FtsZ的聚合反应检测:简单的协议和注意事项

摘要

FtsZ 的聚合对于细菌细胞分裂至关重要。在本报告中，我们详细介绍了监测 FtsZ 聚合活性的简单方案，并讨论了缓冲液组成的影响。这些方案可用于研究 FtsZ 与影响 FtsZ 聚合的调节蛋白或抗菌药物的相互作用。

摘要

在细菌细胞分裂中，必需的蛋白质的FtsZ组装在单元的中间，以形成所谓的Z型环。 FtsZ的聚合成长的细丝在GTP的体外存在下，与聚合反应是由几个辅助蛋白调节。使用基本的方法，包括光散射，沉降，GTP水解测定法和电子显微镜的FtsZ聚合已被广泛研究的体外 。的FtsZ的缓冲液条件的影响都在聚合属性和FtsZ的，以与调节蛋白相互作用的能力。在这里，我们描述了协议的FtsZ的聚合研究，并利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的FtsZ作为模型蛋白的验证条件和控制。低速沉淀实验引入，允许FtsZ的相互作用的研究与捆绑或tubulate FtsZ的聚合物的蛋白质。一种改进的GTP酶的测定方案进行说明，它允许测试的GTP水解一段时间使用，在96孔板中设置，具有标准化的温育时间是取消变化的发色中的磷酸盐检测反应的各种条件。样品的光散射研究和电子显微镜的制备进行说明。几个缓冲区用于建立合适的缓冲液的pH值和盐浓度对FtsZ的聚合研究。高浓度氯化钾的是最适合大多数的实验。我们的方法提供了一个起点， 在体外表征FtsZ的，不仅从大肠杆菌大肠杆菌和B。枯草而是从任何其他细菌。因此，该方法可用于FtsZ的与调节蛋白或抗菌药物可能影响FtsZ的聚合试验的相互作用的研究。

引言

必要的菌体蛋白FtsZ的是细菌细胞分裂机制的最佳表征蛋白质。 FtsZ的是微管蛋白的原核同源物和聚合体外在GTP依赖性。 FtsZ的是由于它的保守性质和独特性细菌^1,2新的抗生素非常有吸引力的目标。在细胞分裂的开始，FtsZ的形成cytokinetic环在midcell，作为支架的其他细胞分裂的蛋白质的装配。在Z环的形成是为师平面正确的定位至关重要。的FtsZ的组装动力学是由几个辅助蛋白，如（取决于细菌物种）明克，SepF，ZAPA，UGTP和EZRA ²调节。 FtsZ的聚合已被广泛研究的体外和许多不同的结构，包括直的原丝，弯曲的原丝，长丝片材，长纤维束和长丝的管子一直德cribed取决于装配缓冲液，核苷酸，及包含在所述测定^3个额外的蛋白质。 FtsZ的原丝在体内的体系结构还没有完全理解，虽然在柄杆菌新月柄电子cryotomography的实验表明，在Z环是由相当短的，不连续的单一的原丝组装无需大量集束^4。

在体外 ，FtsZ的和聚合性能的FtsZ与调节蛋白的相互作用是在反应缓冲液的组成敏感。例如，我们最近描述的互动网站SepF对FtsZ的C-末端，并表明，FtsZ的_旅馆 Δ16C-末端截断不再绑定到SepF ^5。在对SepF-FtsZ的_旅馆互动先前的研究中，一个类似的FtsZ的_旅馆 Δ16截断仍cosedimented与SepF，这表明，SepF绑定到辅助站点上的FtsZ ^{6。这些研究的区别是反应缓冲液，在pH为7.5的组合物有一个与FtsZ的截断没有cosedimentation SepF的，而在pH 6.5有cosedimentation。 Gündoğdu 等 。注意到SepF不是功能和析出物，在pH 6.5 7，显示出在pH 6.5观察到的cosedimentation很可能是通过沉淀SepF的，而不是交互与FtsZ的_家 Δ16C-末端截断引起的。 pH和KCl浓度的FtsZ的聚合上的影响以前已经检测。 E的聚合物大肠杆菌的FtsZ（FtsZ的_EC）在pH6.5更长和更丰富的比那些形成于中性pH值8,9。 Tadros 等人 。已经研究的FtsZ _的Ec的聚合中一价阳离子指 ​​出的是K +的结合被连接到_的Ec的FtsZ聚合，是FtsZ的活动10关键的存在。的pH更critica当FtsZ的与其它蛋白质的相互作用进行了研究，如图SepF的前面的例子，以及明克上的FtsZ 11的抑制效果的pH依赖性升。作为pH和盐浓度可以影响与其它蛋白质的FtsZ的相互作用，以选择用于FtsZ的聚合研究在适当的条件和控制是重要的。}

这里我们描述的协议，通过光散射，电子显微镜，沉降，和GTP酶测定法研究FtsZ的聚合和GTP酶活性。直角光散射是研究的FtsZ聚合实时¹²的标准方法。我们引进了一些改进的沉淀和GTP酶检测。我们将详细介绍如何准备样品的光散射和电子显微镜。使用在文献中研究的FtsZ聚合几个缓冲区进行了测试，我们描述了每个实验的最佳条件。我们还将显示控制应引入，以获得最佳的数据。

这些方法允许FtsZ的聚合活性，使用简单的方法和设备，可在大多数实验室其他蛋白质相互作用的快速学习。更复杂的方法来研究的FtsZ聚合存在，但常常需要访问更专门的设备，和/或用荧光标记^8,13,14 FtsZ的修改。在本文中描述的简单方法是使用FtsZ的从二所示枯草芽孢杆菌和大肠杆菌大肠杆菌 ，最常见的革兰氏阳性和革兰氏模式生物。该协议可以适于任何其它的FtsZ蛋白。基于与这些新颖FtsZs，关于时间的微小变化，缓冲液或培养温度初步分析可能是必要的以便获得最佳结果。这里所描述的实验应该有助于找到这些最佳条件。

方案

如前所述^11,15 纯化

未标记的 FtsZ 蛋白，用 20 mM Tris/HCl （pH 7.9）、50 mM KCl、1 mM EGTA、2.5 mM MgAc 和 10% 甘油透析，并储存在 -80 °C。在这些条件下，蛋白质可以储存 2 年以上而不会显着失去活性。蛋白质应以 100 μl 等分试样储存，以避免解冻和冷冻样品。解冻后，样品可在 4 °C 下保存最多一周。FtsZ 在高浓度下可溶，可以 7-10 mg/ml 的浓度储存。保持较高的蛋白质浓度非常重要，以避免在以后的实验中储存缓冲液成分产生不良影响。因此，储存浓度应允许将 FtsZ 稀释至少 10 倍，以使甘油浓度低于 1%，并最大限度地降低反应混合物中透析缓冲液其他组分的浓度。FtsZ 聚合也可能受到高钠⁹ 或咪唑浓度的影响，因此必须从聚合缓冲液中去除这些组分。按照描述⁷ 纯化 SepF 并储存在 -80 °C 的洗脱缓冲液中。表 1 总结了从大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中纯化 FtsZ 的替代已发表程序以及从不同来源纯化 FtsZ 程序的参考（参见代表性结果部分）。

1. 样品制备

1. 制备聚合缓冲液： <表 border="1"> 1 50 毫米 Hepes/NaOH，pH 7.5 阿拉伯数字 25 毫米管道/NaOH，pH 6.8 3 50 毫米 MES/NaOH，pH 6.5 4 50 毫米 Hepes/NaOH，pH 7.5;50 毫米氯化钾 5 25 毫米管道/NaOH，pH 6.8;50 毫米氯化钾 6 50 毫米 MES/NaOH，pH 6.5;50 毫米氯化钾 7 50 毫米 Hepes/NaOH，pH 7.5;300 毫米氯化钾 8 25 毫米管道/NaOH，pH 6.8;300 毫米氯化钾 9 50 毫米 MES/NaOH，pH 6.5;300 毫米氯化钾
2. 使用 22 μm 膜过滤器对所有缓冲液进行过滤灭菌。
3. 在 （1） 的每种聚合缓冲液中制备 100 mM GTP、GDP 和 MgCl₂ 储备液。
4. 通过在 4 °C 下以 100,000 x g 旋转 20 分钟来预清除蛋白质以进行所有实验。

2. FtsZ 沉降测定

1. 通过将 MgCl₂ 和 FtsZ 添加到与高速离心兼容的试管中的一种聚合缓冲液（参见样品制备点 1）中来制备反应混合物。总体积应为 49 μl，MgCl₂ 为 10 mM，FtsZ 为 12 μM，终体积为 50 μl。
2. 将试管放入具有摇动功能的培养箱中，在 30 °C 下以 300 rpm 孵育 2 分钟（或者可以轻轻轻弹样品并短暂进行微量离心，然后在 30 °C 下预热）。
3. 通过在与实验中使用的相同缓冲液（终浓度为 2 mM）中加入 1 μl GTP 或 GDP 储备液来开始聚合。在 30 °C 下以 300 rpm 孵育 10 或 2 分钟（对于分别含有 50 mM KCl 和 300 mM KCl 的缓冲液）（或在具有振荡功能的培养箱中孵育）。
4. 将试管转移到超速离心机转子中，并在 25 °C 下以 350,000 x g （TLA 120.1 转子为 89,700 rpm）离心 10 分钟。
5. 离心后，小心地从转子中取出试管，并立即将上清液转移到干净的试管中。通过将 20 μl 上清液添加到 20 μl 2x 样品缓冲液中来制备用于 SDS-PAGE 的样品。在 98 °C 下煮沸 10 分钟。
6. 向含有 FtsZ 聚合物的沉淀级分中加入 50 μl 2x 样品缓冲液。将超速离心管放入 2 ml 管中。通过在 98 °C 下煮沸 10 分钟重悬沉淀，然后加入 50 μl 脱盐的 H₂O，使样品与上清液样品具有相同的 2 倍稀释度。
7. 将 2 ml 试管中的超速离心管倒置，然后在 Eppendorf 离心机中以 18,000 x g 离心力离心 5 分钟。从 2 ml 试管中取出超速离心管。
8. 将 10 μl 每种上清液和沉淀样品并排加载到 10% SDS-PAGE 凝胶上。在 150 V 下运行凝胶。
9. 用考马斯亮蓝 G-250 对凝胶进行染色，并保留以进行定量。

3. 慢速旋转时的 FtsZ 沉降测定

1. 按照步骤 2 制备聚合溶液，添加 SepF 和/或 FtsZ（终浓度 12 μM）。这些实验可以在 Beckman 一次性 1.5 ml 管中与 TLA-55 转子组合进行。
2. 将试管放入具有摇动功能的培养箱中，并在 30 °C 下以 300 rpm 孵育 2 分钟。
3. 从储备溶液（终浓度 2 mM）中加入 1 μl GTP 或 GDP 开始聚合，在 30 °C 下以 300 rpm 孵育 20 分钟。
4. 在 25 °C 下以 24,600 x g （TLA 55 转子为 20,000 rpm）旋转 15 分钟。
5. 去除上清液并转移到干净的试管中，取 20 μl 并转移到 20 μl 2x 样品缓冲液中。在 98 °C 下煮沸 10 分钟。
6. 向含有聚合物的沉淀级分中加入 50 μl 2x 样品缓冲液，并在 98 °C 下煮沸 10 分钟重悬，加入 50 μl 脱盐的 H₂O。
7. 将 10 μl 每种上清液和沉淀样品并排加载到 10% SDS-PAGE 凝胶上。在 150 V 下运行凝胶。
8. 用考马斯亮蓝 G-250 对凝胶进行染色，并保留以进行定量。

4. FtsZ 沉降测定的定量

1. 使用凝胶成像系统（例如 LAS-4000、Fujifilm）拍摄考马斯染色凝胶的照片。
2. 在适用于凝胶光密度分析的程序（例如 AIDA 图像分析仪程序 （Raytest）））中打开凝胶图像，并在下面的该程序中描述分析。
3. 单击工具栏中的 "Evaluation" 按钮。
4. 从列表中选择 "2D Densitometry" 并单击 ok。
5. 在主菜单上，单击 "Evaluation" 并选择 "Region Determination" 条目。
6. 要在凝胶上创建区域，请单击区域确定工具箱中的自动轮廓工具的符号。
7. 单击凝胶上蛋白质条带的左上角，按住鼠标按钮并将其拖动到所需的条带右下角，然后松开鼠标按钮。
8. 以相同的方式标记每个 FtsZ/SepF 条带。
9. 有关已分配区域评估的所有信息都可以在 Region Report 中找到。要获取区域报告，请单击 Region Determination 工具箱中的 "Show region Report" 按钮。
10. 要导出报告，请在主菜单上单击 File 并选择 Export à 2D Region Report（导出 à 2D 区域报告）条目。
11. 在区域报告中，应找到每个创建区域的强度。使用报告中的强度值计算沉淀中蛋白质（FtsZ，调节蛋白）的百分比。

5. 90° 光散射

1. 打开荧光光谱仪（例如 AMINCO-Bowman Series 2），让灯预热几分钟以避免热波动，然后打开循环水浴以将比色皿室温度保持在 30 °C。
2. 定义光谱仪的工作参数：探测器高压 300 V，发射和激发波长：350 nm，狭缝宽度：4 nm。请注意，许多光谱仪在实验开始时会自动将信号调整到最大值的一定百分比（例如 60%）。这会导致一旦添加 GTP 以聚合 FtsZ，散射信号就会超出范围。在开始一系列实验之前，明智的做法是首先建立正确的信号放大 - 检测器高压 - 以实现最大聚合。
3. 编写数据采集协议。选择基于时间的采集，持续时间为 3,600 秒。
4. 用水和乙醇小心清洁荧光比色皿，如有必要 - 在室温下在水浴中超声处理 5 分钟。在该方案中，使用光程为 1 cm 且体积为 200 μl 的比色皿并储存在储存溶液（0.5-1% Hellmanex）中。作为替代方案，可以使用一次性使用 UV 兼容的塑料比色皿（UVette、Eppendorf）。
5. 制备 294 μl 聚合缓冲液预混液（参见样品制备点 1），其中 10 mM MgCl₂ 和 12 μM FtsZ 作为 300 μl 的最终浓度，然后涡旋。
6. 将 196 μl 聚合缓冲液转移到比色皿中，并将其置于光谱仪中。在 30 °C 下孵育 2 分钟。
7. 开始数据采集并等待 90 秒以验证信号是否稳定。
8. 加入 4 μl 100 mM GTP 或 GDP（终浓度：2 mM）以达到 200 μl 的最终反应体积，用更大体积的移液管上下移液以混合并恢复采集。

6. 透射电子显微镜

1. 准备样品，如FtsZ沉降测定（体积可以减少至10μl终体积以节省材料）。
2. 孵育时间后，将 2 μl 样品涂在辉光放电的 400 目碳涂层铜网格上，孵育 15 秒。
3. 轻轻触摸或拖动平行或垂直于一张滤纸的网格，将网格吸干。
4. 使用 4 μl 2% 乙酸铀酰溶液对网格进行染色。按照步骤 6.3 中的说明将网格吸干。
5. 在飞利浦 CM120 电子显微镜中查看网格，该电子显微镜在 120 kV 下以 39,200 倍放大倍率运行。

7. GTP 水解测定

实验设置的设计方式是，通过将反应与孔雀石绿混合，在不同反应时间后停止 FtsZ 的 GTP 水解。这样，每个样品的孔雀石绿显色时间都是相同的。

1. 在其中一种聚合缓冲液中制备 1.5 ml 2 mM GTP（参见样品制备，第 1 点）
   在聚合缓冲液中制备 0-40 μM 磷酸盐标准稀释液，并按照 POMG-25H（生物测定）试剂盒中的说明制备孔雀石绿工作试剂。或者，可以根据 Lanzetta 等人描述的方案在内部制备工作试剂。¹⁶
2. 制备总体积为 360 μl 的预混液： <表 border="1"> 我 24 μM FtsZ_Bs，20 mM MgCl₂，聚合缓冲液 第二 12 μM FtsZ_Ec、20 mM MgCl₂、聚合缓冲液 III （控制 1） 24 μM FtsZ_Bs，2 mM EDTA，聚合缓冲液 IV（对照 2） 12 μM FtsZ_Ec、2 mM EDTA、聚合缓冲液
3. 按以下顺序在 qPCR 96 孔板中移液 20 μl 等分试样的预混液、100 μl 磷酸盐标准品和 180 μl 2 mM GTP： <表 border="1"> 一个 乙 丙 D E F 克 H 1 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 阿拉伯数字 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 3 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 4 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 5 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 6 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 7 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 8 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 9 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言 10 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP
   PS - 磷酸盐标准品
4. 将 qPCR 板放入 PCR 机器中，程序设置为 30 °C 下 40 分钟循环。
5. 在 96 孔板中制备 20 μl 等分试样的孔雀石绿工作试剂。将 60 μl 实验中的聚合缓冲液添加到泳道 1'-8' 中。与磷酸盐标准品相比，样品将被稀释 4 倍，请在最终计算时考虑这一事实。 <表格 border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"> 一个 乙 丙 D E F 克 H 1 分钟 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 2 英尺 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 3 英尺 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 4' 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 5 分钟 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 6 分钟 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 7 分钟 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 8' 第三 第三 我 我 四 四 第二 第二 9' 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言 10 分钟 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言 附言
6. 向泳道 1 中加入 20 μl GTP，上下移液混合，启动计时器（这是 30 分钟反应的起始时间点）。
7. 10 分钟后，30 秒后，将 GTP 添加到泳道 2 中，上下移液以混合（20 分钟反应）。
8. 16 分钟后，将 GTP 添加到泳道 3 中，上下移液以混合（反应 15 分钟）。
9. 21 分钟后，30 秒，将 GTP 添加到泳道 4 中，上下移液以混合（10 分钟反应）。
10. 25 分钟后，将 GTP 添加到泳道 5 中，上下移液以混合（反应 7 分钟）。
11. 27 分钟后，30 秒，将 GTP 添加到泳道 6 中，上下移液混合（5 分钟反应）。
12. 29 分钟后，将 GTP 添加到泳道 7 中，上下移液混合（4 分钟反应）..
13. 30 分钟后，将 20 μl 从泳道 1 转移到泳道 1' 中，上下移液混合（30 分钟反应孔雀石绿色显色的起点）。
14. 30 分钟后，30 秒将 20 μl 从泳道 2 转移到 2'，上下移液混合（20 分钟反应孔雀石绿色显色的起点）。
15. 每 30 秒对泳道 3-7 重复此步骤。
16. 33 分钟后，30 秒后，向泳道 8 中加入 20 μl GTP，上下移液混合并转移 20 μl 至泳道 8'，上下移液混合（0 分钟反应和反应孔雀石绿显色的起始时间点）。
17. 34 分钟后，从泳道 9 至 9' 加入 80 μl，上下移液以混合（磷酸盐标准品 1 孔雀石绿色显色的起点）。
18. 34 分钟 30 秒后，将 80 μl 从泳道 10 转移到 10'，上下移液混合（磷酸盐标准品 2 孔雀石绿色显色的起点）。
19. 去除样品中的所有气泡，并在室温下将板再孵育 25 分钟 30 秒。
20. 将板放入 96 孔读板器中。
21. 60 分钟后，在 630 nm 波长下每 30 秒测量板 10 次（孔雀石绿显色现在第一次反应为 30 分钟）。每次测量对应于步骤 7.6-7.12 和 7.16 中的每个时间点，并且必须在数据分析期间单独计算。
22. 使用磷酸盐标准校准曲线计算每个样品中的游离磷酸盐。
23. 将数据绘制为磷酸盐随时间的释放，并根据曲线的线性范围计算 FtsZ GTP 水解活性。

结果

文献中描述了从不同细菌来源纯化 FtsZ，并在表 1 中进行了总结。

<表 border="1"> 源 方法 修改 获得的产量 [mg/L 培养物]> 引用 枯草芽孢杆菌 1） 硫酸铵沉淀/离子交换色谱 不 40 这项工作，11,15 2） 亲和层析 His 标签 ND 系列 17 大肠杆菌 1） 硫酸铵沉淀/离子交换色谱 不 35 这项工作，11,15 2） 钙沉淀、离子交换色谱 不 40 18 Jannaschii 甲球菌 1） 变性条件下的亲和层析/重折叠/硫酸铵沉淀/凝胶过滤 His 标签 1.3 19 2） 亲和层析/凝胶过滤 His 标签 ND 系列 20 Thermotoga maritima 马里蒂玛 离子交换色谱/凝胶过滤 不 6,7 19 铜绿假单胞菌 亲和层析/凝胶过滤 Strep 标签、His 标签 ND 系列 21 结核分枝杆菌 1） 亲和/离子交换色谱 不 ND 系列 22 2） 亲和层析/凝胶过滤 不 30 23 Aquifex aeolicus （英语） 亲和层析/凝胶过滤 His 标签，C 端截断 （331-367） ND 系列 24 新月形球菌 离子交换色谱/硫酸铵沉淀/凝胶过滤 不 ND 系列 25

表 1.描述了 FtsZ 纯化方案。ND：未确定。

FtsZ 聚合物的沉降

最初，我们使用两种不同的速度来降低 FtsZ 聚合物的转速。我们发现，仅在 350,000 x g 的速度下，FtsZ_Ec 的单一聚合物被旋转下来（图 1），而在 190,000 x g 的速度下，颗粒级分中仅存在 FtsZ_Bs 束（数据未显示）。因此，在我们的进一步实验中使用了 350,000 x g 的物质。聚合 FtsZ_Ec 和 FtsZ_Bs 的百分比在 50 mM KCl 时相似，尽管光散射实验显示 FtsZ_Bs 的散射信号要高得多。这是由于 FtsZ_Bs 形成的束比 FtsZ_Ec 的单一聚合物散射更多的光。在使用 300 mM KCl 的 FtsZ_Ec 和 FtsZ_Bs 的实验中，不可能在颗粒级分中获得大量的 FtsZ 聚合物（图 1）。我们将其归因于 FtsZ 结构的快速拆卸和细丝束减少的结合。

FtsZ-SepF 小管的沉降

为了分析 FtsZ 与某些活化剂的相互作用，可以在较低的离心速度下进行沉降测定。在此速度下，只有 FtsZ 的大结构可以沉淀，例如由 SepF 环和 FtsZ_Bs 细丝⁵ 形成的大小管，或由 FtsZ 和 ZapA 形成的束。我们使用较低的离心力 （24,600 x g） 来证明这种方法对 FtsZ 和 SepF 形成的小管的可行性。只有当样品中同时存在 SepF 和 GTP 时，FtsZ 才能在高于背景水平的沉淀中回收（图 2），并且 SepF 的存在不会影响 FtsZ GTP 酶活性⁷，表明 FtsZ 在 SepF 存在下完全活性。SepF 和 FtsZ 的比沉降大约占总 SepF 的 45% 和总 FtsZ 的 15%（与添加 GDP 时的物质沉降相比）。这表明 SepF-FtsZ 小管含有比 FtsZ 更多的 SepF。这可能是因为许多 SepF 环组织了 FtsZ-SepF 小管^5,7。这些小管中 SepF-FtsZ 的确切化学计量尚不清楚，但我们的结果表明 SepF 比 FtsZ 多。

FtsZ_Ec 和 FtsZ_Bs 聚合和捆绑性能

为了表征 FtsZ_Bs 和 FtsZ_Ec 在不同缓冲液中的聚合效率，我们通过 90° 角光散射分析了这两种蛋白质。在 50 mM KCl 时，FtsZ_Bs 的光散射信号比 FtsZ_Ec 高 20-40 倍，具体取决于缓冲液的 pH 值（图 3A 和 B），证实了 Buske 等人的结果。²⁶ 增加缓冲液中的 KCl 浓度不会显著影响 FtsZ_Ec 的光散射信号（图 3D），但与 50 mM KCl 的缓冲液相比，FtsZ_Bs 在 pH 7.5 时降低 ~80 倍，在 pH 6.8 时降低 ~30 倍，在 pH 6.5 时降低 ~45 倍（图 3C）。对于两种蛋白质，在较高的 KCl 浓度下，FtsZ 聚合物的分解速度更快（图 3C 和 D）。Pacheco-Gómez 等人的研究。表明大肠杆菌 FtsZ 聚合和捆绑与 pH 值有关。这些作者发现，在含有 50 mM KCl 的缓冲液中，FtsZ 聚合的光散射信号更高，并且与 pH 7.0 相比，在 pH 6.0 时 FtsZ 的分解需要更长的时间 ⁸。这些结果与我们在 50 mM KCl 下聚合 FtsZ_Ec 的数据不一致（图 3B），但必须注意的是，我们使用了三种不同的缓冲液（HEPES、MES 和 PIPES），其中 Pacheco-Gómez 等人。只用了 MES。因此，不仅 pH 值，而且缓冲液组成（离子强度）都会影响 FtsZ 聚合物在 50 mM KCl 下的动力学。然而，在 300 mM KCl 时，缓冲液组成和 pH 值均未以可检测的方式影响 FtsZ_Ec 组装。

由于在这些条件下蛋白质沉淀，因此无法在不含 KCl 的缓冲液中对 FtsZ_Bs 进行光散射实验。当 FtsZ_Bs 的浓度降低到 3 μM 时，不会发生沉淀。然而，3 μM 不是细胞中 FtsZ 的生理浓度。在塑料比色皿中，FtsZ_Bs 在 pH 值为 7.5 时在 12 μM 时未沉淀，但在 pH 值为 6.8 和 6.5 时，在没有 KCl 的情况下，FtsZ 仍会沉淀。

大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的 FtsZ 结构的形态

用 TEM 检查了 FtsZ 形成的结构。FtsZ_Bs 组装成紧密压实的聚合物，在低盐下覆盖所有缓冲液中的整个网格（图 4A-C）。FtsZ_Ec 在低盐的所有缓冲液中形成长丝、电缆和束（图 4D-F）。然而，FtsZ_Ec 形成的聚合物的可观察到量低于 FtsZ_Bs 形成的量。在高盐缓冲液中，FtsZ_Bs 形成较长的单链原丝，这些原丝不会结合成束（图 4G-I）。虽然 FtsZ_Bs 原丝在较高盐浓度下改变了结构，但 FtsZ_Ec 形成的结构与低盐缓冲液的结构无法区分（图 4J-L）。没有观察到的 pH 值对 FtsZ_Ec 的聚合产生影响，但 FtsZ_Bs 在 pH 值为 6.5 时形成更多的束，可见为紧密压实的聚合物和片材（图 4B）。这些结果与我们的光散射实验和之前发表的 TEM 工作一致^8,11,26。

FtsZ 在高浓度和低浓度下 GTP 酶活性

使用游离磷酸盐的比色测定法在不同条件下测量 FtsZ 的 GTP 水解活性。如前所述¹⁵ FtsZ 的 GTP 酶活性随着 KCl 浓度的增加而增加：取决于使用的缓冲液 FtsZ_Bs。显示 3-7 倍增加，与 50 mM KCl 相比，300 mM KCl 时 FtsZ_Ec 的 GTP 酶活性增加 1.5-2.5 倍。50 mM KCl 时 GTP 酶活性降低是由于 FtsZ_Bs 细丝的捆绑。在 50 mM KCl 时，由于 FtsZ_Ec 聚合物的分解速度更快，FtsZ_Ec 的 GTP 酶活性比 FtsZ_Bs 高 3-6 倍。FtsZ_Bs 和 FtsZ_Ec 之间的 GTP 水解活性差异在 300 mM KCl 时减小，可能是由于 FtsZ_Bs 细丝的束簇减少（图 5）。

图 1.通过沉降定量 FtsZ 聚合。（A） 在 2 mM GTP 或 GDP 存在下，pH 值为 7.5（黑条）、6.8（灰条）或 6.5（白条）聚合 12 μM FtsZ。通过考马斯染色凝胶的光密度测定蛋白质沉淀量。GDP 用作特定沉积物的对照，从 GTP 沉积的 FtsZ 百分比中减去 GDP 沉积的 FtsZ 的百分比，以获得图中绘制的值。左图：FtsZ 在 50 mM KCl 下沉淀，右图：FtsZ 在 300 mM KCl 下沉淀。（B） 考马斯染色凝胶的代表性结果。FtsZ_Bs（上层凝胶）和 FtsZ_Ec（下层凝胶）在 50 mM KCl 下聚合。（S） 上清液，（P） 实验中的沉淀级分。点击这里查看大图。

图 2.SepF/FtsZ 小管低速沉降。（A） 将 12 μM FtsZ_Bs 与 2 mM GDP（白条）或 GTP（黑条）聚合。通过考马斯染色凝胶的光密度测定蛋白质沉淀量。x 轴下的 + 和 - 符号表示反应中是否存在 FtsZ 和 SepF。（B） 考马斯染色凝胶的代表性结果。FtsZ_Bs 在存在和不存在 SepF 的情况下聚合。作为对照，使用不含 FtsZ 的 SepF。用 GTP 和 GDP 进行聚合。（S） 上清液，（P） 来自实验的沉淀级分。单击此处查看大图。

图 3.12 μM FtsZ_Ec 和 12 μM FtsZ_Bs 的光散射。在 2 mM GTP 存在下组装 FtsZs，并通过 90° 角光散射监测聚合。FtsZ_Bs （A） 和 FtsZ_Ec （B） 在 50 mM KCl 下在 pH 7.5、pH 6.8、pH 6.5 下聚合。在 pH 7.5、pH 6.8 和 pH 6.5 下，FtsZ_Bs （C） 和 FtsZ_Ec （D） 在 300 mM KCl 下聚合。点击这里查看大图。

图 4.通过电子显微镜观察的 FtsZ_Bs 和 FtsZ_Ec 聚合物的结构。（A-L）12 μM FtsZ_Bs（A-C 和 G-I）和 FtsZ_Ec （DF） 和 （J-L） 与 2 mM GTP 聚合的图像。（A-C）FtsZ_Bs 溶于缓冲液中，浓度分别为 50 mM KCl，pH 值为 7.5、6.8 和 6.5。（D-F）FtsZ_Ec，溶于缓冲液中，浓度分别为 50 mM KCl，pH 值为 7.5、6.8 和 6.5。（G-I）FtsZ_Bs 溶于含 300 mM KCl 且 pH 分别为 7.5、6.8 和 6.5 的缓冲液中。（J-L）FtsZ_Ec，溶于缓冲液中，浓度分别为 300 mM KCl，pH 值为 7.5、6.8 和 6.5。比例尺：100 nm。点击这里查看大图。

图 5.FtsZ 聚合过程中在 6 种不同的缓冲液中进行 GTP 水解。在所有实验中使用 2 mM GTP。作为对照样品，使用不含 MgCl_{的 2}。在 MgCl₂ 存在下，从 FtsZ 的活性中减去不含 MgCl₂ 的 FtsZ 的活性。左图：FtsZ 在 50 mM KCl 时的 GTP 酶活性，右图：FtsZ 在 300 mM KCl 时的 GTP 酶活性。点击此处查看大图。

讨论

我们描述了一组方法，可以快速分析 FtsZ 活性及其与其他蛋白质的相互作用。光散射、沉降和GTP酶测定以及电子显微镜已被广泛用于研究FtsZ聚合。我们对现有方案进行了一些改进，我们展示了不同条件对 FtsZ 组装的影响，并提出了应包含在 FtsZ 研究中的对照。

我们引入低速离心来区分由FtsZ及其相互作用的蛋白质与FtsZ聚合物结合形成的大结构。与标准沉降测定相比，该方法显示出两个优点。首先，FtsZ聚合物在沉淀馏分中不会形成背景，因为它们不会在24,600 x g下旋转。其次，可以从凝胶计算与相互作用蛋白质形成的结构中存在的 FtsZ 的量。该方法的两个关键步骤是孵育时间和GTP浓度。重要的是，当大蛋白质结构完成时，但在所有 GTP 水解时，在它分解之前离心它。本研究的最佳对照是 FtsZ 与 GDP 的聚合。该测定有一个潜在的局限性。FtsZ 与 SepF 形成稳定的络合物，可以很容易地在 24,600 x g 时旋转。如果使用另一种激活剂或捆绑 FtsZ 聚合物的药物进行沉降，则可能需要调整测定。这可以通过改变孵育时间或提高离心速度来完成。

样品的正确制备对于光散射实验来说是最重要的。蛋白质必须通过旋转进行预清除，并且所有缓冲液在使用前都应过滤。如果样品中存在任何聚集体，它们会破坏从 FtsZ 聚合物获得的稳定信号。对于通过电子显微镜分析 FtsZ 结构，制备网格是主要步骤。样品在网格上孵育的时间将产生或多或少压实的聚合物。对于 FtsZ_B 束，孵育时间必须短于高 KCl 浓度下的 FtsZ_Ec 和 FtsZ_B。 我们对每个样品使用12μM的浓度，以便能够比较结果。然而，对于 50 mM KCl 的 FtsZ_Bs ，应使用较低的 FtsZ 浓度，因为 12 μM 会导致网格完全饱和。这使得聚合物高度压实且难以检测。压实度较低的聚合物更适合在电磁上检测。

GTPase 测定是唯一用于研究 FtsZ 活性而不是结构的实验。Mg²⁺ 是 FtsZ 聚合物中 GTP 周转所必需的。因此，在没有 Mg²⁺ 的情况下，FtsZ 不会水解 GTP。因此，在该测定中，没有 Mg²⁺ 的样品是正确的对照，但 FtsZ 储存缓冲液中存在 Mg 阳离子。可以通过向对照样品中添加 1 mM EDTA 来去除它们。该测定的关键步骤是孵育时间。在给定时间后停止 FtsZ 活动非常重要。这是通过将 FtsZ 样品转移到 96 孔板中的孔雀石绿色溶液中来实现的。然而，孔雀石绿色的形成是一个持续的过程。因此，必须同时对每个样品进行测量。使用精心规划的GTP添加方案，按既定顺序每隔30秒进行一次测量，因此可以在每个时间点获得相同的孵育和样品处理时间。另一个关键步骤是选择实验蛋白质的浓度。在实验中，我们对 FtsZ_Ec 和 FtsZ_Bs 使用了两种不同的浓度。与 FtsZ_Bs 相比，FtsZ_Ec 的 GTP 水解速度要快得多。在选定条件下和 12 μM 时，FtsZ_Ec 的 GTP 酶活性仅在最多 5 分钟内呈线性，此后水解速率趋于稳定。因此，在这些条件下进行时很难解释实验数据。在这种情况下，必须以低于 FtsZ_Bs 的浓度使用 FtsZEc 才能比较两种蛋白质的活性。来自不同来源的 FtsZ 的 GTP 酶活性可能有所不同。因此，必须选择正确的浓度。FtsZ聚合的浓度应远高于临界浓度（通常为2.5-10μM）。FtsZ 组装和拆卸的动力学也很重要。一些蛋白质在添加 GTP 后显示出显着的聚合滞后，如 50 mM KCl 的 FtsZB 所示。在GTP酶测定之前进行光散射测定以近似FtsZ聚合物的组装和拆卸时间是有用的。之后，可以选择孵育时间和蛋白质浓度。由于为FtsZ聚合选择的条件至关重要，因此在每种方法中使用正确的pH值和KCl浓度非常重要。在这项工作中，我们研究了 9 种不同的缓冲液，pH 值范围为 6.5-7.5，KCl 浓度为 0 M 至 300 mM。我们注意到，分析枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的 FtsZ 及其生物活性的最佳条件是在接近生理水平 （7.5） 的 pH 值和高 KCl 浓度下。在高 KCl 浓度下，FtsZ 具有更高的 GTP 酶活性，并产生更容易通过电子显微镜检测到的聚合物。我们还证实，与主要用于研究 FtsZ 组装的任何其他缓冲液相比，生理 pH 值和高 KCl 浓度更适合研究 FtsZ 与调节蛋白之间的相互作用。在高 KCl 浓度下研究时，FtsZBs 显示出与 FtsZEc 相似的活性。此外，在低盐浓度下，pH值的影响比在高盐浓度的缓冲液中更明显。使用不含KCl的缓冲液时，FtsZ有时会沉淀，因此应避免使用不含盐的缓冲液。当使用高 KCl 浓度的缓冲液时，FtsZ 聚合物的沉降率较低。在研究 FtsZ 与组装 FtsZ 细丝的蛋白质（例如 SepF 和 ZapA）之间的相互作用时，这可能是一个优势，因为这些高阶结构很容易通过离心检测到。在我们所有的实验中，我们使用浓度为 10 mM 的 MgCl₂。结果表明，相对较高的 Mg²⁺ 浓度可以稳定 FtsZ 聚合物并降低 FtsZ 的 GTP 酶活性。在表2中总结了各种研究的结果，描述了使用其他相同的缓冲条件²⁷在不同Mg²⁺浓度下FtsZ聚合和GTP酶活性。游离细胞质Mg^{2 +}的测量浓度为0.9 mM³。应该注意的是，GTP 会螯合等量的 Mg²⁺。因此，GTPase实验的最佳Mg²⁺浓度约为2-2.5 mM，接近生理水平³。然而，在我们的实验中，我们使用浓度为 10 mM 的 MgCl₂ 来获得易于检测的光散射信号，并在沉降测定期间稳定 FtsZ 聚合物。

尽管我们将我们的方案应用于来自模式生物大 肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌的 FtsZ，但它们可以适应来自任何其他生物体的 FtsZ。必须注意的是，生物体之间的生理 pH 值以及单价阳离子和二价阳离子的浓度不同。因此，FtsZ聚合的最佳条件可能会有所不同。不同细菌倍增时间和生长条件的差异可能导致FtsZ的组装动力学和实验的最佳条件不同。然而，我们的方案为使用来自其他生物体的FtsZ进行实验提供了一个很好的起点。这些方案应该有助于研究具有调节蛋白的 FtsZ 或研究小化合物和药物对 FtsZ 的影响。

源	聚合 [沉淀的 FtsZ 百分比]	GTP酶[Pi/FtsZ/min]	Mg2+ 浓度 [mM]	FtsZ浓度[μM]	引用
FtsZ电子	~ 28%	~ 2.1	10	12	这项工作
	~ 50%	~ 2.4	10	12.5	27
	~ 43%	~ 3.5	5	12.5	27
	~ 27%	~ 4.6	2.5	12.5	27
	ND的	~ 5.4	2.5	5	26
FtsZBs	~ 30%	~ 0.8		12	这项工作
	~ 52%（含 DEAE 葡聚糖）	~ 0.5	10	10	11
	ND的	~ 2.25	2.5	5	26

表 2.Mg²⁺ 对 FtsZ 聚合和 GTP 酶的影响。 这项工作的结果与已发表的数据的比较。所有实验均在50 mM MES/NaOH、pH=6.5、50 mM KCl中进行。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
GTP	罗氏	10106399001	第 1、2、3、4、5、6、7 部分
壁聚碳酸酯管	贝克曼库尔特	343776	第 2 部分
Optima MAX-XP 超速离心机	贝克曼库尔特	393315	第 2 部分，3
带卡扣盖的聚聚体管	贝克曼库尔特	357448	第 3 部分
AIDA 生物包、1D、2D、FL	RaytestIsotopenmessgeräte GmbH	15000001	第 4 部分
发光图像分析仪 LAS-4000	富士胶片		第 4 部分
Thermo Spectronic AMINCO-Bowman 发光光谱仪	Spectronic 仪器		第 5 部分
荧光细胞	Hellma Analytics	105-250-15-40	第 5 部分
方形 400 目，铜，100 个/瓶	电子显微镜科学	G400-Cu	第 6 部分
CM120 电子显微镜，在 120 kV 下作	飞利浦		第 6 部分
96 ml x 0.2 ml 板	BIOplastics	B70501	第 7 部分
雀石绿磷酸盐检测试剂盒	生物检测系统	POMG-25H	第 7 部分
PowerWave HT 微孔板分光光度计	BioTek		第 7 部分