使用秀丽隐杆线虫作为模型系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

摘要

为了研究蛋白质稳态、应激和衰老之间的关系，我们以遗传可处理的后生动物秀丽隐杆线虫为模型系统，通过跟踪蛋白质功能障碍、蛋白质在细胞中的定位以及生物体、细胞和蛋白质水平的蛋白质稳定性来监测蛋白质折叠的变化。

摘要

蛋白质的折叠和组装对于蛋白质功能、细胞的长期健康和生物体的长寿至关重要。从历史上看，蛋白质折叠的功能和调节是在体外、分离的组织培养细胞和单细胞生物中研究的。最近的研究揭示了蛋白质稳态 （proteostasis）、新陈代谢、发育、衰老和温度感应之间的联系。这些发现导致了用于监测模型后生动物生物秀丽隐杆线虫中蛋白质折叠的新工具的开发。在我们的实验室中，我们将行为测定、成像和生化方法相结合，使用温度敏感或天然存在的亚稳态蛋白质作为折叠环境的传感器来监测蛋白质错误折叠。与特定蛋白质错误折叠相关的行为检测为蛋白质折叠提供了简单而强大的读数，从而可以快速筛选调节折叠的基因和条件。同样，这种错误折叠可能与细胞中的蛋白质错误定位有关。因此，监测蛋白质定位可以突出不同组织、不同发育阶段和面对不断变化的条件时发生的细胞折叠能力变化。最后，使用体外生化工具，我们可以直接监测蛋白质的稳定性和构象。因此，通过结合行为测定、成像和生化技术，我们能够分别以生物体、细胞和蛋白质的分辨率监测蛋白质错误折叠。

引言

蛋白质生物合成的各个步骤，如 mRNA 转录、加工和翻译，以及蛋白质折叠、易位和组装/拆卸，决定了依赖于细胞蛋白质质量控制机制的亚稳蛋白的负荷¹。因此，蛋白质质量控制机制的缺失或故障会导致各种类型细胞机制的功能下降和蛋白质错误折叠疾病的发作^2-7。当蛋白质折叠和清除机制的能力与亚稳态蛋白质的负载相平衡时，就会实现蛋白质稳态（蛋白质稳态），这种状态最终会阻止错误折叠的蛋白质在细胞内积累和聚集⁶。错误折叠蛋白的积累被认为是激活应激诱导转录因子（如热休克因子 （HSF-1））并导致细胞保护性应激反应激活的信号^6,8。

我们对后生动物中蛋白质稳态网络功能的理解主要来自体外重建研究以及对组织培养细胞和单细胞生物的观察⁹。例如，对预防和解决蛋白质损伤的分子伴侣的研究集中在伴侣介导的蛋白质折叠、解聚和易位机制的生化和细胞生物学研究^{上 10-13}。相比之下，关于在"正常"生长条件下和响应胁迫，后生动物不同细胞和组织中各种蛋白质稳态成分的综合功能的信息有限¹¹。在秀丽隐杆线虫中，细胞蛋白质量控制也可以非自主地调节细胞，实验表明感知温度的两个神经元的突变可以阻断热休克反应的激活并降低耐热性，这表明需要研究多细胞生物体中的蛋白质稳态调节1^4-17.然而，缺少的是关于蛋白质稳态网络（例如各种分子伴侣家族）如何在完整后生动物的组织中发挥作用以及这些网络在发育和衰老过程中的动态性的连贯图景。为了实现这一目标，需要可靠的传感器来监测活体动物的蛋白质组维持，以确定多细胞生物体在发育和衰老过程中不同细胞的蛋白抑力。

为了使给定的蛋白质作为细胞蛋白质稳态的传感器发挥作用，它必须对细胞折叠环境的变化做出反应，同时仅对细胞中不相关蛋白质的折叠产生最小干扰。为了探索生物体中细胞蛋白质稳态的维持和恢复，可以采用两种依赖于折叠传感器的互补方法。第一种依赖于设计的折叠传感器，基于实验鉴定的亚稳态蛋白质，这些蛋白质已知依赖于蛋白质稳态机制，例如萤火虫荧光素酶^18-20 或用 degron^21-24 标记的 GFP。在第二种方法中，追踪内源性亚稳态蛋白，例如对细胞环境增量变化做出反应的温度敏感 （ts） 或年龄依赖性聚集蛋白^25-27。设计的折叠传感器没有基本的生物学功能，但具有可通过强大的报告分析（如 GFP 标记蛋白）检测的优势，并且可以用于许多不同的细胞和动物模型¹⁸。然而，由于引入单个外来蛋白会影响折叠环境²⁷，因此这种多肽会使细胞蛋白质稳态机制过载。或者，设计的折叠传感器不是它们报告的细胞所固有的，可能不受细胞蛋白质稳态能力变化的影响。例如，一种 GFP 标记的蛋白酶体报告基因底物需要抑制 ~90% 的蛋白酶体才能检测到表型²³。相比之下，依赖于细胞蛋白质稳态机制的内源性亚稳态蛋白具有在细胞敏感性范围内的优势。然而，与此类蛋白质错误折叠相关的功能丧失也会影响细胞功能和生物体活力。在这里，我们将重点介绍内源性秀丽隐杆线虫折叠传感器的使用。

秀丽隐杆线虫是一种成熟的后生动物模型，用于研究发育和衰老，它利用许多保守的生物途径，可用于跟踪细胞中的蛋白质折叠，结合使用细胞生物学、生化和遗传方法。我们通过监测其表型、定位和稳定性的变化，将亚稳蛋白用作蛋白抑能力的探针。此外，可以通过简单的行为分析来研究各种蛋白质功能。同样，当细胞蛋白质质量控制网络无法适应细胞需求时，就会发生蛋白质的大量错误定位。使用荧光标记蛋白或通过免疫染色，可以很容易地在活体动物的细胞中观察蛋白质。最后，使用离体方法，可以监测蛋白质表达和稳定性。这允许快速简单地筛选行为和生理变化，并对蛋白质定位和稳定性进行深入分析，从而可以监测蛋白质稳态修饰剂。通过结合这些不同的方法，可以获得细胞蛋白质折叠环境的广泛视图。事实上，这种策略已成功用于监测秀丽隐杆线虫、酵母、组织培养物和细菌中的蛋白质稳态扰动^15,25-35。

方案

使用行为检测监测生物体内的蛋白质折叠

1. 同步动物进行行为检测

1. 遵循维持秀丽隐杆线虫³⁶ 的标准方法，包括培养基和板制备、食物制备和动物生长条件。仔细控制培养条件，包括温度 （15-25 °C）、种群规模和食物供应。丢弃任何显示细菌或真菌污染的板。
2. 挑选 15-30 个胚胎，将它们转移到新板中，并在实验期间在所需温度 （15-25 °C） 下生长。或者，将 10-20 只怀孕的成年猪放在一个盘子上，让它们产卵 30-60 分钟，然后将它们从盘子中取出。直接采摘胚胎和设定怀孕的成虫都会在年龄上产生一些变化（±6 小时）。为了减少这种可变性，要么在特定阶段挑选胚胎，例如逗号阶段，要么设置 10-20 个刚刚开始产卵的成年人（成年后的第 2 天）。尽可能通过漂白来避免同步，因为这种处理是有压力的并且会影响蛋白质稳态。
3. 挑选同步的动物，转移到检测板进行评分，然后丢弃。

2. 运动测定

挑选同步动物，并在所需的温度 （15-25 °C） 下转移到干净的板中进行运动评分。对于每个生物学重复，对 >20 只动物进行评分，并在每个实验条件下重复测定至少 3 次。使用 Wilcoxon Mann-Whitney 秩和检验可以比较两个独立的试验条件。

1. 为了检测轻度运动障碍，将 5-7 只动物一起放在干净的细菌草坪中心，让动物在平板上移动 2 分钟。这个时间间隔是根据 90% 的野生动物清除 1 厘米圆圈所需的时间确定的。
2. 将 2 分钟内未越过 1 厘米圆圈（例如，保持在距其设置点 1 厘米半径内）的动物数量计算为不协调。
3. 为了检测严重的运动障碍，将动物放在干净的细菌草坪上。
4. 在时间零 （t=0） 和 5 分钟后 （t=5） 再次拍摄几只动物。将 5 分钟后没有移动一个体长的动物评分为瘫痪。

3. 耐热

性

1. 挑选 >20 只同步动物并转移到含有 450 μl 热休克 （HS） 缓冲液的 24 孔板中（表 1）。对于每个生物学重复，对 >20 只动物进行评分，并在每个实验条件下重复测定至少 4 次。
2. 将 24 孔板转移到加热的浴槽中。HS 温度和持续时间在很大程度上取决于生长条件，尤其是培养温度。
3. 用 9 μl SYTOX 橙补充 HS 缓冲液。
4. 使用带有 TXR 滤光片的荧光立体镜监测染料摄取，对动物存活率进行评分。吸收染料的动物已经死亡。使用 Wilcoxon Mann-Whitney 秩和检验可以比较两个独立的试验条件。

使用免疫染色和标记蛋白监测特定细胞中的蛋白质折叠

4. 通过免疫染色监测蛋白质的定位

1. 在所需阶段，将至少 30 只动物转移到含有 M9 缓冲液³⁶ 的 Eppendorf 管中。
2. 通过执行短而低速的离心步骤（3,000 rpm/900 x g，2 分钟）并重悬，用 M9 缓冲液洗涤动物几次。
3. 将试管放在冰上几分钟以冷却。
4. 除去多余的液体并与 500 μl 冰冷的 4% 多聚甲醛溶液一起孵育（表 2）。需要针对检查的每种蛋白质校准孵育时间，在室温下应约为 5-30 分钟。也可以在 4 °C 下长时间孵育，但这可能会损害样品透化。
5. 通过离心（3,000 rpm，1-2 分钟），用 PBS-Tween （pH 7.2） 缓冲液洗涤固定的动物 3 次。动物可以在4°C的此阶段储存数周。
6. 通过离心（3,000 rpm，1-2 分钟）收集动物。
7. 在通风橱中，除去大部分上清液，并将沉淀重悬于 1 ml β-巯基乙醇 （β-ME） 溶液中（表 2）。
8. 在 37 °C 下孵育过夜，在章动器上轻轻摇动。
9. 在通风橱中，用 PBS-Tween （pH 7.2） 缓冲液洗涤动物 3 次。
将
10. 动物重悬于 50-100 μl PBS-Tween （pH 7.2） 中。动物可以在4°C的此阶段储存数周。
11. 通过离心（3,000 rpm，1-2 分钟）收集动物并去除大部分 PBS-Tween 缓冲液。
12. 向每个试管中加入 100-150 μl 胶原酶溶液，并在 37 °C 下强烈搅拌孵育（使用热混合器或振荡培养箱）。
在
13. 立体显微镜下经常检查动物，孵育 5 分钟后开始。当 20% 的动物破裂时，将试管放在冰上以终止反应。此步骤高度敏感！治疗的持续时间取决于固定条件，并且不同菌株之间可能有很大差异。长时间的孵化可能导致动物完全降解。必须针对所使用的每个酶批次校准条件，并应仔细监测降解。
14. 在 PBS-Tween （pH 7.2） 中洗涤动物两次，然后通过离心（3,000 rpm，1-2 分钟）收集动物并去除大部分 PBS-Tween 缓冲液。
15. 加入 1 ml AbA 溶液（表 2），并在室温下轻轻摇动孵育 1 小时。动物可以在4°C的此阶段储存数周。
16. 通过离心（3,000 rpm，1-2 分钟）收集动物，并重悬于 200 μl AbA 中。
17. 在 AbA 溶液中加入稀释至 1：100-1：1,000 的一抗，并在轻轻摇动下孵育。孵育的温度和持续时间可能因抗体而异，应针对检查的每种蛋白质进行校准。我们首先在室温下孵育过夜。
18. 通过离心（3,000 rpm，1-2 分钟）洗涤动物。
19. 加入 AbA 缓冲液 （1 ml） 并在室温下轻轻混合孵育 15-60 分钟。动物可以在4°C的此阶段储存数周。
20. 可选：样品也可以用荧光染料染色。为此，将染料（例如 DAPI （2 mg/ml） 或鬼笔环肽 （1：100））添加到 200 μl AbA 中，并在轻轻摇动下孵育长达 1 小时。此步骤可以在洗涤二抗的步骤之一中执行。
21. 重复步骤 4.18-4.19 将动物清洗 3 次。
22. 加入 100 μl AbA 和适当的荧光标记二抗，以 1：100 稀释。
23. 将样品盖好（或放在暗管中），并在室温下摇动孵育数小时。
24. 通过在 AbA 缓冲液 （1 ml） 中孵育，在室温下轻轻混合 15-60 分钟，然后离心（3,000 rpm，1-2 分钟），洗涤动物 3 次。动物可以在4°C的此阶段储存数周。
25. 要将动物安装在载玻片上，请除去所有液体并重悬于 10 μl 相同缓冲液中。
26. 切开移液器吸头的末端以避免动物脱落，并将 1-2 μl 样品转移到载玻片上。
27. 以 1：1 的比例添加封固剂。
28. 用盖玻片轻轻盖住载玻片，并用指甲油密封。如果不立即监测玻片，则可以将玻片在 -20 °C 下长时间储存。

5. 监测标记蛋白的定位

1. 在所需阶段，将至少 15 只动物收集到载玻片上的 10 ml M9 缓冲液滴中。
2. 使用"蠕虫镐"，将动物移入 10 ml 多聚甲醛溶液 （4%） 中（表 2）并等待所有动物停止移动（约 5 分钟）。
3. 使用"蠕虫镐"，将动物移入 2 ml M9 缓冲液和封固剂 （1：1） 中（表 2）。
4. 用盖玻片轻轻盖住动物，并用指甲油密封。

使用离体检测来监测蛋白质折叠和稳定性

6. 部分消化

1. 在微量离心管中使用 1-2 ml M9 缓冲液从 15 个板 （60 mm） 中洗涤动物。请注意，动物不应拥挤，并且在整个实验期间应提供足够的食物。
2. 通过离心（3,000 rpm，2 分钟）和重悬动物，用 M9 缓冲液洗涤动物几次。
3. 最后一次离心后，将动物重悬于 100 μl M9 缓冲液中。
4. 在液体 N₂ 中速冻。样品可储存在 -80 °C 下。
5. 使用冷冻杵和电动钻头（也可以使用手持式组织培养钻头），研磨样品。将样品放在冰上，避免过热。
6. 在立体显微镜下经常检查动物，以确定研磨是否完成。如果仍有完整的动物，请重复该过程。
7. 通过移液蠕虫提取物来估计体积。
8. 加入 1：1 比例的 （2x） 蠕虫裂解液（表 3）。 请勿使用任何类型的蛋白酶抑制剂。
9. 在冰上孵育 15 分钟。
10. 通过在预冷的离心机 （4 °C） 中离心（1,000 x g ，2 分钟）去除碎片。
11. 将上清液转移到干净的微量离心管中。样品可以直接使用或储存在 -80 °C 下。
12. 准备胰凝乳蛋白酶溶液（表 3）并保持在冰上直至使用。
13. 使用 Bradford 测定法测定总蛋白浓度。
14. 如有必要，稀释样品，使总蛋白浓度为 3-3.5 mg/ml。
15. 将胰凝乳蛋白酶溶液添加到总蛋白裂解物 （1：1,200） 中。
16. 为了确定孵育时间，将样品与胰凝乳蛋白酶孵育 60 分钟。在不同时间点（例如 0、5、20、40 和 60 分钟）从样品中取出 20 μl 等分试样，立即与 SDS 样品缓冲液混合，并在 96 °C 下煮沸 5 分钟。*或者，将样品与不同浓度的胰凝乳蛋白酶一起孵育，并在特定时间后加入 SDS 样品缓冲液并煮沸 5 分钟以终止反应在 96 °C 时。
17. 在 SDS-PAGE 凝胶上运行样品。
18. 使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析，以确定蛋白质的相对稳定性。
19. 确定显示样品之间显着变化的最佳条件（胰凝乳蛋白酶浓度和消化时间），并将这些条件用于未来的实验。
20. 使用光密度测定软件（如 NIH 图像凝胶模块）确定不同消化产物（低分子量片段）的强度。

结果

受损的折叠环境会导致蛋白质错误折叠和聚集。蛋白质错误折叠与构象改变有关，并导致蛋白质功能丧失。我们使用互补方法来监测完整动物、特定细胞和蛋白质提取物中的蛋白质折叠和功能。基于与已知不稳定突变相关的强烈行为和细胞表型，智能选择折叠传感器可用于监测蛋白质折叠环境的变化。内源性温度敏感突变蛋白的一个例子是肌肉细丝蛋白副肌球蛋白 （C. elegans UNC-15） 中的 L799F 突变³⁷。错义突变会影响卷曲-螺旋相互作用，使得副肌球蛋白 （ts） 在限制温度下错误折叠并定位到旁结晶组件而不是肌肉肌节。这种错误定位会破坏粗丝的形成，并导致胚胎和早期幼虫因温度而致死，并导致成虫的运动缺陷²⁷。同样，在内吞蛋白动力蛋白 （C. elegans DYN-1） 中表达 P70S 突变的动物在与突变蛋白错误折叠相关的各种细胞类型中表现出温度依赖性内吞缺陷^28,38。因此，我们可以通过监测亚稳态蛋白的功能、定位和构象来监测蛋白质稳态调节的变化。

使用行为检测监测生物体内的蛋白质折叠

讨论

细胞蛋白质稳态能力探针必须对折叠环境的变化高度敏感，并且易于监测，以便实时评估蛋白质折叠质量控制能力。使用亚稳态蛋白作为蛋白质稳态能力的探针，我们监测了表型、亚细胞蛋白定位和蛋白质构象的变化。这里介绍的方案侧重于肌肉蛋白质相关表型，包括运动性、肌丝组织和肌球蛋白稳定性。然而，可以修改这些协议以监测其他折叠传感器。对于行为表型，设计一种简单而稳健的测定方法来确定生物体水平的蛋白质功能非常重要。例如， dyn-1 中的 ts 突变导致在限制性条件下内吞作用和突触小泡循环的快速丧失。因此，可以通过吸收分泌到体腔液中的GFP或分别通过用GFP（SNB-1：：GFP）标记的突触蛋白突触蛋白突触-1来监测腔细胞和神经元中的动力蛋白功能²⁸。同样，线粒体复合物I蛋白GAS-1的功能可以通过监测动物对乙醇的敏感性来检查²⁸。 秀丽隐杆线虫 中的许多基因按其表型分类，并与易于监测的简单行为读数相关。然而，确定基因表达的时间和地点非常重要，因为其表达模式将直接影响其作为折叠传感器的能力。

热阻是监测蛋白质稳态的公认方法

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗体染色和离子	多聚甲醛	Merc	8187151000
Tween-20	Bio-Rad	1706531
胶原酶		Sigma C5138-100MG
DABCO	Merc	8034560100
Triton X-100	Alfa	Aesar A16046
β -ME	Sigma	8057400250
BSA	Di Cam	000-40-100
部分摘要	胰凝乳蛋白酶	Sigma	C4129-250MG
耐热	SYTOX Orange	Invitrogen	S11368
胆固醇	Amaresco	0433-250G
设备
M165 FC 荧光立体镜	徕卡		TXR 滤光片
EXi 蓝色荧光显微镜 相机	QI成像	EXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META 共聚焦显微镜	蔡司
颗粒杵	Sigma	Z359947-100EA
颗粒杵 无绳电机	Kontes	K749540-0000
MicroCL 17 微量离心机系列	热	75002455	冷冻型， ， 230 V 50/60 Hz， 包括 24 个 1.5/2.0 ml 转头，带 ClickSeal 生物安全密封盖