使用氢交换质谱分析蛋白质动力学

摘要

蛋白质构象和动力学的关键是理解蛋白质结构与功能之间的关系。氢交换耦合用高分辨率质谱法是研究蛋白质的构象动力学以及表征蛋白质 - 配体和蛋白质之间的相互作用，其中包括接触接口和变构效应的灵活的方法。

摘要

所有的细胞过程依赖于蛋白质的功能。尽管给定的蛋白质的功能是其独特的氨基酸序列的直接后果，它仅由多肽链的折叠成一个单一的定义的三维结构或更常见为构象之间互相的合奏来实现。研究蛋白质构象与功能之间的联系是必不可少的，因此对于蛋白质如何能够履行其种类繁多的任务的完整理解。一种可能性，研究的构象变化，而 ​​通过其官能周期进展的蛋白质经历是氢^-1H / ² H-交换与高分辨率质谱（HX-MS）的组合。 HX-MS是增加了一个新的层面，通过如结晶获得结构信息的灵活和可靠的方法。它是用来研究蛋白质折叠和展开，小摩尔结合ecule配体，蛋白质 - 蛋白质相互作用，挂酶催化的构象变化，和变构效应。此外，HX-MS通常被用于当蛋白质的量是非常有限的或蛋白质的结晶是不可行的。在这里，我们提供了一个通用协议，用于研究蛋白质动力学与HX-MS和描述，例如，如何显示两种蛋白质的相互作用界面在复杂的。

引言

蛋白和蛋白复合物的晶体结构的数量近年来迅速增加。他们提出这些蛋白质的结构组织的非常宝贵的快照，并为结构 - 功能分析的基础。然而，蛋白质和构象变化，这对于其功能必需的动力，也很少由X-射线结晶学揭示。冷冻电镜，另一方面，能够捕获蛋白和蛋白复合物在不同的构象，但一般不能解析的构象变化下降到二级结构的第¹级。在原子细节的蛋白质在溶液中的构象动力学只能通过NMR来解决，但这种方法仍局限于相对较小的尺寸（通常≤30 kDa）的蛋白，并且需要高浓度的蛋白质（≥100微米），这阻碍了实验低聚或易聚集的蛋白质^2。一种方法，该方法能够高分辨率X-射线晶体学和低温电镜和其之间的桥梁不是由蛋白质大小或浓度的限制是酰胺氢^-1与质谱（MS）结合的H / ² H-交换（HX）。近年来，这种方法已经发展到用于蛋白质动力学，蛋白质折叠，蛋白质稳定性和构象变化^3-5的分析有价值的分析工具。该方法的分子基础是骨干酰胺氢中的蛋白质，这将与氘原子交换，当蛋白质被放置在D _{2 O}中的溶液中不稳定的性质。随着时间的推移随后增加蛋白质量的测量与高分辨率质谱。

总之非结构化肽HX只依赖于温度，催化剂浓度（OH ^- ，H ₃ O ^+，即 pH值， 见图3）和相邻的残基，由于电感....

方案

1。缓冲液的制备和蛋白样品

1. 准备H ₂ O缓冲区。用Hsp90的标准缓冲液（40mM的HEPES / KOH，pH值为7.5，50mM的氯化钾，5毫摩尔MgCl _2，10％甘油），为H _{2 O}的缓冲液中。
   注意 :如果样品分析前透析，用透析缓冲液以H ₂ O缓冲区。至关重要的是，在D _{2 O}缓冲器不同于H _{2 O}的缓冲仅在氢同位素。易失性缓冲区像NH ₄ CO ₃或NH ₄ -乙酸酯或缓冲液组分是不适合！
2. 用真空浓缩器的热休克蛋白90的标准缓冲液冻干准备D ₂ O缓冲区。对H ₂ O完全蒸发后，加入纯D ₂ O到管达到初始总容积（ 如 1毫升15％甘油缓冲需要添加850微升D ₂ O）。重复该缓冲器的完全蒸发，并再溶解在缓冲/盐的COMponents在D _{2 O}中2倍。
3. 制备骤冷缓冲液（0.4M的KH ₂ PO ₄ / H ₃ PO ₄ pH值2.2）。
   注意 :为了提高胃酶....

结果

热休克蛋白90是在酵母和热休克蛋白90分子伴侣家族成员分子伴侣。通过经历一个复杂的ATP酶周期它有助于后期折叠步骤很多蛋白质的客户。高效的折叠需要从Hsp70的传输客户端和共伴侣Sti1/Hop的相互作用。 STI1直接结合的Hsp90，便于客户通过抑制热休克蛋白90的ATP酶活性的结合。热休克蛋白90与STI1的相互作用采用HX-MS ²³最近的研究。在这里，我们提出了相关的实验按照上述协议代表性的结果。

直接蛋白相互作用是由与D _{2 O}标记的蛋白复合物处于平衡状态，在没有Hsp90.The造成差异的情节和存在比较STI1肽谱可以在图5A（数据来自^23）可以看出测试。肽被定向从上到下开始在N-末端。大多肽TPR2a和TPR2b显示出强大的保护，热休克蛋白90（用于D _{+热休克蛋白90}的负值- _D-Hsp90的 ）的存在，表明这些地区与Hsp90的相互作用。在TPR2a保护可以很容易地从STI1-TPR2a-TPR2b在与表示热休克蛋白90.......

讨论

一个互动的合作伙伴，一个蛋白质的结合不可避免地导致对结合位点的改变溶剂可及性。此外，许多蛋白进行结合后的动态构象变化，从而影响其他区域比实际的结合界面。 HX-MS是一种可靠的方法来监测这些变化，甚至能够在时间尺度是其他方法不能覆盖揭示蛋白质构象变化的。

为了成功执行HX-MS三点是关键:1）一个最佳的系统设置; 2）指定肽谱和解释结果时，精确的执行来样加工及3）仔细的数据分析。

系统设置

因为质谱法用于检测氘核掺入肽，对于样品的制备同样的预防措施申请HX-MS分析。洗涤剂，盐和其他化合物与质谱抄干扰ULD被避免或删除分析之前。而HX-MS允许大蛋白复合物的分析，较高的复杂性要求肽的分离和质谱的质量提高。色谱条件优化的关键是获得高质量的数据。这涉及到高品质的有机溶剂的选择，反相材料以及梯度和溶剂的优化。与有机溶剂的列可以洗涤实验和隔夜之间进行，以减少背景信号。质谱方法应该检测消化性溃疡肽（300-1,200米/ Z之间）进行优化。高分辨率质谱仪大大方便数据分析，因为部分重叠的同位.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
maXis QTOF	，布鲁克
nanoAcquity，UPLC	，沃特世公司
岛津 10AD-VP	岛津
6 通阀 EPC6W 带微电动执行器	Valco	#EPC6W
进样阀（手动）	Rheodyne	#7725
Poros AL20 培养基	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
胃蛋白酶	Sigma	#P6887	使用新鲜胃蛋白酶
微孔 （1 mm）	IDEX	#C-128
微孔 （2 mm）	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 色谱柱	Waters Corp.	#186002876
Thermomixer	Eppendorf	#5355000.011
管路 （各种直径）	IDEX
接头	IDEX	#PK-110 带 PK-100