利用氢交换质谱法分析蛋白质动力学

摘要

蛋白质构象与动力学对于理解蛋白质结构与功能之间的关系至关重要。氢交换结合高分辨率质谱法是一种多功能方法，可用于研究蛋白质的构象动力学，以及表征蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用，包括结合界面和变构效应。

摘要

所有细胞过程都依赖于蛋白质的功能。尽管特定蛋白质的功能直接由其独特的氨基酸序列决定，但只有当多肽链折叠成单一确定的三维结构，或更常见地形成一组相互转换的构象集合时，该功能才能得以实现。因此，研究蛋白质构象与其功能之间的联系，对于全面理解蛋白质如何完成其多种多样的任务至关重要。研究蛋白质在执行其功能循环过程中所经历的构象变化的一种方法是氢-¹H/²氢交换结合高分辨率质谱（HX-MS）。HX-MS 是一种多功能且稳健的方法，可为通过其他手段获得的结构信息提供新的维度 例如 晶体学。它可用于研究蛋白质的折叠与去折叠、小分子配体的结合、蛋白质-蛋白质相互作用、与酶催化相关的构象变化以及变构效应。此外，当蛋白质样品量非常有限或难以获得结晶时，通常采用氢氘交换质谱法（HX-MS）。本文提供了一种利用HX-MS研究蛋白质动力学的通用实验方案，并以实例说明如何揭示蛋白质复合物中两个蛋白质之间的相互作用界面。   

引言

近年来，蛋白质及蛋白质复合物的晶体结构数量迅速增加。这些结构为了解这些蛋白质的组织架构提供了宝贵的快照，并为结构-功能分析奠定了基础。然而，X射线晶体学通常难以揭示蛋白质的动力学行为及其功能所必需的构象变化。另一方面，冷冻电子显微镜能够捕捉蛋白质及蛋白质复合物在不同构象状态下的图像，但通常无法将构象变化解析到二级结构水平¹。在溶液中以原子级细节解析蛋白质构象动态的唯一方法是核磁共振（NMR），但该方法仍局限于相对较小分子量的蛋白质（通常≤ 30 kDa），且需要较高的蛋白质浓度（≥ 100 μM），这限制了其在易发生寡聚化或聚集的蛋白质上的应用²。一种能够弥合高分辨率X射线晶体学与冷冻电子显微镜之间差距、且不受蛋白质大小或浓度限制的方法是酰胺氢-¹H/²H交换（HX）结合质谱（MS）技术。近年来，该方法已发展成为研究蛋白质动力学、蛋白质折叠、蛋白质稳定性及构象变化的重要分析工具^3-5。该方法的分子基础在于蛋白质主链酰胺氢的不稳定性，当蛋白质置于D₂O溶液中时，这些氢原子会与氘原子发生交换。随后随时间推移的蛋白质质量增加可通过高分辨率质谱进行测定。

简而言之，无规卷曲肽段中的氢氘交换（HX）仅依赖于温度、催化剂浓度（OH⁻）^-，H₃O⁺ 即 pH，参见

方案

1. 缓冲液和蛋白质样品的制备

1. 制备 H₂O缓冲液。使用Hsp90标准缓冲液（40 mM HEPES/KOH，pH 7.5，50 mM KCl，5 mM MgCl₂）₂，10% 甘油）作为 H₂O缓冲液
   注意：如果样品在分析前经过透析，则使用透析缓冲液作为 H₂O缓冲液。D的缓冲液至关重要₂O缓冲液与H不同₂仅在氢同位素中使用O缓冲液。挥发性缓冲液如NH₄CO₃ 或 NH₄-乙酸盐或缓冲液组分不适用！
2. 制备 D₂使用真空浓缩仪通过冻干Hsp90标准缓冲液制备O缓冲液。H完全蒸发后₂O 加入纯 D₂O 加入试管中，以达到初始总体积（例如 含15%甘油的1 ml缓冲液需要加入850 μl D₂O). 重复完全蒸发缓冲液，并将缓冲液/盐成分重新溶解于 D₂O 2x.
3. 制备淬灭缓冲液（0.4 M KH₂PO₄/₃PO₄ pH 2.2
   注意为了提高对非常稳定蛋白质的胃蛋白酶消化....

结果

Hsp90 是酵母中的一种分子伴侣，属于 Hsp90 伴侣蛋白家族。它通过一个复杂的 ATP 酶循环，协助多种客户蛋白的后期折叠过程。有效的折叠需要客户蛋白从 Hsp70 转移，并与共伴侣蛋白 Sti1/Hop 相互作用。Sti1 可直接结合 Hsp90，并通过抑制 Hsp90 的 ATP 酶活性来促进客户蛋白的结合。近期已采用氢氘交换质谱（HX-MS²³）研究了 Hsp90 与 Sti1 的相互作用。本文展示了遵循上述方案所获得实验的代表性结果。

通过在平衡状态下用D标记蛋白质复合物，检测了蛋白质间的直接相互作用₂O，并比较Sti1肽段在有无Hsp90存在下的质谱图。所得差异图如图所示。 图 5A （数据来自²³）。肽段从顶部到底部排列，起始于N端。在Hsp90存在的情况下，TPR2a和TPR2b中的大多数肽段显示出强烈的保护作用（ΔD值为负）。_+Hsp90 - D_Hsp90)，表明这些区域与Hsp90发生相互作用。TPR2a中的保护效应.......

讨论

相互作用伙伴与蛋白质结合时，不可避免地会引起结合位点处溶剂可及性的变化。此外，许多蛋白质在结合过程中会发生动态的构象变化，这些变化会影响实际结合界面以外的其他区域。氢氘交换质谱法（HX-MS）是一种用于监测这些变化的可靠方法，甚至能够揭示其他技术难以覆盖的时间尺度上的蛋白质构象变化。

成功实施氢氘交换质谱（HX-MS）需把握三个关键点：1）优化的系统配置；2）精确的样品处理操作；3）在指认肽段谱图和解析结果时进行严谨的数据分析。

系统设置

由于质谱技术用于检测氘代标记在肽段中的掺入情况，因此HDX-MS（氢-氘交换质谱）在样品制备过程中需遵循相同的注意事项。在分析前应避免或去除干扰质谱检测的去垢剂、盐类及其他化合物。尽管HDX-MS可用于分析大型蛋白质复合物，但其更高的复杂性对肽段分离和质谱分析的质量提出了更高要求。色谱条件的优化是获得高质量数据的关键，包括选择高品质的有机溶剂、反相色谱材料，以及梯度和溶剂条件的优化。可在实验间或过夜使用有机溶剂清洗色谱柱，以降低背景信号。质谱.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-通道电动阀 EPC6W，带微型电动执行器	Valco	#EPC6W
进样阀（手动）	Rheodyne	#7725
Poros AL20 介质	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
胃蛋白酶	Sigma	#P6887	使用新鲜胃蛋白酶
微径管（1 mm）	IDEX	#C-128
微径管（2 mm）	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 色谱柱	Waters Corp.	#186002876
恒温混匀仪	Eppendorf	#5355000.011
管路（多种直径）	IDEX
接头	IDEX	#PK-110 与 PK-100 配套使用