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方法文章

一种蛛网膜下腔出血的小鼠模型

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DOI：

10.3791/50845

⸱

2013年11月21日

 ,  , 
1Institute for Stroke and Dementia Research (ISD), University of Munich Medical Center

本文内容

摘要

本文描述了一种通过 Willis 环内腔穿孔建立标准化小鼠蛛网膜下腔出血模型的方法。通过颅内压监测来观察血管穿孔和蛛网膜下腔出血情况，同时记录并控制多种生命体征参数，以维持生理状态的稳定。

摘要

本视频出版物介绍了一种标准化的小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）模型。通过血管内Willis环穿孔（CWp）诱导出血，并通过颅内压（ICP）监测确认出血成功。该方法可实现动脉循环周围蛛网膜下腔及小脑裂隙中血液分布均匀。动物生理状态通过气管插管、机械通气以及对多种生理和心血管参数的连续在线监测加以维持：包括体温、系统血压、心率和血红蛋白饱和度。由此可严密监控脑灌注压，从而减少外渗血量的变异性。这有助于提高小鼠血管内丝线穿孔模型的标准化程度，使整个模型具有高度可重复性。因此，该模型可广泛应用于野生型及基因修饰小鼠的药理学和病理生理学研究。

引言

蛛网膜下腔出血（SAH）是患者预后最差的卒中亚型：40%的患者在出血后一个月内死亡1，而幸存者中很少有人获得临床意义上的良好预后。

绝大多数自发性蛛网膜下腔出血（SAH）（80%）由颅内动脉瘤破裂引起，这些动脉瘤大多位于前交通动脉、后交通动脉、基底动脉以及大脑中动脉（MCA）2。

此类动脉瘤在动物体内难以建模，因此蛛网膜下腔出血（SAH）的动物模型通常通过将血液注入蛛网膜下腔或脑室，或通过血管内穿刺破坏蛛网膜下腔血管来建立。

将自体血注入小脑延髓池操作简便且可重复，因为血容量可直接控制3。然而，该方法无法模拟蛛网膜下腔出血（SAH）病理生理学的某些方面，例如血管损伤。另一种诱导SAH的技术方法是开放颅内静脉4。

然而，大脑中动脉（MCA）分支处的管内穿孔法似乎是目前最接近人类病理生理过程的建模方法5。该方法最初由Bederson及其同事以及Veelken及其同事分别在大鼠中建立并首次描述6,7。随后，管内穿孔模型被应用于小鼠8,9。实验中将一根细丝经由颈外动脉（ECA）插入，并通过颈内动脉（ICA）推进至颅底。在MCA的分叉处，细丝穿破血管壁，导致血液进入颅底的蛛网膜下腔。随后，血液沿脑裂和血管扩散至其余蛛网膜下腔区域。穿孔部位的血凝块形成可自行止血，但亦可能发生再出血，而再出血在患者中常具有严重的不良影响10。因此，近年来血管内细丝模型已成为广泛应用的蛛网膜下腔出血（SAH）模型。该穿孔模型最常被提及的缺点是出血量无法直接控制，因而可能存在较大变异性。通过严格调控动物的生理状态以及出血后的颅内压（ICP），可显著降低这种变异性。

小鼠的一大优势在于可获得大量基因修饰品系。然而，由于其体型较小，手术操作通常比在较大物种中更为复杂。 例如 大鼠或家兔。因此，将为大鼠开发的技术缩小规模用于小鼠时，往往无法达到预期结果， 例如 由于小鼠的体重和血容量非常有限，应尽可能采用无创技术进行血压和血气分析，以及血红蛋白饱和度和心率监测。因此，本论文的目的是介绍用于小鼠蛛网膜下腔出血（SAH）的丝线穿孔模型，并演示如何以标准化且高度可重复的方式实施该模型。

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方案

所有手术程序均经过伦理审查，并获得上巴伐利亚政府批准（参考编号：55.2-1-54-2532.3-13-13 和 -2532-136-11）。实验动物为雄性 C57BL/6 小鼠，体重约为 25 g。

1. 动物准备

  1. 将小鼠放入麻醉诱导舱中，通入5%异氟烷气体，直至动物失去意识。
  2. 腹腔注射预混麻醉剂：芬太尼（0.05 mg/kg）、咪达唑仑（5 mg/kg）和美托咪啶（0.5 mg/kg）。操作前及操作过程中需定期检查动物反射。为维持麻醉状态，每小时追加初始剂量的三分之一。
  3. 使用由20 G静脉导管制成的导管进行经口气管插管11。插管时将动物固定于倾斜平台（30°），用弯头镊子牵拉舌头，在手术显微镜下观察声门，并在吸气相将导管插入气管。
  4. 将小鼠置于俯卧位，用一小块棉花或微型二氧化碳监测仪确认导管位置是否正确。
  5. 将气管插管连接至呼吸机，以含25%氧气的空气进行通气，通气频率为180–220次/分钟，潮气量为200–250 μl。
  6. 将气管插管连接至微型二氧化碳监测仪，通过调节通气频率，维持呼气末pCO2在30 mmHg。
  7. 插入直肠温度探头，并将动物置于加热垫上，以维持37 °C的核心体温。
  8. 将环形脉搏血氧饱和度传感器固定于右后足。
  9. 用剪刀在颅骨上方剪开皮肤，切口长约0.5 cm，位于耳与眼之间。
  10. 用手术刀从颞骨上分离左侧颞肌。
  11. 将激光多普勒血流仪（LDF）探头粘附于左侧颞骨表面，保持探头位置固定，直至胶水完全固化。
  12. 使用牙科钻在左侧颞骨上钻一个直径约1.5 mm的孔，同时用生理盐水冷却骨骼，防止热损伤。
  13. 将颅内压（ICP）探头插入颅腔，尽可能向背侧推进，以避免脑组织损伤和出血。
  14. 当探头到达正确位置后，用牙科水泥固定并密封探头，静置5分钟使水泥干燥。
  15. 小心将小鼠翻转为仰卧位。
  16. 为实现持续血压监测，对左侧股动脉进行插管。
  17. 将股动脉导管连接至血压监测装置。

2. 蛛网膜下腔出血（SAH）诱导

  1. 用剪刀从胸骨向头部方向剪开皮肤至下颌（2 cm）。钝性分离结缔组织，并将唾液腺推向一侧。
  2. 暴露左侧颈总动脉（CCA）并进行游离。注意保护迷走神经，该神经与 CCA 位于同一结缔组织鞘内。继续向头侧分离，采用相同技术暴露并游离颈内动脉（ICA）和颈外动脉（ECA）。
  3. 尽可能向头侧高位结扎 ECA。
  4. 在 ECA 上预先设置另外两个用于固定栓线的结扎线。
  5. 使用微夹暂时阻断 CCA 和 ICA。用微夹施夹器放置微夹，并通过轻柔回拉确认夹闭到位。
  6. 使用血管剪在 ECA 上剪开一个小口，用于插入栓线。
  7. 将一根长度为 12 mm 的 Prolene 5-0 栓线插入 ECA。
  8. 用预先设置的一个结扎线封闭插入部位。
  9. 使用微夹施夹器移除 CCA 和 ICA 上的微夹。
  10. 用镊子将栓线沿 ICA 向头侧推进，直至颅内压（ICP）升高。ICP 的突然升高提示出血已诱导成功。
  11. 立即撤回栓线，并通过连续收紧两个预先设置的结扎线来结扎 ECA，以防止插入部位出血。
  12. 缝合皮肤切口。
  13. 继续监测动物的生理参数 20 分钟。
  14. 移除 ICP 和激光多普勒血流（LDF）探头，并缝合皮肤切口。

3. 实验结束

  1. 经心脏灌注20 ml生理盐水（室温），随后灌注20 ml含4%多聚甲醛的PBS溶液（4 °C）。
  2. 将脑组织从颅骨中分离。沿颅骨中线及眶腔之间剪开颅骨，然后剥离骨组织以暴露脑组织。
  3. 评估蛛网膜下腔中的血液分布情况。

4. 生存手术情况下的注意事项（视频中未展示）

  1. 麻醉诱导后立即皮下注射卡洛芬（4 mg/kg）以进行术后镇痛。在术后观察期间，每24小时皮下注射一次卡洛芬（4 mg/kg）。
  2. 采用无创血压监测系统，替代有创血压测量。
  3. 为终止麻醉，皮下注射拮抗剂：纳洛酮（1.2 mg/kg）、氟马西尼（0.5 mg/kg）和阿替美唑（2.5 mg/kg）。
  4. 拔除气管插管。
  5. 动物反射恢复后，将其放入预热的保温舱中。保持环境温度约为32 °C，持续24小时。
  6. 术后数小时内应定期检查动物的自主呼吸情况及其总体状况。若脑干受到影响，动物将出现呼吸困难，应实施安乐死。 
  7. 术后每日定期评估动物的总体状况、体重，以及神经功能和感觉功能缺损情况15。

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结果

死亡率

一旦掌握手术技术，该操作不会引起任何术中死亡。此外，几乎在所有动物中均可成功实现放血。术后死亡率为30-40%，其中大多数动物在术后第1天死亡（图5）。

蛛网膜下腔出血后颅内压数值

出血前的颅内压（ICP）约为 4 mmHg。出血导致颅内压急剧升高，可达 120 mmHg。随后，颅内压在 5 分钟内稳定在约 30 mmHg（图 1）。出血后 24 小时，颅内压仍轻度升高至 10 mmHg5。

蛛网膜下腔出血后血压

诱导出血后血压立即升高（图2）。这是由于颅内压升高引发的库欣反射所致。

蛛网膜下腔出血后脑灌注

诱导出血后，可监测到脑灌注显著下降。损...

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讨论

蛛网膜下腔出血（SAH）后的治疗选择有限，且大多疗效不佳。因此，需进一步理解出血后脑损伤的病理生理机制，以识别新的治疗靶点并开发新型治疗策略。在基因修饰动物中建立标准化且可重复性良好的动物模型， 即 小鼠对于此类研究至关重要。由于脑池注血（CWp）模型在病理生理学上与人类蛛网膜下腔出血（SAH）高度相似，已成为SAH研究中广泛使用的模型；然而，该模型在小鼠中的应用受限于较低的可重复性以及较高的个体间变异。模型的变异主要源于不同的麻醉方案，这些方案会改变动物的生理状态。此外，由于血管反应性、血压及凝血功能的个体差异，动物间的出血量也存在差异。12因此，在整个实验过程中监测生理状况，并建立可降低该模型变异性的手术和监测方案至关重要。

蛛网膜下腔出血（SAH）后血液在不同物种间的分布可能存在差异。在大鼠模型中，血液似乎在两侧大脑半球中均匀分布6。由于人类大脑具有沟回状结构，血液更可能主要沿脑沟分布，而非主要沿血管走行。另一方面，供应大脑的动脉通常走行于这些脑沟内，例如大脑中动脉（MCA）位于外侧裂中。因此，啮...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由 Solorz-Zak 研究基金会资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
<强>仪器设备
手术显微镜LeicaKL2500
异氟烷蒸发器哈佛仪器连续流动汽化器
呼吸器Hugo SachsMinivent 845
微型二氧化碳监测仪雨果·萨克斯340型
温度控制器FHC直流温度控制器
牙科钻头PaggenLabset- N
颅内压监测仪CodmanICP监测仪
血压监测仪AD InstrumentsBridge Amp FE221
注射泵World Precision InstrumentsSP101IZ
脉搏血氧仪Kent ScientificMouseSTAT
LDFPerimedPeriflux 5000
模拟数据监测器AD InstrumentsPower Lab 16/35
<强>材料
用于ICP探头固定的水泥Speiko羧酸盐水泥
用于LDF探头固定的胶水Bob Smith Industries氰基丙烯酸酯胶水（Maxi Cure 和 Insta Set）
静脉导管强生Jelco 翼状静脉留置针；货号 4076改良型气管插管导管
股动脉导管用导管Smiths Medical细孔聚乙烯导管；内径 0.28 mm，外径 0.61 mm；货号 800/100/100剪切成30 cm长度
用于血管穿孔的导丝EthiconProlene 5-0切成12 mm长度
外科手术器械精细科学仪器医用镊子 #5，8 cm 血管剪，4 mm 咬合面微型夹

参考文献

  1. Cahill, J., Zhang, J. H. Subarachnoid hemorrhage: is it time for a new direction. Stroke. 40, 86-87 (2009).
  2. van Gijn, J., Kerr, R. S., Rinkel, G. J. Subarachnoid haemorrhage. Lancet. 369, 306-318 (2007).
  3. Lin, C. L., et al. A murine model of subarachnoid hemorrhage-induced cerebral vasospasm. J. Neurosci. Methods. 123, 89-97 (2003).
  4. Altay, T., et al. A novel method for subarachnoid hemorrhage to induce vasospasm in mice. J. Neurosci. Methods. 183, 136-140 (2009).
  5. Feiler, S., Friedrich, B., Scholler, K., Thal, S. C., Plesnila, N. Standardized induction of subarachnoid hemorrhage in mice by intracranial pressure monitoring. J. Neurosci. Methods. 190, 164-170 (2010).
  6. Bederson, J. B., Germano, I. M., Guarino, L. Cortical blood flow and cerebral perfusion pressure in a new noncraniotomy model of subarachnoid hemorrhage in the rat. Stroke. 26, 1086-1091 (1995).
  7. Veelken, J. A., Laing, R. J., Jakubowski, J. The Sheffield model of subarachnoid hemorrhage in rats. Stroke. 26, 1279-1283 (1995).
  8. Kamii, H., et al. Amelioration of vasospasm after subarachnoid hemorrhage in transgenic mice overexpressing CuZn-superoxide dismutase. Stroke. 30, 867-871 (1999).
  9. Parra, A., et al. Mouse model of subarachnoid hemorrhage associated cerebral vasospasm: methodological analysis. Neurol. Res. 24, 510-516 (2002).
  10. Broderick, J. P., Brott, T. G., Duldner, J. E., Tomsick, T., Leach, A. Initial and recurrent bleeding are the major causes of death following subarachnoid hemorrhage. Stroke. 25, 1342-1347 (1994).
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  13. Wang, Z., Schuler, B., Vogel, O., Arras, M., Vogel, J. What is the optimal anesthetic protocol for measurements of cerebral autoregulation in spontaneously breathing mice? Exp. Brain Res. 207, 249-258 (2010).
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  15. Feiler, S., Plesnila, N., Thal, S. C., Zausinger, S., Scholler, K. Contribution of matrix metalloproteinase-9 to cerebral edema and functional outcome following experimental subarachnoid hemorrhage. Cerebrovasc. Dis. 32, 289-295 (2011).

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