利用氢交换质谱法分析蛋白质动力学

摘要

蛋白质构象与动力学对于理解蛋白质结构与功能之间的关系至关重要。氢交换结合高分辨率质谱法是一种多功能方法，可用于研究蛋白质的构象动力学，以及表征蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用，包括结合界面和变构效应。

摘要

所有细胞过程都依赖于蛋白质的功能。尽管特定蛋白质的功能直接由其独特的氨基酸序列决定，但只有当多肽链折叠成单一确定的三维结构，或更常见地形成一组相互转换的构象集合时，该功能才能得以实现。因此，研究蛋白质构象与其功能之间的联系，对于全面理解蛋白质如何完成其多种多样的任务至关重要。研究蛋白质在执行其功能循环过程中所经历的构象变化的一种方法是氢-¹H/²氢交换结合高分辨率质谱（HX-MS）。HX-MS 是一种多功能且稳健的方法，可为通过其他手段获得的结构信息提供新的维度 例如 晶体学。它可用于研究蛋白质的折叠与去折叠、小分子配体的结合、蛋白质-蛋白质相互作用、与酶催化相关的构象变化以及变构效应。此外，当蛋白质样品量非常有限或难以获得结晶时，通常采用氢氘交换质谱法（HX-MS）。本文提供了一种利用HX-MS研究蛋白质动力学的通用实验方案，并以实例说明如何揭示蛋白质复合物中两个蛋白质之间的相互作用界面。   

引言

近年来，蛋白质及蛋白质复合物的晶体结构数量迅速增加。这些结构为了解这些蛋白质的结构组织提供了宝贵的快照，并为结构-功能分析奠定了基础。然而，蛋白质的动力学特性及其功能所必需的构象变化，通常难以通过X射线晶体学揭示。另一方面，冷冻电子显微镜（cryo-electronmicroscopy）能够捕捉蛋白质及蛋白质复合物在不同构象下的状态，但通常无法将构象变化解析到二级结构水平¹。在溶液中以原子级细节解析蛋白质的构象动力学，目前仅能通过核磁共振（NMR）实现，但该方法仍受限于蛋白质分子量较小（通常≤30 kDa）且需要较高的蛋白质浓度（≥100 μM），这限制了其在易发生寡聚化或聚集倾向蛋白质上的应用²。一种能够弥合高分辨率X射线晶体学与冷冻电子显微镜之间差距、且不受蛋白质大小或浓度限制的方法是酰胺氢-¹H/²H交换（HX）结合质谱（MS）技术。近年来，该方法已发展成为分析蛋白质动力学、蛋白质折叠、蛋白质稳定性及构象变化的重要分析工具^3-5。该方法的分子基础在于蛋白质主链酰胺氢的不稳定性，当蛋白质置于D₂O溶液中时，这些氢原子会与氘原子发生交换。随后随时间推移的蛋白质质量增加可通过高分辨率质谱进行测量。

简而言之，无规卷曲肽段中的氢氘交换（HX）仅依赖于温度、催化剂浓度（OH⁻）^-，H₃O⁺ 即 pH，参见 图3）以及相邻残基的氨基酸侧链，这是由于诱导效应、催化效应和空间位阻效应所致。这些效应会影响固有化学交换速率k_ch 已被 Bai 精确量化 等.⁶ 并提供一个程序（由 Z. Zhang 提供），用于计算 k_ch 对于多肽中的每种氨基酸，其性质依赖于 pH 和温度。在中性 pH 和常温条件下，k_ch 在10的数量级上¹-10³ 秒^-1在折叠蛋白中，氢交换（HX）速度通常减缓2到9个数量级，这主要归因于二级结构中的氢键作用，次要原因则是水合氢氧根（OH⁻）的进入受到限制。^- 离子进入紧密折叠蛋白质的内部。因此，天然蛋白质中的氢氘交换（HX）涉及部分或全局去折叠、化学交换以及根据方程（1）重新折叠至天然状态，其观测到的交换速率k_观察 取决于开孔速率 k_op，关闭速率k_cl 以及内在化学交换速率 k_ch 根据公式（2）。

在天然状态条件下，k_op 远小于 k_ch，因此在分母中可忽略不计。存在两种极端的交换机制，分别称为 EX1 和 EX2。如果 k_cl 远小于 k_ch（EX1），则观测到的速率实际上等于开环速率，氢氘交换（HX）可直接反映结构单元的去折叠过程。在这种交换机制下，结构单元一旦打开，所有酰胺质子同时发生交换，在质谱（MS）中表现为同位素峰的双峰分布⁷，易于观测。如果 k_cl 远大于 k_ch（EX2），则观测到的速率与 k_ch 成正比，比例常数等于折叠-去折叠平衡常数 K_u = k_op/k_cl。在此条件下，需经历多次开环和闭环事件后，所有酰胺质子才能完全被氘代质子取代，导致平均质量逐渐增加，而同位素分布基本保持不变。EX2 机制可用于测定去折叠自由能 ΔG_u，从而评估结构单元的稳定性。在天然状态下，EX2 机制最为常见。提高 pH 或加入变性剂可使交换机制向 EX1 转变。因此，氢氘交换-质谱法（HX-MS）可用于研究蛋白质折叠及构象变化的热力学和动力学参数。

如上所述，氢交换（HX）本质上受pH值和温度的影响，在生理pH（pH 7.6）和30 °C条件下，主链酰胺基团中完全暴露于溶剂的质子的交换半衰期为5–400毫秒，但可延长至10分钟至 >15 小时，平均为 >2小时，pH 2.9，0 °C（多肽主链第一个酰胺键的质子除外，其交换半衰期为 ca1-2 分钟）。在这种缓慢交换条件下，可以使用蛋白酶对样品进行消化（例如 胃蛋白酶）在这些条件下具有活性，同时不会丢失掺入的氘核所包含的全部信息。自从引入在慢交换条件下进行胃蛋白酶消化的方法以来，不仅能够分析全长蛋白质的整体氢-氘交换（HX）动力学，还能将氢-氘交换定位至特定区域^8,9空间分辨率目前受限于胃蛋白酶切割产生的肽段大小，通常为10-30个残基。然而，由于胃蛋白酶切割具有非特异性，可能产生重叠的肽段，从而提高空间分辨率。此外，已有研究发现其他多种蛋白酶在淬灭条件下仍具活性，但其效率远低于胃蛋白酶。¹⁰通过气相中保留氘代模式的肽段碎裂方法，如电子捕获解离（ECD）、电子转移解离（ETD）和红外多光子解离（IRMPD），可进一步提高空间分辨率。^11-13这些技术可防止因分子内质子迁移（“窜扰”）导致的空间分辨率丢失，这种现象在最常用的碎裂技术——碰撞诱导解离（CID）中尤为明显。然而，这些方法需要针对每种肽段进行单独优化，因此仍然具有较大挑战性。

HX-MS 已被用于分析蛋白质-配体和蛋白质-蛋白质相互作用，包括病毒衣壳的组装^14-17。研究人员已利用该方法考察了蛋白质的去折叠与复折叠过程，以及由温度诱导的构象变化^7,18,19。此外，还分析了与磷酸化、单个氨基酸突变相关的构象变化^16,20，以及核苷酸诱导的构象改变^21,22。因此，该方法似乎非常适用于研究分子机器的组装过程及其动态特性。其中一种极具研究价值的候选对象是Hsp90分子伴侣复合物，其作用机制在科学界具有广泛的兴趣。

方案

1. 缓冲液和蛋白质样品的制备

1. 制备 H₂O缓冲液。使用Hsp90标准缓冲液（40 mM HEPES/KOH，pH 7.5，50 mM KCl，5 mM MgCl₂）₂，10% 甘油）作为 H₂O缓冲液
   注意：如果样品在分析前经过透析，则使用透析缓冲液作为 H₂O缓冲液。D的缓冲液至关重要₂O缓冲液与H不同₂仅在氢同位素中使用O缓冲液。挥发性缓冲液如NH₄CO₃ 或 NH₄-乙酸盐或缓冲液组分不适用！
2. 制备 D₂使用真空浓缩仪通过冻干Hsp90标准缓冲液制备O缓冲液。H完全蒸发后₂O 加入纯 D₂O 加入试管中，以达到初始总体积（例如 含15%甘油的1 ml缓冲液需要加入850 μl D₂O). 重复完全蒸发缓冲液，并将缓冲液/盐成分重新溶解于 D₂O 2x.
3. 制备淬灭缓冲液（0.4 M KH₂PO₄/₃PO₄ pH 2.2
   注意为了提高对非常稳定蛋白质的胃蛋白酶消化效率，可添加4 M盐酸胍和0.5 M三(2-羧乙基)膦（TCEP-HCl）。
4. 制备100%对照样品（6 M 盐酸胍，D₂O). 向一份 Hsp90 样品中加入盐酸胍，使其终浓度达到 6 M。将 H 完全蒸发₂从样品中取出 O 并加入 D₂加水至管中，以达到初始总体积（例如 含10%甘油的100 μl样品需加入90 μl D₂O). 重复进行缓冲液的完全蒸发，并将缓冲液/盐成分重新溶解于 D₂O.
   注意每次进样需要 20–100 pmol 样品。应制备足够的样品，以确保每进行一天氢氘交换质谱（HX-MS）实验都设有 100% 对照。
5. 在5 μl Hsp90标准缓冲液中配制50 pmol Hsp90。
   注意每次原始数据采集需要 20–100 pmol 的样品量。反应体系中的样品体积理想范围为 1–5 μl。请调整样品浓度以满足上述要求。可使用任何缓冲液，只要不含去污剂或挥发性成分即可。

2. 醛活化微珠上固定化胃蛋白酶的制备

1. 将80 mg新鲜胃蛋白酶溶解于2 ml 50 mM柠檬酸钠溶液（pH 5）中。
2. 将20 mg氰基硼氢化钠小心溶解于1 ml 2 M Na₂SO₄中（剧毒！），然后加入胃蛋白酶溶液中。
3. 室温下轻轻振荡（例如顶置式摇床）孵育混合物10分钟。
4. 向混合物中加入600 mg带有固定化醛基的磁珠，室温孵育5–10分钟。
5. 在一小时内，每隔3分钟加入100 μl 2 M Na₂SO₄（pH 5），共加入2.2 ml，以缓慢盐析出胃蛋白酶。每次加样间在室温下使用顶置式摇床轻轻混匀样品。
6. 将胃蛋白酶磁珠在4 °C下于顶置式摇床上孵育14–16小时（过夜）。
7. 加入1 ml 1 M乙醇胺以终止反应，并在室温下孵育2小时。
8. 在50 ml离心管中以500 rpm离心收集磁珠，弃去上清液，用0.1%甲酸重悬磁珠，重复此步骤两次。最后一次离心后，弃去上清液，估计磁珠体积，加入等体积的0.1%甲酸，于4 °C保存。

3. 酰胺氢交换柱的制备

1. 使用内径为 1 mm 的保护柱用于捕获柱，内径为 2 mm 的保护柱用于胃蛋白酶柱。
2. 拧开保护柱的一端，取下滤片。将装填漏斗紧密地拧在柱子的开口端。使用 1/16 英寸接头和管路将一个空注射器（5 ml）连接到柱子的底部出口。确保其与保护柱之间密封，防止漏气。
3. 在漏斗顶部加入数滴浆状珠粒材料。拉动注射器活塞，将浆液从漏斗吸入保护柱中。继续向漏斗中添加浆状珠粒材料，并重复操作，直至保护柱完全填充珠粒材料。取下漏斗，将滤片和滤环放置在开口端，然后将柱帽紧密拧上。从另一端取下注射器。用堵头封闭保护柱的两端，以防止柱内材料干燥。

4. 氢交换质谱（HX-MS）系统的设置

1. 将捕获柱与高效液相色谱系统连接（图1）。使用含0.1%甲酸的溶剂，将泵A的流速设为0.4 ml/min，以平衡色谱柱。此时暂不连接胃蛋白酶柱和分析柱。
2. 校准质谱仪，并将高效液相色谱系统的出口与质谱仪的进样源连接。

5. 交换动态范围的测定

1. 制备超纯溶剂 A（含 0.1% 甲酸的水溶液）和超纯溶剂 B（含 0.1% 甲酸的乙腈溶液）；预混溶剂可商业购买。对 HPLC 泵进行排空。在控制软件中设置色谱和质谱方法，选择一个在短暂脱盐步骤后采用阶梯梯度的程序。对于全长 Hsp90，使用 1–2 分钟的脱盐步骤，随后将六通阀从 DESALT/LOAD 切换至 ELUTE 位置，并实施从 90% 溶剂 A / 10% 溶剂 B 到 5% 溶剂 A / 95% 溶剂 B 的阶梯梯度。进样前，将进样阀置于 LOAD 位置，六通阀置于 DESALT/LOADING 位置。
   注意：本实验中不得使用胃蛋白酶柱或分析柱。
2. 将 100–200 pmol 的 Hsp90 溶于 1–10 μl H₂O 缓冲液中，30 °C 孵育 10 分钟。加入温度已平衡的 D₂O 缓冲液，使样品体积达到 100 μl，并精确孵育一段定义的时间（例如 10 秒、100 秒、1,000 秒）。加入 100 μl 淬灭缓冲液，通过移液器上下吹打混合。使用 Hamilton 注射器将 200 μl 样品注入进样阀的进样口。启动色谱程序，并将进样阀切换至 INJECT 位置。2 分钟后，将六通阀从 DESALT/LOADING 切换至 ELUTE。至少重复三个时间点的操作。
3. 重复步骤 5.2，但在 30 °C 孵育 10 分钟前，向 Hsp90 样品中加入 2–3 倍过量的 Sti1。
4. 通过质谱软件对谱图进行去卷积，确定全长蛋白的分子质量。通过比较每次运行后（例如 10 秒、100 秒、1,000 秒）全长 Hsp90 的理论分子量与实测质量，计算掺入的氘代质子数。
5. 绘制 Hsp90 在无 Sti1 和有 Sti1 存在下掺入的氘代质子数（y 轴）随时间（x 轴）变化的曲线。确定在动态范围内两条曲线差异最大的时间点。在肽段水平上鉴定 Hsp90-Sti1 相互作用界面及动力学时，使用该时间点作为 D₂O 孵育的孵育时间。

6. 使用 MS/MS 谱图测定胃蛋白酶肽段

1. 将胃蛋白酶柱和分析柱连接到系统上。
2. 在控制软件中设置色谱和质谱参数，选择梯度类型和质谱方法。选择较长的梯度（例如 超过90分钟），以确保良好的色谱分辨率。在质谱仪上启用MS/MS谱图。
   注意： 此步骤中，HPLC的良好分辨率和高质谱准确性为最优先考虑因素。
3. 将100–200 pmol的Hsp90溶于100 μl H₂O缓冲液中。加入100 μl淬灭缓冲液，并通过上下吹打混匀。使用Hamilton注射器将200 μl样品注入进样阀的进样口。启动色谱程序，并将进样阀切换至“INJECT”位置。2分钟后，将六通阀从“DESALT/LOADING”切换至“ELUTE”位置。
   注意：若在HX-MS中需分析多个蛋白质（即 蛋白质-蛋白质相互作用界面），则每种蛋白质的肽段需单独确定。
4. 通过搜索数据库（例如 Mascot）鉴定Hsp90的胃蛋白消化肽段。
   注意：可使用自定义数据库，因为目标是尽可能多地鉴定胃蛋白消化肽段，且分析使用的是纯化后的蛋白质。需考虑样品纯度。
5. 重复此步骤，但不进行MS/MS检测，并采用实际HX实验所用的梯度。对于Hsp90和Sti1，使用从90%溶剂A/10%溶剂B到45%溶剂A/55%溶剂B的10分钟梯度。
   注意：梯度时间通常为5–15分钟，具体取决于样品复杂性和HX系统的性能参数。
6. 确定在步骤6.4中鉴定出的胃蛋白消化肽段在步骤6.5所用梯度下的保留时间，并创建一个包含以下信息的列表：1）肽段序列；2）肽段电荷态；3）保留时间。该列表将用于HX实验后各肽段的鉴定。
   注意：需注意，质荷比（m/z）差异较小、电荷态相同且保留时间相同的肽段可能引起鉴定歧义。

7. 蛋白质-蛋白质相互作用界面的鉴定

1. 在控制软件中设置梯度和质谱方法。使用10分钟线性梯度，从90%溶剂A/10%溶剂B逐渐变为45%溶剂A/55%溶剂B。载入一种优化用于检测300–1,500 m/z范围内质荷比的质谱方法，尽管大多数肽段的质荷比将低于1,000 m/z。将进样阀置于LOAD位置，六通阀置于LOADING/DESALTING位置。设置加载泵的流速为0.4 ml/min。
   注意梯度的长度和类型取决于样品，可能需要进行优化。较长的梯度可提高色谱分辨率，但由于反向交换会降低蛋白质中氘的掺入程度。所有待比较的实验所采用的方法必须保持一致。
2. 对于未交换的参照样品，在 100 μl H₂O缓冲液。加入100 μl预冷的淬灭缓冲液，轻轻吹吸混匀两次，将样品注入HPLC进样阀。立即启动色谱程序，并将进样阀切换至“进样”（INJECT）位置。2分钟后，将6通阀从“脱盐/上样”（DESALT/LOADING）切换至“洗脱”（ELUTE）位置。对Hsp90、Sti1分别以及蛋白混合物均需进行上述操作。
3. 准备20-100 pmol的Hsp90，溶于1-5 μl体积中。加入温度已调节的D₂O缓冲液将样品体积补至100 μl，并精确孵育一段定义的时间（例如 30 秒；构象动力学见 注意加入100 μl预冷的淬灭缓冲液，用移液器吹打混匀2次，迅速将200 μl样品注入HPLC进样阀。立即启动色谱程序，并将进样阀切换至“INJECT”位置。2分钟后，将六通阀从“DESALT/LOADING”切换至“ELUTE”位置。每种蛋白质需单独处理，以测定在无相互作用蛋白存在时各肽段的氘代掺入水平。
   注意研究构象变化动力学时，用 Hsp90 在 D 中不同的孵育时间重复实验₂O缓冲液。通过选择对数间隔的孵育时间，以覆盖较宽的时间尺度（例如 10 秒，30 秒，100 秒，300 秒，1,000 秒 等等。）。D₂O缓冲液和样品缓冲液必须完全相同，仅氢同位素不同。
4. 制备等量的100%对照样品（20–100 pmol），并加入D₂O缓冲液将样品体积调至100 μl。加入100 μl预冷的淬灭缓冲液，轻轻吹打混匀2次，迅速将200 μl样品注入高效液相色谱（HPLC）的进样阀。立即启动色谱程序，并将进样阀切换至“进样”（INJECT）位置。2分钟后，将六通阀从“脱盐/上样”（DESALT/LOADING）切换至“洗脱”（ELUTE）位置。
5. 为了确定Hsp90与Sti1的相互作用界面，需将Hsp90与至少2倍摩尔过量的Sti1混合，以使平衡向结合状态偏移（参见 注意）并在所需温度下孵育，直至复合物形成达到平衡。加入经温度调节的D₂O缓冲液补足样本体积至100 μl，并精确孵育指定时间（例如 30 秒）。加入 100 μl 冰冷的淬灭缓冲液，用移液器吹打混匀两次，迅速注入 HPLC 的进样阀。2 分钟后，将六通阀从脱盐/上样（DESALT/LOADING）位置切换至洗脱（ELUTE）位置。使用 20–100 pmol 的 Sti1 和过量的 Hsp90 重复该实验。
   注意：绝对浓度取决于相互作用的解离平衡常数。理想情况下，稀释至 D 后₂蛋白质过量添加的浓度应至少为10倍 K_D （对应于 >85%的低浓度蛋白质发生结合。
6. 使用合适的软件分析所获得的数据，并利用步骤中确定的保留时间 6.5 在分析中找到每种肽段。计算未交换蛋白质同位素分布的质心（步骤 7.2）以及HX实验（步骤 7.3).
   注意尽管发生氢氘交换的肽段同位素峰型与其未交换形式有所不同，但凭借对肽段电荷态的了解以及质谱仪的高质荷比精度，可轻松确定其质心。
7. 比较仅有靶蛋白及靶蛋白与过量结合伴侣存在时的氘掺入情况。此步骤可通过商业软件自动完成，或使用电子表格程序手动完成。100%对照样品的数值表示每条肽段的最大氢氘交换水平，可用于确定氘掺入量₂实验过程中因回交导致标签丢失。

结果

Hsp90 是酵母中的一种分子伴侣，属于 Hsp90 伴侣蛋白家族。它通过一个复杂的 ATP 酶循环，协助多种客户蛋白的后期折叠过程。高效的折叠需要客户蛋白从 Hsp70 转移，并与共伴侣蛋白 Sti1/Hop 相互作用。Sti1 可直接结合 Hsp90，并通过抑制 Hsp90 的 ATP 酶活性来促进客户蛋白的结合。最近，Hsp90 与 Sti1 的相互作用已通过氢氘交换质谱（HX-MS²³）进行了研究。本文展示了遵循上述方案所获得实验的代表性结果。

通过在平衡状态下用D标记蛋白质复合物，检测了蛋白质间的直接相互作用₂O，并比较Sti1肽在有无Hsp90存在下的质谱图。所得差异图谱如图所示。 图 5A （数据来自²³）。肽段从顶部到底部按N端起始方向排列。在Hsp90存在下，TPR2a和TPR2b中的多数肽段显示出强烈保护作用（ΔD值为负）。_+Hsp90 - D_Hsp90)，表明这些区域与Hsp90发生相互作用。TPR2a中的保护效应可从...

讨论

相互作用伙伴与蛋白质结合时，不可避免地会引起结合位点处溶剂可及性的变化。此外，许多蛋白质在结合过程中会发生动态的构象变化，这些变化会影响实际结合界面以外的其他区域。氢氘交换质谱法（HX-MS）是一种用于监测这些变化的可靠方法，甚至能够揭示其他技术难以覆盖的时间尺度上的蛋白质构象变化。

成功实施氢氘交换质谱（HX-MS）需把握三个关键点：1）优化的系统配置；2）精确的样品处理操作；3）在指认肽段谱图和解析结果时进行严谨的数据分析。

系统设置

由于质谱技术用于检测氘代标记在肽段中的掺入情况，因此HDX-MS（氢-氘交换质谱）在样品制备过程中需遵循相同的注意事项。在分析前应避免或去除干扰质谱检测的去垢剂、盐类及其他化合物。尽管HDX-MS可用于分析大型蛋白质复合物，但其更高的复杂性对肽段分离和质谱分析的质量提出了更高要求。色谱条件的优化是获得高质量数据的关键，包括选择高品质的有机溶剂、反相色谱材料，以及梯度和溶剂条件的优化。可在实验间或过夜使用有机溶剂清洗色谱柱，以降低背景信号。质谱...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
maXis QTOF	Bruker
nanoAcquity UPLC	Waters Corp.
Shimadzu 10AD-VP	Shimadzu
6-通道电动阀 EPC6W，带微型电动执行器	Valco	#EPC6W
进样阀（手动）	Rheodyne	#7725
Poros AL20 介质	Applied Biosystems	#1-6029-06
Poros R2	Applied Biosystems	#1-1118-02
胃蛋白酶	Sigma	#P6887	使用新鲜胃蛋白酶
微径管（1 mm）	IDEX	#C-128
微径管（2 mm）	IDEX	#C-130B
Acquity UPLC BEH C8 色谱柱	Waters Corp.	#186002876
恒温混匀仪	Eppendorf	#5355000.011
管路（多种直径）	IDEX
接头	IDEX	#PK-110 与 PK-100 配套使用