流速为0.6 ml/min，持续15分钟，直至肝脏肿胀并变得松软。注意：过度消化和灌注可能损伤肝细胞或重编程细胞。
  8. 将后续实验步骤转移至4 °C环境中进行。
  9. 剪断镰状韧带和冠状韧带后，用镊子取出肝脏，并用肝细胞洗涤液冲洗，同时通过100 μm细胞筛网以获得单细胞悬液。
  10. 将细胞悬液收集至50 ml离心管中，并用肝细胞洗涤液调整体积至15 ml。
  11. 在4 °C条件下，以50 g离心4分钟。弃去上清液（含有库普弗细胞和上皮细胞），将细胞沉淀（含肝细胞）重悬于10 ml肝细胞洗涤液中。注意：重悬细胞沉淀时需格外小心，肝细胞为非常脆弱的细胞。
  12. 重复离心步骤共三次，最终将细胞沉淀重悬于10 ml肝细胞洗涤液中。
  13. 使用光学显微镜和血细胞计数板估算细胞数量。
  14. 将细胞分装为每份2 × 106个细胞，以300 × g离心以回收全部细胞，并弃去上清液。
  15. 此时，细胞沉淀可冷冻保存于-20 °C，待后续处理时使用，或立即用于RNA提取。

3. 分离肝细胞中多能性基因上调的基因表达研究

  1. 按照试剂盒供应商的说明，使用离心柱试剂盒从 2 × 106 个细胞中提取 RNA。
  2. 取 1 μg 提取的 RNA，按照试剂供应商的说明进行两步法 qRT-PCR。
  3. 以生理盐水注射动物的肝细胞作为对照，校正重编程、多能性及肝细胞标志物的相对基因表达水平。

4. 蛋白质水平上增强多能性的流式细胞术分析

  1. 注射后第1天和第4天，进行肝脏灌注并按上述方法分离原代肝细胞。
  2. 将细胞密度调整至 1 × 107 个细胞/ml，并准备 100 μl 的分装样品。
  3. 使用 BD Cytofix 固定缓冲液固定细胞，并用 1× BD Perm/Wash 缓冲液进行透化处理。
  4. 将细胞与抗小鼠 OCT4-PerCP-Cy5.5 或抗小鼠 Nanog-PE 抗体在 30 分钟内孵育。
  5. 设置阴性对照和同型对照。
  6. 使用 CyAn ADP 高性能研究型流式细胞仪分析染色后的细胞。

5. 多能性标志物的肝组织切片免疫染色

  1. 注射后第四天，按照上述方法灌注肝脏，但仅使用HBSS缓冲液，以清除肝组织中的血液。
  2. 切取一块肝组织，浸入预冷于液氮中的2-甲基丁烷中，用于后续冷冻切片。
  3. 冷冻组织可保存于-80 °C，或直接使用冷冻切片机切成14 μm厚的切片。
  4. 将组织切片在室温下空气干燥1小时，然后用预冷至-20 °C的甲醇固定10分钟；再空气干燥15分钟，随后用PBS洗涤两次，每次5分钟。
  5. 将切片在封闭缓冲液（含5%山羊血清和0.1% Triton的PBS，pH 7.3）中室温孵育1小时，随后用洗涤缓冲液（含1% BSA和0.1% Triton的PBS，pH 7.3）洗涤两次。
  6. 将组织切片在4 °C下与抗OCT4、抗SOX2和抗Nanog一抗抗体共同孵育过夜。
  7. 次日，用洗涤缓冲液洗涤切片三次，每次5分钟，然后在室温下与二抗抗体孵育1.5小时。
  8. 用PBS洗涤肝组织切片（三次，每次5分钟），然后用含DAPI和抗荧光淬灭剂的封片液封片。
  9. 在落射荧光显微镜下观察切片。

6. 肝组织切片的碱性磷酸酶（ALP）染色

  1. 按照之前所述方法获取肝组织切片。
  2. 染色前将组织切片于室温下放置15分钟以复温。
  3. 用4%多聚甲醛固定2分钟。注意：固定时间过长会降低碱性磷酸酶（ALP）活性。
  4. 将切片晾干30分钟，随后在37 °C下用BCIP/NBT液体底物孵育30分钟。
  5. 用蒸馏水洗涤切片，并使用水溶性封片介质封片。
  6. 通过光学显微镜随机采集图像。

7. 通过检测血清中白蛋白和肝酶水平评估肝毒性

  1. 转染后第4、8、12和120天，直接从心脏心室采集300 μl血液。
  2. 在收集不同样本期间，将血液置于冰上，以防止凝固。
  3. 所有样本收集完毕后，在37 °C孵育30分钟，直至血液凝固。
  4. 以2,000 × g离心5分钟。
  5. 小心吸取上清液中的血清，转移至新的Eppendorf管中，并于-80 °C冷冻保存，直至进行后续处理。
  6. 检测血清中白蛋白、ALT、AST、ALP和GLDH的水平。

8. 通过苏木精-伊红（H&E）和过碘酸-雪夫（PAS）染色评估肝组织切片中的肝毒性

  1. 在HTV注射后的不同时间点（包括2、4、8、12、24、50和120天），仅使用HBSS缓冲液按照先前所述方法进行肝脏灌注。
  2. 切取一块肝组织，用4%多聚甲醛固定。
  3. 将肝组织包埋于石蜡块中，切片后采用H&E染色或PAS染色。
  4. 通过光学显微镜随机采集图像。

结果

图1 展示了将编码 OKSM 的质粒进行小鼠肝脏基因转移的操作流程概览，以及用于观察的多种实验技术 在体 细胞重编程。在注射质粒后，转染的重编程因子（Oct3/4、Sox2、Klf4 和 cMyc）在mRNA水平上的基因表达于第2天显著升高。如图所示，这些因子的表达在注射后随时间推移逐渐下降。 图2a关于内源性多能性标志物（Nanog、Ecat1 和 Rex1）的表达，在注射后第2天和第4天，其水平相较于生理盐水注射组动物的肝细胞显著上调，并从第8天起恢复至基线水平 （图2b）同时，通过肝细胞特异性基因（Alb、Aat 和 Trf）的下调证实了肝细胞群体的去分化，该下调在第4天具有统计学显著性，并从第8天起降至基线水平 （图2d）.

通过流式细胞术检测了Oct3/4和Nanog在蛋白水平的表达。如图2c所示，HTV注射后第1天仅有Oct3/4表达，而内源性多能性标志物Nanog的表达则需等到第4天才能检测到。

发生 在体 通过使用抗OCT4、抗SOX2和抗Nanog抗体对肝组织进行免疫组织化学分析，并结合ALP活性的特异性染色，进一步证实了细胞重编程。在注射OKSM的动物肝组织中可重复检测到所有标记物阳性和ALP酶活性阳性细胞，而在注射生理盐水的对照组中则未检测到 （图3）.

通过检测血清中肝酶水平以及在120天内对肝组织切片进行H&E染色和PAS染色，研究了经HTV注射pDNA进行体内细胞重编程可能引起的毒性副作用及畸胎瘤形成情况。直到第2天观察到短暂且不严重的组织损伤迹象，但未持续更长时间。在研究期间内，未观察到畸胎瘤形成或任何发育异常或形态学改变的迹象（图4）。所有动物在整个研究过程中均未出现肝脏结构或功能异常，白蛋白和肝酶水平以及组织切片的糖原染色结果均证实了这一点（图4b和c）。

In vivo reprogramming factors injection, mouse diagram, plasmid, tissue analysis, PCR, cytometry.
图1. 示意图概述 体内 重编程过程及其分析 该方案包含两个主要阶段： (i) 重编程因子的递送 体内 和 （ii） 组织提取与样品分析 单击此处查看大图.

基因表达分析；显示不同天数相对表达数据的柱状图；图 a-d；科学结果。
图 2. 成年小鼠肝脏中 Yamanaka 转录因子的 体内 过表达。 Balb/C 小鼠通过水动力尾静脉（HTV）注射仅含 0.9% 生理盐水、或含 75 μg pCX-OKS-2A 与 75 μg pCX-cMyc 溶于 0.9% 生理盐水的混合物，分别在注射后第 2、4、8、12、24 天进行肝细胞的 RT-qPCR 分析，以测定以下基因的相对表达水平：(a) 转染的转录因子（OKSM）和 (b) 内源性多能性标志物；(c) OCT3/4 阳性与 Nanog 阳性细胞的流式细胞术分析；(d) 通过 RT-qPCR 测定的肝细胞标志物的相对基因表达水平。所有基因表达水平均以生理盐水 HTV 注射组为参照进行标准化。（* p<0.05 表示与生理盐水 HTV 注射组相比具有统计学显著差异，经方差分析及 Tukey 成对比较检验得出）。该图改编自 Yilmazer 等29。 点击此处查看高清大图。

盐水处理组与OKSM处理组细胞中OCT4、SOX2、NANOG的免疫荧光显微镜比较。
图3. 通过免疫组织化学法检测成年小鼠肝脏组织中的体内细胞重编程。 将Balb/C小鼠通过HTV注射仅含0.9%盐水，或含75 μg pCX-OKS-2A和75 μg pCX-cMyc的0.9%盐水。第4天收集肝脏，制备冷冻组织切片，并使用抗OCT4、抗SOX2或抗Nanog抗体染色以评估免疫反应性，或使用BCIP/NBT检测组织中的碱性磷酸酶（ALP）活性（40X）。比例尺为100 μm。本图改编自Yilmazer et al.29 点击此处查看高清大图。

Liver histology, enzyme levels, and albumin in saline vs. OKSM treatment, experiment results.
图4. 的影响 在体 细胞重编程对肝脏功能及组织病理学的影响 Balb/C小鼠经HTV注射 75 μg pCX-OKS-2A 和 75 μg pCX-cMyc 溶于0.9%生理盐水或仅0.9%生理盐水。于第2、4、8、12、50和120天分离肝脏组织和血清，并进行如下处理： (a) H&E染色； (b) 肝酶水平； (c) 白蛋白水平； （d） PAS 染色。采用光学显微镜（10倍）拍摄代表性图像。比例尺表示 100 μm图改编自 Yilmazer 等29 单击此处以查看大图.

讨论

本研究提供了原理性证据，表明通过高效递送并过表达 OKSM 因子，可实现成年小鼠肝脏中体细胞向多能性的 体内 重编程。借助 qRT-PCR、流式细胞术、免疫组化（IHC）或血清分析等多种技术，对靶组织进行了检测以观察 体内 细胞重编程过程。在组织中诱导 OKSM 因子过表达后极短时间内（48 小时内），多能性标志物在 mRNA 和蛋白质水平均出现上调。在整个实验过程中，从组织中提取的细胞中有 5–15% 表达 Nanog 和 Oct3/4。此外，在长达 120 天的观察期内，肝脏未出现任何结构或功能异常。已有文献报道，通过 HTV 注射质粒 DNA 可在肝外组织（如肺、脾、肾和心脏）中实现外源基因表达，但其表达水平至少比肝细胞低三个数量级30。本研究的数据表明，体内 将体细胞重编程为多能状态具有安全性高、速度快和效率高的特点。鉴于目前大多数 体外 细胞重编程方法通常需要约 3 周时间，且效率低于 1%32，体内 向多能性重编程可能提供极具吸引力的替代途径。我们推测，体内 向多能性重编程的概念可被应用于多种类型的体细胞，并实现较高效率（取决于所用载体），但 体内 重编程细胞所达到的功能性多能性水平仍有待进一步确定。此外，随着更优方案和技术的发展，体内 重编程细胞有望被分离并用于再生医学目的。

为了重编程成年体细胞，需遵循一些关键步骤 体内 高效地实现靶组织中高水平的基因表达是先决条件。本研究通过采用水动力尾静脉注射法（HTV注射）将质粒DNA高效转染并表达于肝细胞，对此进行了验证。HTV注射最关键的两个因素是注射体积和注射速度：注射体积应为动物总体重的8%-10%，注射时间必须控制在5-7秒内完成。不应使用小于6周龄的小鼠，因为HTV注射可能在幼龄小鼠肝脏中引起更严重的组织损伤，从而影响细胞重编程效率。动物的遗传背景对转染效率无显著影响。 体内 重编程，正如我们先前报道的那样，在Balb/C和TNG-A小鼠中均观察到相似水平的重编程效率，后者是一种携带转基因的品系 eGFP 报告基因插入在 Nanog 基因座，且在Sv129背景品系中培育29.

我们推测，体内细胞重编程至多能状态（该状态尚需确定）可应用于其他组织类型，前提是能够将OKSM因子有效递送至靶细胞，从而实现高水平的基因表达。多种非病毒和病毒基因递送载体已在临床前和临床试验中被研究，以靶向不同的细胞和组织类型33。例如，在神经或眼部组织中，腺相关病毒是实现高效体内基因转移的首选载体34–37，而在肌肉组织中，裸质粒DNA注射已被证明可实现相对较高的基因表达水平38,39。因此，为实现高效且快速的体内细胞重编程至多能状态，应根据组织类型谨慎选择基因转移载体方法。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作部分得到了工程与物理科学研究理事会（EPSRC，斯温顿，英国）以及欧盟第七框架计划NANONEUROHOP（PIEF-GA-2010-276051）和ANTICARB（HEALTH-2008-20157）项目的支持。AY获得了土耳其教育部全日制博士奖学金的支持，IL感谢英国文化协会和凯克萨基金会（西班牙）提供的部分支持。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
pCX-OKS-2A pDNAAddgene19771从 Addgene 获取菌种划线，质粒生产在德国质粒工厂完成
pCX-cMycAddgene19772从 Addgene 获取菌种划线，质粒生产在德国质粒工厂完成
0.22 μm 滤膜MillioporeSLGP033RS
异氟烷AbbottB505
HBSS 缓冲液Sigma-AldrichH6648无 Ca2+ 和 Mg2+，含碳酸氢盐
肝脏消化培养基Gibco17703-034
肝细胞洗涤培养基Gibco17704-024
100 μm 细胞筛BD Biosciences352360
Nucleospin RNA II 试剂盒Macherey-Nagel740955.25用于从细胞和组织中分离 RNA 的试剂盒
iScript cDNA 合成试剂盒Bio-Rad170-8890
iO SYBR Green SupermixBio-Rad170-8880
Oct3/4 正向引物Sigma序列见注释TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA
Oct3/4 反向引物Sigma序列见注释CTCAATGCTAGTTCGCTTTCTCTTC
Sox2 正向引物Sigma序列见注释GGTTACCTCTTCCTCCCACTCCAG
Sox2 反向引物Sigma序列见注释TCACATGTGCGACAGGGGCAG
C-myc 正向引物Sigma序列见注释CAGAGGAGGAACGAGCTGAAGCGC
C-myc 反向引物Sigma序列见注释TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG
Nanog 正向引物Sigma序列见注释CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG
Nanog 反向引物Sigma序列见注释GCAATGGATGCTGGGATACTC
Ecat1 正向引物Sigma序列见注释TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT
Ecat1 反向引物Sigma序列见注释ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT
Rex1 正向引物Sigma序列见注释ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA
Rex1 反向引物Sigma序列见注释TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT
Alb 正向引物Sigma序列见注释GTTCGCTACACCCAGAAAGC
Alb 反向引物Sigma序列见注释CCACACAAGGCAGTCTCTGA
Aat 正向引物Sigma序列见注释CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG
Aat 反向引物Sigma序列见注释ATGGACAGTCTGGGGAAGTG
Trf 正向引物Sigma序列见注释ACCATGTTGTGGTCTCACGA
Trf 反向引物Sigma序列见注释ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG
B actin 正向引物Sigma序列见注释GACCTCTATGCCAACACAGT
B actin 反向引物Sigma序列见注释AGTACTTGCGCTCAGGAGGA
BD Cytofix 固定缓冲液BD Biosciences560585
1x BD Perm/Wash 缓冲液BD Biosciences560585
抗小鼠 OCT4-PerCP-Cy5.5BD Biosciences560585
抗小鼠 Nanog-PEBD Biosciences560585
2-甲基丁烷Sigma-AldrichM32631
X100-吐温Sigma-AldrichX100-500ML
山羊血清Sigma-AldrichG9023
BSASigmaA2153
兔多克隆抗体抗-OCT4Abcamab19857使用浓度为 3 μg/ml
兔多克隆抗体抗-SOX2Abcamab97959使用浓度为 1 μg/ml
兔多克隆抗体抗-NanogAbcamab80892使用浓度为 1 μg/ml
小鼠单克隆抗体抗-SSEA1Abcamab16285使用浓度为 20 μg/ml
Cy3 标记的山羊抗兔 IgG 多克隆抗体Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.111-165-003-JIR使用稀释度为 1/250
Cy3 标记的山羊抗小鼠 IgG 多克隆抗体Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.115-165-003-JIR使用稀释度为 1/250
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片剂Vector LaboratoriesH-1200
BCIP/NBT 液体底物系统SigmaB1911
水性封片剂Sigma
16% 多聚甲醛FisherAA433689M储存液为 16%，使用时稀释至 4%
苏木精和伊红SigmaGH53/HT110216
PAS 染色Sigma395B

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