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方法文章

使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态

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DOI：

10.3791/50840

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2013年12月18日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Life Sciences, National Institute for Biotechnology in the Negev, Ben-Gurion University of the Negev

本文内容

摘要

为了研究蛋白质稳态、应激与衰老之间的关系，我们利用遗传操作简便的多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）作为模式系统，在个体、细胞和蛋白质水平上，通过监测蛋白质功能障碍、细胞内蛋白质定位以及蛋白质稳定性，来追踪蛋白质折叠状态的变化。

摘要

蛋白质的折叠与组装对于蛋白质功能、细胞的长期健康以及生物体的寿命至关重要。历史上，蛋白质折叠的功能与调控主要在体外（in vitro）、分离的组织培养细胞以及单细胞生物中进行研究。近年来的研究揭示了蛋白质稳态（蛋白质稳态，proteostasis）、代谢、发育、衰老以及温度感知之间的关联。这些发现推动了用于监测模式多细胞生物秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中蛋白质折叠的新工具的发展。在我们的实验室中，我们结合行为学检测、成像技术和生化方法，利用温度敏感型或天然存在的亚稳态蛋白质作为折叠环境的传感器，来监测蛋白质的错误折叠。与特定蛋白质错误折叠相关的行为学检测提供了简单而强大的读出方式，可用于快速筛选调控折叠的基因和条件。同样，此类错误折叠可能伴随蛋白质在细胞内的异常定位。因此，监测蛋白质定位可以揭示不同组织、发育各个阶段以及环境条件变化时细胞折叠能力的变化。最后，通过在离体（ex vivo）条件下使用生化工具，我们可以直接监测蛋白质的稳定性和构象。因此，通过结合行为学检测、成像技术和生化技术，我们能够分别在生物体、细胞和蛋白质水平上对蛋白质错误折叠进行监测。

引言

mRNA转录、加工和翻译，以及蛋白质折叠、转运和组装/解聚等蛋白质生物合成各步骤之间的相互作用，决定了依赖细胞蛋白质质量控制机制才能发挥功能的不稳定蛋白质的负荷水平1。因此，蛋白质质量控制机制的缺失或功能障碍可能导致多种细胞机器功能下降，并引发蛋白质错误折叠相关疾病2-7。当蛋白质折叠与清除机制的能力与不稳定蛋白质的负荷达到平衡时，即可实现蛋白质稳态（proteostasis），这种状态最终可防止错误折叠蛋白在细胞内积聚和形成聚集体6。错误折叠蛋白的积聚被认为是一种激活应激诱导型转录因子（如热休克因子HSF-1）的信号，并由此引发细胞保护性应激反应6,8。

我们对多细胞动物中蛋白质稳态网络功能的理解主要来源于 体外 重组研究以及利用组织培养细胞和单细胞生物所进行的观察9例如，关于可防止和修复蛋白质损伤的分子伴侣的研究，主要集中于分子伴侣介导的蛋白质折叠、去聚集及转位机制的生物化学与细胞生物学研究10-13相比之下，关于多细胞动物不同细胞和组织中各种蛋白质稳态组分的整合功能，目前可获得的信息仍然十分有限 "正常" 生长条件及应激反应11. 在发现 秀丽隐杆线虫， 细胞蛋白质质量控制也可通过非细胞自主的方式进行调控，这一点在实验中得到体现：感知温度的两个神经元发生突变时，可阻断热休克反应的激活并降低耐热性，表明有必要在多细胞生物体中研究蛋白质稳态的调控机制14-17然而，目前尚缺乏一个整体性的图景，来阐明蛋白质稳态网络（如各种分子伴侣家族）在完整多细胞动物组织中的功能机制，以及这些网络在发育和衰老过程中的动态变化。为实现这一目标，需要可靠的传感器来监测活体动物中的蛋白质组维持情况，从而确定多细胞生物在发育和衰老过程中不同细胞的蛋白质稳态能力。

一种蛋白质若要作为细胞蛋白质稳态的传感器，必须能够响应细胞折叠环境的变化，同时对细胞内无关蛋白质的折叠过程产生尽可能小的干扰。为了研究活体生物中细胞蛋白质稳态的维持与恢复，可采用两种依赖于折叠传感器的互补方法。第一种方法基于设计的折叠传感器，这些传感器来源于实验鉴定出的不稳定蛋白，已知其依赖于蛋白质稳态调控系统，例如萤火虫荧光素酶18-20或带有降解子标签的GFP21-24。第二种方法则是追踪内源性的不稳定蛋白，例如对细胞环境渐变响应的温度敏感型（ts）蛋白或随年龄增长而聚集的蛋白25-27。设计的折叠传感器本身不具备重要的生物学功能，但其优势在于可通过强大的报告检测手段（如GFP标记蛋白）进行检测，并可广泛应用于多种不同的细胞和动物模型18。然而，由于引入单一外源蛋白可能影响细胞的折叠环境27，这类多肽可能加重细胞蛋白质稳态系统的负担。此外，非细胞天然存在的设计型折叠传感器可能无法反映细胞蛋白质稳态能力的真实变化。例如，一种GFP标记的蛋白酶体报告底物需要抑制约90%的蛋白酶体活性才能观察到表型变化23。相比之下，依赖细胞自身蛋白质稳态系统的内源性不稳定蛋白具有更符合细胞敏感范围的优势。但此类蛋白发生错误折叠所导致的功能丧失也可能影响细胞功能和生物体的存活能力。本文将重点介绍内源性C. elegans折叠传感器的应用。

C. elegans 是研究发育和衰老的成熟多细胞动物模型，其利用多种保守的生物学通路，可通过细胞生物学、生物化学和遗传学方法相结合的方式，在细胞内追踪蛋白质折叠过程。我们采用亚稳态蛋白质作为探针，通过监测其表型、定位和稳定性的变化，来评估蛋白质稳态能力。此外，通过简单的动物行为分析，还可研究多种蛋白质功能。同样，当细胞内的蛋白质质量控制网络无法适应细胞需求时，会发生显著的蛋白质错误定位。利用荧光标记蛋白或免疫染色技术，可轻松在活体动物的细胞中实现蛋白质的可视化观察。最后，通过ex vivo（离体）方法，能够监测蛋白质的表达水平和稳定性。这使得行为学和生理学变化的快速、简便筛选成为可能，并可进一步深入分析蛋白质的定位与稳定性，从而实现对蛋白质稳态调节因子的监测。通过整合这些不同方法，可以获得关于细胞内蛋白质折叠环境的全面视图。事实上，该策略已成功应用于监测C. elegans、酵母、组织培养细胞及细菌中的蛋白质稳态紊乱15,25-35。

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方案

利用行为分析法在活体生物中监测蛋白质折叠

1. 行为检测中动物的同步化处理

  1. 遵循标准方法进行维护 秀丽隐杆线虫36包括培养基和培养皿的制备、食物制备以及动物生长条件。严格控制培养条件，包括温度（15–25 °C）、种群数量和食物供应。若培养皿出现细菌或真菌污染，应立即弃用。
  2. 挑选15-30个胚胎，转移至新培养板中，在实验所需温度（15-25 °C）下培养至实验结束。或者，将10-20只性成熟雌虫置于培养板上，让其产卵30-60分钟，随后移除成虫。直接挑选胚胎或利用性成熟雌虫产卵所获得的胚胎在年龄上均存在一定变异（±6小时）。为减少此变异，可选择特定发育阶段（如逗号期）的胚胎进行挑选，或选用刚进入产卵期（成虫第2天）的10-20只成虫进行产卵。应尽可能避免使用漂白法同步化，因该处理具有应激性，可能影响蛋白质稳态。
  3. 挑选同步化的动物，转移至检测平板进行评分，然后弃去。

2. 运动能力检测

挑选同步发育的动物，转移至洁净培养皿中，并在所需温度（15–25 °C）下放置以进行运动评分。每个生物学重复均需进行评分 >20 只动物，并在每种实验条件下至少重复检测 3 次。使用 Wilcoxon-Mann-Whitney 秩和检验比较两种独立的实验条件。

  1. 为检测轻度运动障碍，将5-7只动物置于干净细菌菌苔的中心，让动物在培养皿上移动2分钟。该时间间隔的确定依据是野生型动物中有90%能够离开直径1厘米圆圈所需的时间。
  2. 在2分钟内未能离开直径1厘米圆圈（例如，仍停留在初始放置点1厘米半径范围内的）动物记为运动不协调。
  3. 为检测重度运动障碍，将动物置于干净的细菌菌苔上。
  4. 在时间零点（t=0）拍摄若干动物的照片，5分钟后（t=5）再次拍摄。若动物在5分钟内未移动一个体长，则记为瘫痪。

3. 耐热性

  1. 挑选 >20 条同步化的动物个体，转移至含有 450 µl 热激（HS）缓冲液（表 1）的 24 孔板中。每个生物学重复需评估 >20 条动物，并在每种实验条件下至少重复检测 4 次。
  2. 将 24 孔板放入预热的水浴中。热激的温度和持续时间强烈依赖于培养条件，尤其是培养温度。
  3. 向热激缓冲液中加入 9 µl SYTOX orange 染料。
  4. 通过荧光体视显微镜配合 TXR 滤光片观察染料摄入情况，以评估动物存活状态。摄入染料的个体视为死亡。使用 Wilcoxon-Mann-Whitney 秩和检验来比较两个独立的实验条件。

利用免疫染色和标记蛋白来监测特定细胞中的蛋白质折叠

4. 通过免疫染色监测蛋白质的定位

  1. 在所需阶段，将至少30只动物转移至含有M9缓冲液的Eppendorf管中36.
  2. 用M9缓冲液对动物进行数次清洗，每次清洗时进行短时低速离心（3,000 rpm/900 x g，2 min），然后重新悬浮。
  3. 将试管置于冰上几分钟以冷却。
  4. 去除多余液体，加入 500 µl 冰冷的 4% 多聚甲醛溶液，孵育表 2孵育时间需针对每种检测的蛋白质进行校准，通常在室温下约为5-30分钟。也可在4 °C下延长孵育时间，但可能会影响样本的通透性。
  5. 用 PBS-Tween（pH 7.2）缓冲液通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）洗涤固定后的动物样本 3 次。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。
  6. 通过离心收集动物样本（3,000 rpm，1–2 分钟）。
  7. 在通风橱中，除去大部分上清液，并将沉淀重悬于 1 ml β-巯基乙醇（β-ME）溶液中（表2).
  8. 在37 °C下孵育过夜，同时在旋转摇床（nutator）上轻轻摇动。
  9. 在通风橱中，用 PBS-Tween（pH 7.2）缓冲液将样品洗涤 3 次。
  10. 将动物重悬于50-100 µl中 PBS-吐温（pH 7.2） 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。
  11. 通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）收集动物样本，并移除大部分 PBS-Tween 缓冲液。
  12. 加入 100–150 µl 向每管中加入胶原酶溶液，并在37 °C下剧烈振荡孵育（使用Thermo-mixer或摇床培养箱）。
  13. 从孵育5分钟后开始，定期在体视显微镜下观察动物。当20%的动物发生破裂时，将试管置于冰上以终止反应。 此步骤极为敏感！处理时间取决于固定条件，且不同品系间可能存在较大差异。孵育时间过长可能导致动物样本完全降解。必须针对每批使用的酶进行条件优化，并密切监测降解情况。
  14. 用 PBS-Tween（pH 7.2）洗涤动物样本两次，然后通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）收集样本，并移除大部分 PBS-Tween 缓冲液。
  15. 加入 1 ml AbA 溶液（表 2）并在室温下轻轻振荡孵育1小时。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。
  16. 通过离心（3,000 rpm，1–2 min）收集动物，并重悬于 200 μl 中 AbA
  17. 加入用 AbA 溶液按 1:100–1:1,000 稀释的一抗，轻轻振荡孵育。孵育的温度和时间因抗体而异，应针对每种检测的蛋白进行优化。我们通常在室温下孵育过夜。
  18. 通过离心（3,000 rpm，1–2 分钟）洗涤动物样品。
  19. 加入AbA缓冲液（1 ml），室温下轻柔混匀孵育15–60分钟。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。
  20. 可选： 样品也可用荧光染料染色。操作时，加入染料（例如 DAPI（2 mg/ml）或鬼笔环肽（Phalloidin，1:100）加入至200 μl AbA中，轻轻振荡孵育最长1小时。此步骤可在洗涤二抗的某个步骤期间进行。
  21. 用步骤 4.18–4.19 重复洗涤动物 3 次。
  22. 加入 100 μl AbA 与相应荧光标记的二抗按 1:100 稀释。
  23. 保持样品避光（或置于暗管中），室温下振荡孵育数小时。
  24. 用 AbA 缓冲液（1 ml）在室温下轻柔混匀孵育 15–60 分钟，随后离心（3,000 rpm，1–2 分钟），重复洗涤动物 3 次。 动物在此阶段可在 4 °C 下保存数周。
  25. 将动物样本从液体中取出，去除所有液体后，重悬于 10 μl 溶液中 相同的缓冲液。
  26. 剪切移液器吸头末端，以避免损伤动物，转移 1-2 μl 将样品加到载玻片上。
  27. 以1:1的比例加入封片介质。
  28. 盖上盖玻片 轻柔地 用盖玻片封片，并用指甲油密封。如果玻片不能立即观察，应将 载玻片可在 -20 °C 长期保存.

5. 监测标记蛋白的定位

  1. 在所需阶段，将至少15只动物收集到载玻片上10 ml 的M9缓冲液液滴中。
  2. 使用"线虫挑取工具"，将动物转移至10 ml 的4% 甲醛溶液液滴中（表2），并等待所有动物停止活动（约 5分钟）。
  3. 使用"线虫挑取工具"，将动物转移至2 ml 的M9缓冲液与封片介质（1:1）混合液滴中（表2）。
  4. 轻轻盖上盖玻片，并用指甲油密封。

利用离体实验监测蛋白质折叠与稳定性

6. 部分消化

  1. 用1-2 ml液体洗涤15个培养皿（60 mm）中的样品 在微量离心管中加入M9缓冲液。请注意，实验过程中应避免动物过于拥挤，并确保始终提供充足的食物。
  2. 用M9缓冲液将动物洗涤数次，每次通过离心（3,000 rpm，2 min）并重悬动物。
  3. 最后一次离心后，将动物重悬于100 μl M9缓冲液中。
  4. 液氮速冻2. 样品可在 -80 °C 下保存。
  5. 使用预冷的研钵和电动钻（也可使用手持式组织培养钻）研磨样品。 将样品置于冰上保存，并避免过热.
  6. 经常在体视显微镜下检查动物，以确定研磨是否完全。若仍有完整的动物个体，需重复该步骤。
  7. 通过移液法估测线虫提取物体积。
  8. 加入等体积的（2倍浓度）线虫裂解液（表3). 不要使用任何类型的蛋白酶抑制剂。
  9. 冰上孵育15分钟。
  10. 在预冷的离心机（4 °C）中离心去除碎片（1,000 x g，2 分钟）。
  11. 将上清液转移至干净的微量离心管中。 样品可直接使用或于 -80 °C 保存。
  12. 制备胰凝乳蛋白酶溶液（表3）并置于冰上保存直至使用。
  13. 使用Bradford法测定总蛋白浓度。
  14. 必要时稀释样品，使总蛋白浓度为3-3.5 mg/ml。
  15. 将胰蛋白酶溶液按1:1,200的比例加入总蛋白裂解液中。
  16. 为确定孵育时间，将样品与胰凝乳蛋白酶共同孵育60分钟。在不同时间点从样品中取出20 μl等分试样（例如 0、5、20、40 和 60 分钟），立即与 SDS 样品缓冲液混合，并在 96 °C 下煮沸 5 分钟。*或者，将样品与不同浓度的胰凝乳蛋白酶孵育，并在特定时间后加入 SDS 样品缓冲液，于 96 °C 煮沸 5 分钟以终止反应。
  17. 在SDS-PAGE凝胶上电泳样品。
  18. 使用适当的抗体进行蛋白质印迹分析，以确定该蛋白质的相对稳定性。
  19. 确定能够显示样本间显著差异的最优条件（胰凝乳蛋白酶浓度和消化时间），并在后续实验中采用这些条件。
  20. 使用密度测定软件（如 NIH Image 凝胶分析模块）确定不同消化产物（较低分子量片段）的强度。

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结果

折叠环境的受损可能导致蛋白质错误折叠和聚集。蛋白质错误折叠与构象改变相关，并导致蛋白质功能的丧失。我们采用互补的方法来监测完整动物、特定细胞及蛋白质提取物中的蛋白质折叠与功能。基于已知的不稳定突变所引起的显著行为和细胞表型，合理选择折叠传感器，可用于监测蛋白质折叠环境的变化。一个内源性温度敏感型突变蛋白的例子是粗肌丝蛋白副肌球蛋白（C. elegans UNC-15）中的L799F突变37。该错义突变影响卷曲螺旋相互作用，导致副肌球蛋白(ts)在限制性温度下错误折叠，并错误定位至旁晶状结构，而非正常定位于肌节。这种错误定位会破坏粗肌丝的形成，导致温度依赖性的胚胎和早期幼虫致死，以及成虫运动缺陷27。同样，表达内吞蛋白动力蛋白（C. elegans DYN-1）P70S突变的动物，在多种细胞类型中表现出温度依赖性的内吞缺陷，这与突变蛋白的错误折叠相关28,38。因此，我们可以通过监测不稳定蛋白质的功能、定位和构象来评估蛋白质稳态调控的变化。

利用行为分析法在活体生物中监测蛋白质折叠

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讨论

对细胞蛋白质稳态能力的探针必须对折叠环境的变化高度敏感，并且易于监测，以便实时评估蛋白质折叠质量控制能力。我们利用亚稳态蛋白质作为蛋白质稳态能力的探针，监测了表型、亚细胞蛋白质定位以及蛋白质构象的变化。 本文所介绍的实验方案主要聚焦于与肌肉蛋白质相关的表型，包括运动能力、肌丝结构组织以及肌球蛋白的稳定性。然而，这些方案也可经修改后用于监测其他折叠传感器。对于行为学表型，重要的是设计一种简单且稳健的检测方法，以在整体生物水平上确定蛋白质功能。例如，dyn-1 基因的温度敏感突变（ts突变）在限制性条件下会导致内吞作用和突触小泡循环的迅速丧失。因此，可通过检测体腔液中分泌的GFP的摄取情况，或通过检测与GFP标记的突触蛋白SNB-1::GFP（synaptobrevin-1）的定位，分别监测dynamin在体腔细胞和神经元中的功能28。同样，通过监测线虫对乙醇的敏感性，可评估线粒体复合物I蛋白GAS-1的功能28。在C. elegans中，许多基因根据其表型进行分类，并与简单的行为学读数相关联，这些读数易于观察。然而，识别基因在何时何地表达至关重要，因...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究所使用的所有线虫品系均由由美国国立卫生研究院（NIH）研究资源国家中心（NCRR）资助的秀丽隐杆线虫遗传学中心提供。由H.F. Epstein开发的单克隆抗体购自发育研究杂交瘤库，该库在NICHD的主持下建立，并由爱荷华大学生物学系维护。N. Shemesh获得了Fay和Bert Harbour奖项的支持。A.B.-Z.获得了以色列高等教育委员会Alon奖学金、玛丽·居里国际回归基金以及美国-以色列双边科学基金会和以色列科学基金会（项目编号91/11）资助项目的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
抗体染色与固定多聚甲醛Merc8187151000
Tween-20 Bio-Rad1706531
胶原酶SigmaC5138-100MG
DABCOMerc8034560100
Triton X-100Alfa AesarA16046
β-MESigma8057400250
BSADi Cam000-40-100
 部分消化 胰凝乳蛋白酶SigmaC4129-250MG
耐热性检测SYTOX OrangeInvitrogenS11368
胆固醇Amaresco0433-250G
仪器设备
M165 FC 荧光体视显微镜LeicaTXR 滤光片
EXi Blue 荧光显微成像相机QImagingEXI-BLU-R-F-M-14-C
ConfoCor 3/510 META 共聚焦显微镜Zeiss
研磨杵SigmaZ359947-100EA
无绳电动研磨杵马达KontesK749540-0000
MicroCL 17 微型离心机系列Thermo75002455制冷型，230 V 50/60 Hz，配备 24×1.5/2.0 ml 转子及 ClickSeal 生物密封盖

参考文献

  1. Balch, W. E., Morimoto, R. I., Dillin, A., Kelly, J. W. Adapting proteostasis for disease intervention. Science. 319, 916-919 (2008).
  2. Arias, E., Cuervo, A. M. Chaperone-mediated autophagy in protein quality control. Curr. Opin. Cell. Biol. 23, 184-189 (2011).
  3. Tyedmers, J., Mogk, A., Bukau, B. Cellular strategies for controlling protein aggregation. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 11, 777-788 (2010).
  4. Walter, P., Ron, D. The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science. 334, 1081-1086 (2011).
  5. Finley, D. Recognition and processing of ubiquitin-protein conjugates by the proteasome. Annu. Rev. Biochem. 78, 477-513 (2009).
  6. Gidalevitz, T., Prahlad, V., Morimoto, R. I. The stress of protein misfolding: from single cells to multicellular organisms. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3, (2011).
  7. Haynes, C. M., Ron, D. The mitochondrial UPR - protecting organelle protein homeostasis. J. Cell. Sci. 123, 3849-3855 (2010).
  8. Akerfelt, M., Morimoto, R. I., Sistonen, L. Heat shock factors: integrators of cell stress, development and lifespan. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol.. 11, 545-555 (2010).
  9. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Integrating the stress response: lessons for neurodegenerative diseases from C. elegans. Trends Cell. Biol. 19, 52-61 (2009).
  10. Li, J., Soroka, J., Buchner, J. The Hsp90 chaperone machinery: conformational dynamics and regulation by co-chaperones. Biochim. Biophys. Acta. 1823, 624-635 (2012).
  11. Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. Molecular chaperones in protein folding and proteostasis. Nature. 475, 324-332 (2011).
  12. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation. J. Struct. Biol. 179, 152-160 (2012).
  13. Mayer, M. P. Gymnastics of molecular chaperones. Mol. Cell. 39, 321-331 (2010).
  14. Durieux, J., Wolff, S., Dillin, A. The cell-non-autonomous nature of electron transport chain-mediated longevity. Cell. 144, 79-91 (2011).
  15. Garcia, S. M., Casanueva, M. O., Silva, M. C., Amaral, M. D., Morimoto, R. I. Neuronal signaling modulates protein homeostasis in Caenorhabditis elegans post-synaptic muscle cells. Genes Dev. 21, 3006-3016 (2007).
  16. Prahlad, V., Cornelius, T., Morimoto, R. I. Regulation of the cellular heat shock response in Caenorhabditis elegans by thermosensory neurons. Science. 320, 811-814 (2008).
  17. Bar-Lavan, Y., Kosolapov, L., Frumkin, A., Ben-Zvi, A. Regulation of cellular protein quality control networks in a multicellular organism. FEBS J. 279, 526-531 (2012).
  18. Gupta, R., et al. Firefly luciferase mutants as sensors of proteome stress. Nat. Methods. 8, 879-884 (2011).
  19. Rampelt, H., et al. Metazoan Hsp70 machines use Hsp110 to power protein disaggregation. EMBO J. 31, 4221-4235 (2012).
  20. Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. Hsp70 targets Hsp100 chaperones to substrates for protein disaggregation and prion fragmentation. J. Cell. Biol. 198, 387-404 (2012).
  21. Kim, Y. I., Burton, R. E., Burton, B. M., Sauer, R. T., Baker, T. A. Dynamics of substrate denaturation and translocation by the ClpXP degradation machine. Mol. Cell. 5, 639-648 (2000).
  22. Hamer, G., Matilainen, O., Holmberg, C. I. A photoconvertible reporter of the ubiquitin-proteasome system in vivo. Nat. Methods. 7, 473-478 (2010).
  23. Bence, N. F., Sampat, R. M., Kopito, R. R. Impairment of the ubiquitin-proteasome system by protein aggregation. Science. 292, 1552-1555 (2001).
  24. Dantuma, N. P., Lindsten, K., Glas, R., Jellne, M., Masucci, M. G. Short-lived green fluorescent proteins for quantifying ubiquitin/proteasome-dependent proteolysis in living cells. Nat. Biotechnol. 18, 538-543 (2000).
  25. Brown, C. R., Hong-Brown, L. Q., Welch, W. J. Correcting temperature-sensitive protein folding defects. J. Clin. Invest. 99, 1432-1444 (1997).
  26. Van Dyk, T. K., Gatenby, A. A., LaRossa, R. A. Demonstration by genetic suppression of interaction of GroE products with many proteins. Nature. 342, 451-453 (1989).
  27. Gidalevitz, T., Ben-Zvi, A., Ho, K. H., Brignull, H. R., Morimoto, R. I. Progressive disruption of cellular protein folding in models of polyglutamine diseases. Science. 311, 1471-1474 (2006).
  28. Ben-Zvi, A., Miller, E. A., Morimoto, R. I. Collapse of proteostasis represents an early molecular event in Caenorhabditis elegans aging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 14914-14919 (2009).
  29. Burkewitz, K., Choe, K., Strange, K. Hypertonic stress induces rapid and widespread protein damage in. C. elegans. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 301, 566-576 (2011).
  30. Alavez, S., Vantipalli, M. C., Zucker, D. J., Klang, I. M., Lithgow, G. J. Amyloid-binding compounds maintain protein homeostasis during ageing and extend lifespan. Nature. 472, 226-229 (2011).
  31. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in C. elegans. PLoS Biol. 8, (2010).
  32. Eremenko, E., Ben-Zvi, A., Morozova-Roche, L. A., Raveh, D. Aggregation of human S100A8 and S100A9 amyloidogenic proteins perturbs proteostasis in a yeast model. PLoS One. In press, (2013).
  33. Gidalevitz, T., Krupinski, T., Garcia, S. M., Morimoto, R. I. Destabilizing protein polymorphisms in the genetic background direct phenotypic expression of mutant SOD1 toxicity. PLoS Genet. 5, (2009).
  34. Silva, M. C., et al. A genetic screening strategy identifies novel regulators of the proteostasis network. PLoS Genet.. 7, (2011).
  35. Prahlad, V., Morimoto, R. I. Neuronal circuitry regulates the response of Caenorhabditis elegans to misfolded proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 14204-14209 (2011).
  36. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook. , 1-11 (2006).
  37. Gengyo-Ando, K., Kagawa, H. Single charge change on the helical surface of the paramyosin rod dramatically disrupts thick filament assembly in Caenorhabditis elegans. J. Mol. Biol. 219, 429-441 (1991).
  38. Clark, S. G., Shurland, D. L., Meyerowitz, E. M., Bargmann, C. I., vander Bliek, A. M. A dynamin GTPase mutation causes a rapid and reversible temperature-inducible locomotion defect in C. elegans. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 94, 10438-10443 (1997).
  39. Hsu, A. L., Murphy, C. T., Kenyon, C. Regulation of aging and age-related disease by DAF-16 and heat-shock factor. Science. 300, 1142-1145 (2003).
  40. Morley, J. F., Morimoto, R. I. Regulation of longevity in Caenorhabditis elegans by heat shock factor and molecular chaperones. Mol. Biol. Cell. 15, 657-664 (2004).
  41. Morimoto, R. I. Proteotoxic stress and inducible chaperone networks in neurodegenerative disease and aging. Genes Dev. 22, 1427-1438 (2008).
  42. Taylor, R. C., Dillin, A. Aging as an event of proteostasis collapse. Cold Spring Harb. Perspect. Biol.. 3, (2011).
  43. Tissenbaum, H. A. Genetics, Life Span, Health Span, and the Aging Process in Caenorhabditis elegans. J. Gerontol. A. Biological Sci. Med. Sci. 67, 503-510 (2012).
  44. Hosono, R., Mitsui, Y., Sato, Y., Aizawa, S., Miwa, J. Life span of the wild and mutant nematode Caenorhabditis elegans. Effects of sex, sterilization, and temperature. Exp. Gerontol. 17, 163-172 (1982).
  45. Madi, A., et al. Mass spectrometric proteome analysis for profiling temperature-dependent changes of protein expression in wild-type Caenorhabditis elegans. Proteomics. 3, 1526-1534 (2003).
  46. Herndon, L. A., et al. Stochastic and genetic factors influence tissue-specific decline in ageing C. elegans. Nature. 419, 808-814 (2002).
  47. Barral, J. M., Hutagalung, A. H., Brinker, A., Hartl, F. U., Epstein, H. F. Role of the myosin assembly protein UNC-45 as a molecular chaperone for myosin. Science. 295, 669-671 (2002).
  48. Melkani, G. C., Bodmer, R., Ocorr, K., Bernstein, S. I. The UNC-45 chaperone is critical for establishing myosin-based myofibrillar organization and cardiac contractility in the Drosophila heart model. PLoS One. 6, (2011).
  49. Gosai, S. J., et al. Automated high-content live animal drug screening using C. elegans expressing the aggregation prone serpin alpha1-antitrypsin Z. PLoS One. 5, (2010).
  50. Cohen, E., Bieschke, J., Perciavalle, R. M., Kelly, J. W., Dillin, A. Opposing activities protect against age-onset proteotoxicity. Science. (313), 1604-1610 (2006).
  51. Cohen, E., et al. Reduced IGF-1 signaling delays age-associated proteotoxicity in mice. Cell. 139, 1157-1169 (2009).
  52. Shemesh, N., Shai, N. Ben-Zvi A (2013) Germline stem cell arrest inhibits the collapse of somatic proteostasis early in Caenorhabditis elegans adulthood. Aging Cell. 12 (2013), 814-822 (2013).

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使用 Caenorhabditis elegans 作为模式系统研究多细胞生物中的蛋白质稳态
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