FtsZ的聚合对细菌细胞分裂至关重要。本文中，我们详细描述了监测FtsZ聚合活性的简单实验方案，并讨论了缓冲液组成对聚合的影响。这些方案可用于研究FtsZ与调控蛋白或影响FtsZ聚合的抗菌药物之间的相互作用。
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摘要
摘要
在细菌细胞分裂过程中，关键蛋白 FtsZ 会在细胞中部聚集并形成所谓的 Z 环。在 GTP 存在下，FtsZ 聚合成较长的丝状结构。 体外，其聚合过程受到多种辅助蛋白的调控。FtsZ的聚合已得到广泛研究 体外 使用光散射、沉降、GTP水解活性检测和电子显微镜等基本方法。缓冲条件会影响FtsZ的聚合特性及其与调控蛋白相互作用的能力。本文中，我们描述了FtsZ聚合研究的实验方案，并通过以下条件和对照的验证 大肠杆菌 和 枯草芽孢杆菌 FtsZ 作为模型蛋白。本文介绍了一种低速沉降分析法，可用于研究 FtsZ 与能够使 FtsZ 聚合物成束或形成管状结构的蛋白质之间的相互作用。文中描述了一种改进的 GTP 酶活性检测方案，可在 96 孔板体系中，通过不同实验条件随时间检测 GTP 水解情况，并采用标准化的孵育时间，以消除磷酸检测反应中显色程度的差异。同时阐述了用于光散射研究和电子显微镜观察的样品制备方法。实验中使用多种缓冲液以确定适合 FtsZ 聚合研究的缓冲液 pH 值和盐浓度，其中高浓度 KCl 适用于大多数实验。本方法为相关研究提供了起点 体外 FtsZ 的表征，不仅来自 大肠杆菌 和 B. subtilis 但不能与其他任何细菌混淆。因此，这些方法可用于研究FtsZ与调控蛋白之间的相互作用，或用于测试可能影响FtsZ聚合的抗菌药物。
引言
关键的细菌蛋白FtsZ是细菌细胞分裂机制中研究最为透彻的蛋白质。FtsZ是微管蛋白的原核同源物，能够发生聚合 体外 以GTP依赖的方式。FtsZ由于在细菌中具有高度保守性和特异性，是新型抗生素极具吸引力的作用靶点1,2细胞分裂开始时，FtsZ 在细胞中部形成分裂环（Z环），作为其他细胞分裂蛋白组装的支架。Z环的形成对于分裂面的准确定位至关重要。FtsZ 的组装动态受到多种辅助蛋白的调控，例如根据不同细菌种类而定的 MinC、SepF、ZapA、UgtP 和 EzrA。2FtsZ 聚合已得到深入研究 体外 已根据实验所用的组装缓冲液、核苷酸及添加的辅助蛋白，描述了多种不同结构，包括直的原纤维、弯曲的原纤维、纤维片层、纤维束以及纤维管状结构。3FtsZ原丝的结构 体内 尚不完全清楚，尽管电子冷冻断层扫描实验在 Caulobacter crescentus 表明Z环由相对较短、不连续的单根原丝组成，且无明显的成束结构4.
体外条件下，FtsZ 的聚合特性及其与调控蛋白的相互作用对反应缓冲液的组成十分敏感。例如，我们最近描述了 SepF 在 FtsZ C 末端上的结合位点，并证明 FtsZBs∆16 C 末端截短体不再与 SepF 结合5。而在先前关于 SepF-FtsZBs 相互作用的研究中，类似的 FtsZBs∆16 截短体仍能与 SepF 共沉淀，提示 SepF 可能结合于 FtsZ 上的另一个次要位点6。这两项研究之间的差异在于反应缓冲液的组成——在 pH 7.5 时，SepF 与 FtsZ 截短体之间无共沉淀现象，而在 pH 6.5 时则出现共沉淀。Gündoğdu 等指出，SepF 在 pH 6.5 时失去功能并发生沉淀7，表明在 pH 6.5 观察到的共沉淀很可能是由于 SepF 自身沉淀所致，而非与 FtsZBs∆16 C 末端截短体发生特异性相互作用。此前已有研究探讨 pH 和 KCl 浓度对 FtsZ 聚合的影响。大肠杆菌 FtsZ（FtsZEc）在 pH 6.5 条件下形成的聚合物比中性 pH 下更长且更丰富8,9。Tadros 等研究了单价阳离子存在下 FtsZEc 的聚合，发现 K+ 的结合与 FtsZEc 的聚合密切相关，对 FtsZ 活性至关重要10。当研究 FtsZ 与其他蛋白的相互作用时，pH 的影响尤为关键，SepF 的例子即是一例，此外 MinC 对 FtsZ 抑制作用也具有 pH 依赖性11。由于 pH 和盐浓度均可能影响 FtsZ 与其他蛋白的相互作用，因此在开展 FtsZ 聚合研究时，选择合适的实验条件和对照至关重要。
本文描述了通过光散射、电子显微镜、沉降法研究FtsZ聚合及GTP酶活性的实验方案， 以及GTP酶活性检测。直角光散射是实时研究FtsZ聚合的常用方法。12我们对沉降实验和GTP酶活性测定方法进行了一些改进。本文详细介绍了如何制备用于光散射和电子显微镜观察的样品。我们测试了文献中用于研究FtsZ聚合的多种缓冲体系，并描述了每种实验的最佳条件。同时，我们还指出了应引入哪些对照以获得最佳实验数据。
这些方法利用大多数实验室常见的简单方法和设备，可快速研究 FtsZ 的聚合、活性及其与其他蛋白质的相互作用。尽管存在更为复杂的研究 FtsZ 聚合的方法，但这些方法通常需要使用更专业的设备和/或对 FtsZ 进行荧光标记8,13,14。本文所述的简单方法以B. subtilis 和 E. coli 的 FtsZ 为例进行说明，这两种生物是最常用的革兰氏阳性（Gram+）和革兰氏阴性（Gram-）模式生物。这些实验方案可适用于任何其他 FtsZ 蛋白。根据对这些新型 FtsZ 蛋白的初步实验结果，可能需要对孵育时间、缓冲液或温度等条件进行微调，以获得最佳效果。本文描述的实验有助于确定这些最佳条件。
方案
未标记的FtsZ蛋白按照先前所述方法进行纯化11,15，用含20 mM Tris/HCl（pH 7.9）、50 mM KCl、1 mM EGTA、2.5 mM MgAc和10%甘油的缓冲液透析后，于-80 °C保存。在该条件下，蛋白可保存超过两年而无明显活性损失。为避免反复冻融，蛋白应以100 µl分装保存。解冻后，样品最多可在4 °C保存一周。FtsZ在高浓度下可溶，可储存于7–10 mg/ml。保持较高的蛋白浓度非常重要，以避免储存缓冲液组分在后续实验中产生非预期影响。因此，储存浓度应允许至少10倍稀释FtsZ，使甘油浓度降至1%以下，并尽量降低透析缓冲液中其他组分在反应体系中的浓度。FtsZ的聚合也可能受到高浓度钠离子9或咪唑的影响，因此这些组分必须从聚合反应缓冲液中去除。SepF的纯化方法如前所述7，溶于洗脱缓冲液后于-80 °C保存。表1（见代表性结果部分）总结了从大肠杆菌（E. coli）和枯草芽孢杆菌（B. subtilis）纯化FtsZ的其他已发表方案，以及来自不同来源FtsZ纯化方法的相关参考文献。
1. 样品制备
- 配制聚合缓冲液：
1 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7.5 2 25 mM PIPES/ NaOH, pH 6.8 3 50 mM MES/ NaOH, pH 6.5 4 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7.5; 50 mM KCl 5 25 mM PIPES/ NaOH, pH 6.8; 50 mM KCl 6 50 mM MES/ NaOH, pH 6.5; 50 mM KCl 7 50 mM Hepes/ NaOH, pH 7.5; 300 mM KCl 8 25 mM PIPES/ NaOH, pH 6.8; 300 mM KCl 9 50 mM MES/ NaOH, pH 6.5; 300 mM KCl - 使用 22 µm 滤膜对所有缓冲液进行过滤除菌。
- 在步骤（1）中的每种聚合缓冲液中，分别配制 100 mM GTP、GDP 和 MgCl2 储存液。
- 所有实验中，将蛋白质在 4 °C 条件下以 100,000 × g 离心 20 分钟，进行预清除。
2. FtsZ 沉降实验
- 在适用于高速离心的离心管中，通过向一种聚合缓冲液（参见样品制备步骤1）中加入 MgCl2 和 FtsZ 来配制反应混合液。总体积应为 49 µl，使 MgCl2 浓度为 10 mM，FtsZ 浓度为 12 µM（以最终 50 µl 体积计）。
- 将离心管放入带有振荡功能的恒温孵育器中，在 30 °C、300 rpm 条件下孵育 2 分钟（也可轻轻弹击管体，短暂离心后于 30 °C 预热）。
- 通过加入 1 µl 实验所用缓冲液配制的 GTP 或 GDP 储存液启动聚合反应（终浓度为 2 mM）。在 30 °C、300 rpm 条件下孵育 10 分钟或 2 分钟（分别对应含 50 mM KCl 和 300 mM KCl 的缓冲液），或在带振荡功能的孵育器中进行孵育。
- 将离心管转移至超速离心机转子中，在 25 °C 下以 350,000 × g 离心 10 分钟（TLA 120.1 转子对应转速为 89,700 rpm）。
- 离心结束后，小心将离心管从转子中取出，并立即吸取上清液转移至洁净离心管中。取 20 µl 上清液与 20 µl 2× 上样缓冲液混合制备 SDS-PAGE 样品，在 98 °C 下煮沸 10 分钟。
- 向含有 FtsZ 聚合物的沉淀部分加入 50 µl 2× 上样缓冲液。将超速离心管放入 2 ml 离心管中，通过在 98 °C 下煮沸 10 分钟重悬沉淀，随后加入 50 µl 去离子 H2O，使样品稀释倍数与上清液样品一致（均为 2× 稀释）。
- 将超速离心管倒置放入 2 ml 离心管中，在 Eppendorf 离心机中以 18,000 × g 离心 5 分钟。随后从 2 ml 管中取出超速离心管。
- 分别取 10 µl 上清液和沉淀样品并排上样于 10% SDS-PAGE 胶。以 150 V 电压运行电泳。
- 用考马斯亮蓝 G-250 染色凝胶，并保存用于定量分析。
3. FtsZ 沉降分析（低速离心法）
- 按步骤 2制备聚合反应溶液，加入SepF和/或FtsZ（终浓度为12 µM）。该实验可在Beckman一次性1.5 ml 离心管中进行，并配合使用TLA-55转子。
- 将离心管放入带有摇动功能的培养箱中，在30 °C、300 rpm条件下孵育2分钟。
- 通过加入1 µl GTP或GDP储备液（终浓度为2 mM）启动聚合反应，在30 °C、300 rpm条件下孵育20分钟。
- 在25 °C下以24,600 × g（TLA-55转子为20,000 rpm）离心15分钟。
- 移除上清液并转移至洁净离心管中，取20 µl加入20 µl 2×上样缓冲液中，于98 °C煮沸10分钟。
- 向含有聚合物的沉淀部分加入50 µl 2×上样缓冲液，通过在98 °C煮沸10分钟重悬沉淀，再加入50 µl去离子H2O。
- 将各上清液和沉淀样品分别取10 µl并排上样至10% SDS-PAGE凝胶中，在150 V电压下电泳。
- 用考马斯亮蓝G-250染色凝胶，并保存用于定量分析。
4. FtsZ 沉降实验的定量分析
- 使用凝胶成像系统拍摄考马斯亮蓝染色凝胶的图像（例如 LAS-4000，富士胶片
- 在适用于凝胶密度分析的软件程序中打开凝胶图像（例如 AIDA 图像分析程序（Raytest）及其在该程序中的分析方法描述 如下。
- 点击 "评估" 工具栏中的按钮。
- 选择 "二维密度测定法" 从列表中选择并点击确定。
- 在主菜单中，单击 "评估" 并选择 "区域确定" 进入。
- 在凝胶上创建区域时，点击区域确定工具箱中的自动轮廓工具符号。
- 点击凝胶上蛋白条带的左上角，按住鼠标按钮并拖动至条带右下角的预期位置，然后松开鼠标按钮。
- 以相同方式标记每条 FtsZ/SepF 条带。
- 有关指定区域评估的所有信息均可在区域报告中找到。要获取区域报告，请点击 "显示区域 报告" 区域确定工具箱中的按钮。
- 要导出报告，请在主菜单中点击“文件”，然后选择 "导出至二维区域报告" 进入。
- 在区域报告中，应找到每个所创建区域的强度值。根据报告中的强度值，计算沉淀物中蛋白质（FtsZ、调节蛋白）的百分比。
5. 90° 光散射
- 打开荧光光谱仪（例如 AMINCO-Bowman Series 2）开机后，让光源预热数分钟以避免热波动，并开启循环水浴，将比色皿室温度维持在30 °C。
- 设定光谱仪的操作参数：探测器高压300 V，发射和激发波长350 nm，狭缝宽度4 nm。注意，许多光谱仪在实验开始时会自动将信号调整至某一百分比例如 60%）时，一旦加入GTP以启动FtsZ聚合，散射信号便会超出检测范围。因此，在开展一系列实验之前，应首先确定达到最大聚合状态时所需的合适信号放大倍数和检测器高压值。
- 设定数据采集程序。选择基于时间的采集模式，持续时间为 3,600 秒。
- 仔细用水和乙醇清洗荧光比色皿，必要时可在室温下于水浴中超声处理5分钟。本方案中使用光程为1 cm的比色皿 厘米光程和200微升 使用后应将体积保存在储存液（0.5–1% Hellmanex）中。作为替代方案，可使用一次性紫外兼容塑料比色皿（UVette，Eppendorf）。
- 将聚合缓冲液（参见样品制备步骤1）与10 mM MgCl₂混合，配制294 µl的主混合液2 300 µl 体系中 FtsZ 的终浓度为 12 µM，涡旋混匀。
- 将196 µl聚合缓冲液转移至比色皿中，并放入分光光度计。在30 °C下孵育2分钟。
- 开始数据采集，并等待90秒以确认信号稳定。
- 加入4 µl 100 mM GTP或GDP（终浓度：2 mM），使终体积为200 µl，使用较大体积的移液器吹打混匀，然后继续采集数据。
6. 透射电子显微镜
- 按照FtsZ沉降实验的方法制备样品（终体积可减少至10 μl 以节省材料）。
- 孵育结束后，取2 µl样品滴加至经辉光放电处理的400目碳支持膜铜网上，孵育15秒。
- 用滤纸轻轻接触或平行/垂直拖动铜网，将液体吸干。
- 用4 µl的2%醋酸铀酰溶液对铜网进行染色。按步骤 6.3所述方法将铜网吸干。
- 在Philips CM120透射电子显微镜下，以120 kV电压、39,200倍放大倍数观察样品。
7. GTP 水解实验
实验设置的方式是：通过将反应液与孔雀绿混合，在不同的反应时间后终止FtsZ的GTP水解反应。这样可确保每个样品中孔雀绿显色的时间相同。
- 在一种聚合缓冲液中制备1.5 ml的2 mM GTP（参见样品制备，第1步）。
在聚合缓冲液中制备0–40 µM 磷酸盐标准品稀释液 ，并按照POMG-25H（Bio assays）试剂盒说明书配制孔雀绿工作液。或者，也可根据Lanzetta et al.16描述的方案自行配制工作液。 - 配制总反应体积为360 µl的主混合液：
I 24 µM FtsZBs、20 mM MgCl2、聚合缓冲液 II 12 µM FtsZEc、20 mM MgCl2、聚合缓冲液 III（对照1） 24 µM FtsZBs、2 mM EDTA、聚合缓冲液 IV（对照2） 12 µM FtsZEc、2 mM EDTA、聚合缓冲液 - 在qPCR 96孔板中，按以下顺序加入20 µl主混合液、100 µl 磷酸盐标准品和180 µl 2 mM GTP：
A B C D E F G H 1 III III I I IV IV II II 2 III III I I IV IV II II 3 III III I I IV IV II II 4 III III I I IV IV II II 5 III III I I IV IV II II 6 III III I I IV IV II II 7 III III I I IV IV II II 8 III III I I IV IV II II 9 PS PS PS PS PS PS PS PS 10 PS PS PS PS PS PS PS PS 11 12 GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP GTP
PS — 磷酸盐标准品 - 将qPCR板放入PCR仪中，程序设定为30 °C下反应40分钟。
- 在96孔板中每孔加入20 µl孔雀绿工作液。从反应体系中向1'–8'列各加入60 µl聚合缓冲液。 样品相对于磷酸盐标准品被稀释了4倍，请在最终计算时考虑此因素。
A B C D E F G H 1' III III I I IV IV II II 2' III III I I IV IV II II 3' III III I I IV IV II II 4' III III I I IV IV II II 5' III III I I IV IV II II 6' III III I I IV IV II II 7' III III I I IV IV II II 8' III III I I IV IV II II 9' PS PS PS PS PS PS PS PS 10' PS PS PS PS PS PS PS PS - 向第1列加入20 µl GTP，上下吹打混匀，开始计时（此为30分钟反应的起始时间点）。
- 10分30秒后，向第2列加入GTP，上下吹打混匀（20分钟反应）。
- 16分钟后，向第3列加入GTP，上下吹打混匀（15分钟反应）。
- 21分30秒后，向第4列加入GTP，上下吹打混匀（10分钟反应）。
- 25分钟后，向第5列加入GTP，上下吹打混匀（7分钟反应）。
- 27分30秒后，向第6列加入GTP，上下吹打混匀（5分钟反应）。
- 29分钟后，向第7列加入GTP，上下吹打混匀（4分钟反应）。
- 30分钟后，从第1列转移20 µl至1'列，上下吹打混匀（30分钟反应的孔雀绿显色起始时间点）。
- 30分30秒后，从第2列转移20 µl至2'列，上下吹打混匀（20分钟反应的孔雀绿显色起始时间点）。
- 每隔30秒对第3–7列重复此步骤。
- 33分30秒后，向第8列加入20 µl GTP，上下吹打混匀，再转移20 µl至8'列，上下吹打混匀（0分钟反应，以及该反应的孔雀绿显色起始时间点）。
- 34分钟后，从第9列转移80 µl至9'列，上下吹打混匀（磷酸盐标准品1的孔雀绿显色起始时间点）。
- 34分30秒后，从第10列转移80 µl至10'列，上下吹打混匀（磷酸盐标准品2的孔雀绿显色起始时间点）。
- 去除样品中所有气泡，并在室温下继续孵育25分30秒。
- 将板放入96孔板读数仪中。
- 60分钟后，在630 nm波长下每30秒测量一次，共测量10次（此时第一个反应的孔雀绿显色已进行30分钟）。每次测量对应步骤7.6–7.12和7.16中的各个时间点，数据分析时需分别计算。
- 利用磷酸盐标准曲线计算每个样品中的游离磷酸盐含量。
- 以磷酸盐释放量随时间变化作图，并根据曲线的线性范围计算FtsZ的GTP水解活性。
结果
不同细菌来源的 FtsZ 蛋白纯化方法已有文献报道，详见表1。
| 来源 | 方法 | 修饰 | 获得的产量 [mg/L 培养物]> | 参考文献 |
| B. subtilis | 1) 硫酸铵沉淀/离子交换层析 | 无 | 40 | 这项工作，11,15 |
| 2) 亲和层析 | His标签 | ND | 17 | |
| E. coli | 1) 硫酸铵沉淀/离子交换层析 | 无 | 35 | 这项工作，11,15 |
| 2) 钙沉淀，离子交换色谱 | 无 | 40 | 18 | |
| Methanococcus jannaschii | 1) 变性条件下亲和层析/复性/硫酸铵沉淀/凝胶过滤 | His标签 | 1.3 | 19 |
| 2) 亲和层析/凝胶过滤 | His标签 | ND | 20 | |
| Thermotoga maritima | 离子交换色谱/凝胶过滤 | 无 | 6.7 | 19 |
| 铜绿假单胞菌 | 亲和层析/凝胶过滤 | Strep-tag，His-tag | 未检测到 | 21 |
| Mycobacterium tuberculosis | 1) 亲和/离子交换层析 | 无 | 未检测到 | 22 |
| 2) 亲和层析/凝胶过滤 | 无 | 30 | 23 | |
| Aquifex aeolicus | 亲和层析/凝胶过滤 | His标签，C端截短（331-367） | ND | 24 |
| Caulobacter crescentus | 离子交换层析/硫酸铵沉淀/凝胶过滤 | 无 | 未检测到 | 25 |
表1. 所述的FtsZ纯化方案。ND：未测定。
FtsZ 聚合物的沉降
最初，我们采用两种不同的离心速度来沉淀FtsZ多聚体。我们发现，只有在350,000 × g的离心力下，FtsZEc的单根多聚体才会被沉淀下来（图1），而在190,000 × g时，仅有FtsZBs的束状结构存在于沉淀组分中（数据未显示）。因此，在后续实验中我们采用了350,000 × g的离心条件。在50 mM KCl条件下，FtsZEc和FtsZBs的多聚化百分比相似，尽管光散射实验显示FtsZBs的散射信号明显更强。这归因于FtsZBs形成的束状结构比FtsZEc的单根多聚体具有更强的光散射能力。在300 mM KCl条件下，无论是FtsZEc还是FtsZBs，均无法在沉淀组分中获得较大量的FtsZ多聚体（图1）。我们认为这是由于FtsZ结构快速解聚以及纤维束化程度降低共同导致的。
FtsZ-SepF 微管的沉降
为了分析FtsZ与特定激活因子的相互作用，可在较低离心速度下进行沉降分析。在此离心速度下，仅有FtsZ的大分子结构可被沉淀。 例如 SepF环和FtsZ形成的大型管状结构Bs 丝状结构5，或由FtsZ和ZapA形成的束状结构。我们采用较低的离心力（24,600 × g）来验证该方法在FtsZ和SepF形成的管状结构中的可行性。只有当样品中同时存在SepF和GTP时，FtsZ才在沉淀中被检测到，且显著高于背景水平（图 2），且SepF的存在不影响FtsZ的GTP酶活性7 表明在 SepF 存在的情况下，FtsZ 具有完全活性。SepF 和 FtsZ 的特异性沉淀量分别约为总 SepF 的 45% 和总 FtsZ 的 15%（与加入 GDP 时的沉淀物质相比）。这表明 SepF-FtsZ 管状结构中 SepF 的含量高于 FtsZ。这可能是因为多个 SepF 环结构参与组织了 FtsZ-SepF 管状复合物5,7这些管状结构中 SepF 与 FtsZ 的确切化学计量比尚不清楚，但我们的结果表明 SepF 的含量多于 FtsZ。
FtsZEc 和 FtsZBs 的聚合与成束特性
表征 FtsZ 的聚合效率Bs 和 FtsZEc 在不同缓冲液中，我们对两种蛋白质进行了分析 90° 角度光散射。在 50 mM KCl 条件下，FtsZBs 比FtsZ产生高20-40倍的光散射信号Ec 取决于缓冲液的 pH 值（图3A 和 B) 验证 Buske 的实验结果 等.26 增加缓冲液中 KCl 浓度对 FtsZ 的光散射信号无显著影响生态学 (图 3D但FtsZ的信号Bs 在 300 mM KCl 条件下，于 pH 7.5 时降低约 80 倍，pH 6.8 时降低约 30 倍，pH 6.5 时降低约 45 倍（图 3C) 与含有 50 mM KCl 的缓冲液相比（图 3A）。对于这两种蛋白，FtsZ 聚合物在较高 KCl 浓度下的解聚速度更快（图3C 和 D）。Pacheco-Gómez 的研究 等表明 E. coli FtsZ 的聚合与成束具有 pH 依赖性。这些作者发现，在含有 50 mM KCl 的缓冲液中，相较于 pH 7.0，pH 6.0 时 FtsZ 聚合的光散射信号更强，且 FtsZ 的解聚过程更慢。 8这些结果与我们关于FtsZ聚合的数据不一致Ec 在 50 mM KCl 条件下（图 3B），但需要注意的是，我们使用了三种不同的缓冲液（HEPES、MES 和 PIPES），其中 Pacheco-Gómez 等仅使用了MES缓冲液。因此，在50 mM KCl条件下，不仅pH值，而且缓冲液组成（离子强度）均影响FtsZ聚合物的动力学。然而，在300 mM KCl条件下，缓冲液组成和pH值均不影响FtsZ大肠杆菌 以可检测的方式组装。
由于FtsZBs在无KCl缓冲液条件下会发生沉淀，因此无法在此条件下进行光散射实验。当FtsZBs浓度降低至3 µM时，未发生沉淀。然而，3 µM并非细胞内FtsZ的生理浓度。在塑料比色皿中，FtsZBs在pH 7.5时浓度为12 µM不会发生沉淀，但在pH 6.8和pH 6.5时，即使无KCl存在，FtsZ仍会发生沉淀。
E. coli 和 B. subtilis 中 FtsZ 结构的形态
通过透射电子显微镜（TEM）观察FtsZ形成的结构。在低盐条件下，FtsZBs在所有缓冲液中均组装成紧密压缩的聚合物，覆盖整个载网（图4A-C）。FtsZEc在低盐条件下的所有缓冲液中形成长丝状、缆状及束状结构（图4D-F）。然而，FtsZEc形成的聚合物可见量低于FtsZBs所形成的量。在高盐缓冲液中，FtsZBs形成较长的单链原丝，且不进一步聚集成束（图4G-I）。尽管FtsZBs的原丝结构随盐浓度升高而发生变化，FtsZEc形成的结构则与低盐缓冲液中的结构无明显差异（图4J-L）。pH值对FtsZEc的聚合无明显影响，但FtsZBs在pH 6.5时形成更多的束状结构，表现为紧密压缩的聚合物和片层结构（图4B）。这些结果与我们的光散射实验以及先前发表的透射电镜研究结果一致8,11,26。
高浓度和低浓度 KCl 条件下 FtsZ 的 GTP 酶活性
采用游离磷酸盐的比色法，在不同条件下测定了FtsZ的GTP水解活性。如先前报道15，FtsZ的GTP酶活性随KCl浓度的增加而升高：根据所用缓冲液的不同，与50 mM KCl相比，在300 mM KCl条件下，FtsZBs的GTP酶活性提高了3-7倍，而FtsZEc的GTP酶活性提高了1.5-2.5倍。在50 mM KCl条件下GTP酶活性降低是由于FtsZBs丝状体发生束化所致。在50 mM KCl时，FtsZEc的GTP酶活性比FtsZBs高3-6倍，原因是FtsZEc聚合物解聚更快。在300 mM KCl时，FtsZBs与FtsZEc之间的GTP水解活性差异减小，可能是因为FtsZBs丝状体的束化程度降低（图 5）。
图1. 通过沉降法量化 FtsZ 聚合。（A）在 pH 7.5（黑色柱）、6.8（灰色柱）或 6.5（白色柱）条件下，12 µM FtsZ 在 2 mM GTP 或 GDP 存在下进行聚合。通过考马斯亮蓝染色凝胶的密度测定法确定沉淀的蛋白量。以 GDP 作为特异性沉降的对照，从 GTP 条件下 FtsZ 沉淀的百分比中减去 GDP 条件下的百分比，得到图中所示数值。左侧：在 50 mM KCl 条件下沉淀的 FtsZ；右侧：在 300 mM KCl 条件下沉淀的 FtsZ。（B）考马斯亮蓝染色凝胶的代表性结果。FtsZBs（上层凝胶）和 FtsZEc（下层凝胶）在 50 mM KCl 条件下的聚合情况。（S）上清液，（P）实验中的沉淀组分。点击此处查看高分辨率图像。
图 2. SepF/FtsZ 管状结构在低速下的沉降分析。 （A）12 µM FtsZBs 在 2 mM GDP（白色柱）或 GTP（黑色柱）存在下进行聚合。通过考马斯亮蓝染色凝胶的密度测定法确定沉淀蛋白的量。x 轴下方的“+”和“-”符号表示反应体系中 FtsZ 和 SepF 的存在或缺失。（B）考马斯亮蓝染色凝胶的代表性结果。FtsZBs 在有或无 SepF 存在下的聚合情况。以不含 FtsZ 的 SepF 作为对照。聚合反应在 GTP 和 GDP 存在下分别进行。（S）上清液，（P）实验中的沉淀组分。点击此处查看高清图像。
图 3. 12 μM FtsZEc 和 12 μM FtsZBs 的光散射。 在 2 mM GTP 存在下诱导 FtsZ 蛋白组装，并通过 90° 角光散射监测聚合过程。FtsZBs（A）和 FtsZEc（B）在 50 mM KCl 条件下，pH 7.5、pH 6.8、pH 6.5 时的聚合情况；FtsZBs（C）和 FtsZEc（D）在 300 mM KCl 条件下，pH 7.5、pH 6.8 和 pH 6.5 时的聚合情况。点击此处查看高分辨率图像。
图4. 通过电子显微镜观察到的FtsZBs和FtsZEc聚合物的结构。（A-L）12 µM FtsZBs（A-C 和 G-I）以及FtsZEc（D-F 和 J-L）在2 mM GTP存在下聚合的图像。（A-C）FtsZBs在含50 mM KCl、pH分别为7.5、6.8和6.5的缓冲液中的形态。（D-F）FtsZEc在含50 mM KCl、pH分别为7.5、6.8和6.5的缓冲液中的形态。（G-I）FtsZBs在含300 mM KCl、pH分别为7.5、6.8和6.5的缓冲液中的形态。（J-L）FtsZEc在含300 mM KCl、pH分别为7.5、6.8和6.5的缓冲液中的形态。比例尺：100 nm。点击此处查看高分辨率图像。
图5. FtsZ在6种不同缓冲液中聚合过程中的GTP水解活性。所有实验均使用2 mM GTP。以不含MgCl2的样品作为对照。FtsZ在含有MgCl2条件下的活性减去其在无MgCl2条件下的活性。左侧：50 mM KCl条件下FtsZ的GTP酶活性；右侧：300 mM KCl条件下FtsZ的GTP酶活性。点击此处查看高清图像。
讨论
我们介绍了一组可用于快速分析FtsZ活性及其与其他蛋白质相互作用的方法。光散射、沉降、GTP酶活性检测以及电子显微镜技术已被广泛用于研究FtsZ的聚合行为。我们对现有实验方案进行了一些改进，展示了不同条件对FtsZ组装的影响，并提出了在FtsZ研究中应包含的对照实验。
我们采用低速离心法，以区分由FtsZ与其相互作用蛋白结合形成的大分子结构与FtsZ多聚体。该方法相较于标准沉降实验具有两个优势：第一，FtsZ多聚体在24,600 × g条件下不会沉淀，因此沉淀组分中不会产生背景信号；第二，可通过凝胶分析计算与相互作用蛋白共同形成的结构中所含FtsZ的量。该方法中的两个关键步骤是孵育时间和GTP浓度。离心操作应在大分子结构完全形成但尚未因GTP完全水解而解聚之前进行，这一点至关重要。本实验的最佳对照是FtsZ与GDP的聚合反应。该检测方法存在一个潜在局限性：FtsZ与SepF会形成稳定的复合物，可在24,600 × g条件下轻易沉淀。若实验涉及其他激活剂或可使FtsZ多聚体束化的药物，可能需要对该方法进行调整，例如改变孵育时间或提高离心速度。
样品的适当制备是光散射实验中最关键的步骤。蛋白质必须通过离心进行预清除，所有缓冲液在使用前均需过滤。如果样品中存在任何聚集体，将会干扰从FtsZ聚合物获得的稳定信号。通过电子显微镜分析FtsZ结构时，载网的制备是主要步骤。样品在载网上孵育的时间将影响聚合物的致密程度。对于FtsZBs的束状结构，其孵育时间必须短于FtsZEc以及高KCl浓度下的FtsZBs。我们对所有样品均采用12 µM的浓度，以便能够比较实验结果。然而，对于在50 mM KCl条件下的FtsZBs，应使用较低的FtsZ浓度，因为12 µM会导致载网完全饱和，从而使聚合物高度致密而难以观察。在电镜下，较松散的聚合物更易于检测。
GTP酶活性测定是唯一用于研究FtsZ活性而非其结构的实验。Mg2+ 对于FtsZ多聚体中的GTP转换是必需的。因此，在缺乏Mg的情况下2+，FtsZ 不水解 GTP。因此，不含 Mg 的样品2+ 是本实验的正确对照，但FtsZ储存缓冲液中含有Mg²⁺阳离子。可通过向对照样品中加入1 mM EDTA以去除这些阳离子。本实验的关键步骤是孵育时间。在特定时间后终止FtsZ活性至关重要，这可通过将FtsZ样品转移至96孔板中的孔雀绿溶液实现。然而，孔雀绿显色反应是一个持续过程，因此所有样品必须在同一时间点进行测量。通过精心设计GTP添加顺序，并按照既定顺序每隔30秒进行一次测量，可确保每个时间点的孵育时间和样品处理时间一致。另一个关键步骤是选择实验中蛋白质的浓度。在本实验中，我们使用了两种不同浓度的FtsZEc 和 FtsZBsGTP水解在FtsZ中要快得多Ec 与 FtsZ 相比BsFtsZ 的 GTP 酶活性Ec 在选定条件下，12 µM 时仅在最大值范围内呈线性 5 分钟后，水解速率趋于平缓。因此，在这些条件下进行实验时，数据难以解释。此时，FtsZEc 的使用浓度必须低于 FtsZBs 以便能够比较两种蛋白质的活性。不同来源的FtsZ蛋白其GTP酶活性可能存在差异，因此必须选择合适的浓度。FtsZ聚合反应的蛋白浓度应远高于临界浓度（通常为2.5–10 µM）。FtsZ组装与去组装的动力学过程同样重要。某些蛋白在加入GTP后表现出明显的聚合延迟现象，如在50 mM KCl条件下观察到的FtsZBs。在进行GTP酶活性测定前，先开展光散射实验有助于大致确定FtsZ聚合物的组装与去组装时间，进而选择合适的孵育时间和蛋白浓度。由于FtsZ聚合所采用的条件至关重要，因此在每种方法中均需使用适当的pH值和KCl浓度。在本研究中，我们考察了9种不同缓冲体系，pH范围为6.5–7.5，KCl浓度范围为0 M至300 mM。我们注意到，分析不同来源FtsZ蛋白的最佳条件为 B. subtilis 和 E.coli 其生物活性在接近生理水平的pH值（7.5）和高浓度KCl条件下表现最佳。在高KCl浓度下，FtsZ具有更高的GTP酶活性，并形成更易于通过电子显微镜检测的聚合物。我们还证实，与常用于研究FtsZ组装的其他缓冲体系相比，生理pH值结合高KCl浓度更有利于研究FtsZ与调控蛋白之间的相互作用。在高KCl浓度下研究时，FtsZBs表现出与FtsZEc相似的活性。此外，在低盐浓度下，pH值的影响比在高盐浓度缓冲液中更为显著。使用不含KCl的缓冲液时，FtsZ有时会发生沉淀，因此应避免使用无盐缓冲液。在高KCl浓度缓冲液中，FtsZ聚合物的沉降程度较低。这在研究FtsZ与能够组装FtsZ丝状结构的蛋白（如SepF和ZapA）之间的相互作用时可能具有优势，因为这些高级结构易于通过离心法检测。在所有实验中，我们均使用了MgCl₂2 在 10 mM 浓度下。研究表明，相对较高的 Mg2+ 浓度可稳定FtsZ多聚体并降低FtsZ的GTP酶活性。在 表2 不同 Mg²⁺ 浓度下 FtsZ 聚合与 GTP 酶活性的多项研究结果综述2+ 使用其他完全相同的缓冲条件进行浓度测定 27. 游离胞质 Mg 浓度的测定2+ 是 0.9 mM3需要注意的是，GTP 会螯合等量的 Mg2+因此，最佳的 Mg2+ GTP酶实验的浓度约为2-2.5 mM，接近生理水平3然而，在我们的实验中，我们使用了 MgCl2 在10 mM浓度下以获得易于检测的光散射信号，并在沉降实验中稳定FtsZ多聚体。
尽管我们将本方案应用于模式生物E. coli和B. subtilis的FtsZ蛋白，但这些方法也可根据需要调整用于其他任何生物来源的FtsZ。需要注意的是，不同生物体的生理pH值以及一价和二价阳离子浓度存在差异，因此FtsZ聚合的最佳条件可能有所不同。不同细菌的倍增时间及生长条件的差异可能导致FtsZ组装动力学以及实验最佳条件的不同。然而，本方案为研究其他生物来源的FtsZ提供了良好的起点。这些方案也可用于研究FtsZ与调控蛋白的相互作用，或小分子化合物及药物对FtsZ的影响。
| 来源 | 聚合作用 [FtsZ 沉淀百分比] | GTP酶活性 [Pi/FtsZ/分钟] | Mg2+ 浓度 [mM] | FtsZ 浓度 [µM] | 参考文献 |
| FtsZEc | ~ 28% | ~ 2.1 | 10 | 12 | 本研究 |
| ~ 50% | ~ 2.4 | 10 | 12.5 | 27 | |
| ~ 43% | ~ 3.5 | 5 | 12.5 | 27 | |
| ~ 27% | ~ 4.6 | 2.5 | 12.5 | 27 | |
| 未检测 | ~ 5.4 | 2.5 | 5 | 26 | |
| FtsZBs | ~ 30% | ~ 0.8 | 12 | 本研究 | |
| ~ 52%（含 DEAE 葡聚糖） | ~ 0.5 | 10 | 10 | 11 | |
| 未检测 | ~ 2.25 | 2.5 | 5 | 26 |
表2. Mg2+对FtsZ聚合及GTP酶活性的影响。 本研究结果与已发表数据的比较。所有实验均在50 mM MES/NaOH（pH=6.5）、50 mM KCl条件下进行。
披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本实验室的研究工作由荷兰科学研究组织的 VIDI 项目基金（授予 DJS）资助。 我们感谢本校电子显微镜部门的 Marc Stuart 及其团队在透射电子显微镜使用方面提供的协助与支持。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| GTP | Roche | 10106399001 | 第1、2、3、4、5、6、7部分 |
| 厚壁聚碳酸酯管 | Beckman Coulter | 343776 | 第2部分 |
| Optima MAX-XP 超速离心机 | Beckman Coulter | 393315 | 第2、3部分 |
| 带按压盖的聚烯烃管 | Beckman Coulter | 357448 | 第3部分 |
| AIDA 生物分析软件包，1D、2D、FL | Raytest Isotopenmessgeräte GmbH | 15000001 | 第4部分 |
| Luminescence Image Analyzer LAS-4000 | Fujifilm | 第4部分 | |
| Thermo Spectronic AMINCO-Bowman 发光光谱仪 | Spectronic Instruments | 第5部分 | |
| 荧光比色皿 | Hellma Analytics | 105-250-15-40 | 第5部分 |
| 方形400目铜网，100个/瓶 | Electron Microscopy Sciences | G400-Cu | 第6部分 |
| CM120 透射电子显微镜（工作电压120 kV） | Philips | 第6部分 | |
| 96孔板，每孔0.2 ml | BIOplastics | B70501 | 第7部分 |
| 孔雀石绿磷酸盐检测试剂盒 | BioAssay System | POMG-25H | 第7部分 |
| PowerWave HT 微孔板分光光度计 | BioTek | 第7部分 |
参考文献
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