建立抗菌剂对浮游细胞（MBC-P）和生物膜细胞（MBC-B）的最小杀菌浓度

摘要

该方案可实现对能够形成生物膜的细菌菌株的浮游状态与生物膜状态耐药性的直接比较 体外 使用96孔微孔板。将浮游或生物膜细菌暴露于系列稀释的待测抗菌剂中。通过在琼脂平板上的生长情况检测细菌活性。

摘要

本方案可实现对能够形成生物膜的细菌菌株的浮游状态与生物膜状态耐药性的直接比较 体外将细菌接种至96孔微孔板的各孔中。在浮游菌检测中，向细菌悬液中加入所选抗菌剂的系列稀释液。在生物膜检测中，接种后，让细菌在设定的时间内形成生物膜。随后移除未贴壁的细胞，更换培养基，并加入所选抗菌剂的系列稀释液。经抗菌剂处理后，检测浮游菌的生长情况。对于生物膜检测，更换不含抗菌剂的新鲜培养基，使生物膜中的细菌进入恢复期。在恢复期结束后检测生物膜细胞的存活率。该抗菌剂的浮游菌最低杀菌浓度（MBC-P）定义为能够杀死浮游培养物中细菌的最低药物浓度。  相比之下，菌株的MBC-B通过将预先形成的生物膜暴露于浓度递增的抗菌剂中24小时来确定。MBC-B定义为能够杀死生物膜中细胞的最低抗菌剂浓度。

引言

最初开发的抗生素抗性检测方法主要用于检测浮游（游动）状态细菌培养物的抗性。由于许多细菌感染涉及生物膜（附着于表面的细胞群落），我们希望开发一种能够特异性检测生物膜抗生素抗性的方法。然而，目前大多数抗生素抗性检测方法并不适合用于测定生物膜的抗性。例如，测定最低抑菌浓度（MIC）是评估浮游细菌培养物抗生素抗性的金标准 ¹该实验包括将稀释的浮游培养物与一系列浓度梯度的抗生素溶液混合。  抑制浮游细胞可见生长的抗生素浓度即为最低抑菌浓度（MIC）。由于该实验基于对生长的抑制作用，根据定义，其无法适用于生物膜培养物，因为后者需要检测预先形成生物膜中细胞的抗生素敏感性。与测定生长抑制不同，本文所述的生物膜最低杀菌浓度（MBC-B）实验旨在确定能够杀死已存在于生物膜中细胞的抗生素浓度。因此，该实验旨在模拟对已建立的生物膜感染的抗生素治疗，从而更真实地反映细菌对抗生素的耐药性。 体内.

由于生物膜通常比浮游培养物具有更强的抗生素耐药性^2-4，因此有必要设计一种方法，能够直接关联生物膜与浮游培养物的抗生素耐药性。该方法的另一个目标是能够直接比较浮游细胞与生物膜细胞之间的抗生素耐药水平。本文所述的MBC-P和MBC-B检测方法实现了这一目标，因为细胞是在相似条件下培养的。我们已利用该方法研究了多个对生物膜特异性抗生素耐药性具有重要作用的基因^5-8。

方案

1. MBC-B

1. 培养生物膜（改编自 O'Toole）⁹).
   1. 在37 °C的丰富培养基中培养目标野生型菌株和突变株16小时。
   2. 将过夜培养的饱和菌液按1:100比例稀释至新鲜培养基中，用于抗生素抗性检测。一种标准培养基为 P. aeruginosa M63 最小培养基添加硫酸镁和精氨酸（见 表1该培养基可促进形成更牢固的生物膜。
   3. 在96孔微孔板的每个孔中加入100 μl稀释液（参见 表1）。由于这些检测通常对每种菌株进行三个重复，因此每种菌株应有24个孔。
   4. 将微孔板在37 °C下孵育24小时。
2. 暴露已形成的生物膜于抗生素浓度梯度中
   1. 配制10倍浓缩液 抗生素稀释系列，共7个孔。示例：抗生素妥布霉素在各孔中的终浓度分别为0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.0125 和 0.006 mg/ml ^5-8 从25 mg/ml的储备液中，制备10倍浓缩液 4、2、1、0.5、0.25、0.125 和 0.06 mg/ml 的稀释液，置于冰上。
   2. 使用多通道移液器移除废弃的上清液（含浮游细胞）（参见 表1).
   3. 向所有孔中加入 90 μl M63 (Mg/Arg)。
   4. 加入每种10x溶液10 μl 抗生素浓度，以达到所需的最终浓度。每个重复和菌株的最后一个孔中加入10 μl水（无抗生素对照）。
   5. 将微孔板在37 °C下孵育24小时。
3. 更换培养基并促进活细胞的脱落。
   1. 使用多通道移液器移除废弃上清液（含浮游细胞）。
   2. 向所有孔中加入 115 μl M63 (Mg/Arg)。
   3. 将微孔板在37 °C下孵育24小时。
4. 活细胞检测
   1. 每个96孔微孔板标记两块LB琼脂平板。
   2. 对多齿装置进行灭菌（参见 表1）通过将多孔针浸入100%乙醇中，随后在本生灯火焰上灼烧针尖进行灭菌。重复此步骤一次。让针尖稍作冷却。使用多孔针装置，从微孔板各孔中转移约3 μl的浮游培养物（通常附着在针尖上的液量） 将平板置于LB琼脂平板表面。
   3. 将LB琼脂平板在37 °C下孵育16小时。
   4. 通过肉眼观察确定细菌生长的临界点，以测定抗生素的最低杀菌浓度图1).

2. MBC-P 

1. 制备细菌菌株
   1. 在37 °C的丰富培养基中培养目标野生型菌株和突变株16小时。
   2. 将过夜培养的饱和菌液按1:100比例稀释至新鲜培养基中，用于抗生素抗性检测。一种标准培养基为 P. aeruginosa 是添加了硫酸镁和精氨酸的M63最低培养基（参见 表1).
   3. 在96孔微孔板中每孔加入90 μl稀释液（参见 表1由于这些实验通常对每种菌株进行三重复，因此每种菌株应有24个孔。
2. 将浮游细胞暴露于抗生素浓度梯度中
   1. 配制 10x 溶液 抗生素稀释系列，共7个孔。示例：对于抗生素妥布霉素，各孔中的终浓度分别为0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001和0.0005 mg/ml。从25 mg/ml的母液出发，配制0.32、0.16、0.08、0.04、0.02、0.01和0.005 mg/ml的稀释液。置于冰上保存。
   2. 加入每种10x溶液10 μl 为达到所需的最终浓度，加入相应浓度的抗生素。每个重复和菌株的最后一个孔中加入10 μl水（无抗生素对照）。
   3. 将微孔板在37 °C下孵育24小时。
3. 活细胞检测
   1. 每块96孔微孔板标记两块LB琼脂平板。
   2. 对多头装置进行灭菌（参见 表1) 将多针接种工具的针尖浸入100%乙醇中，随后通过本生灯火焰灼烧灭菌，重复一次。待针尖稍冷却后，用该工具从微孔板各孔中转移约3 μl（通常附着在针尖上的液量）浮游培养物至LB琼脂平板表面。
   3. 将LB琼脂平板孵育16小时 在 37 °C 下。
   4. 通过肉眼观察确定细菌生长的抑制界限，以测定抗生素的最小杀菌浓度图2).

结果

进行了MBC-P和MBC-B实验，比较了PA14野生型与PA14 ∆ndvB的敏感性。抗生素采用妥布霉素。结果显示了MBC-B实验第1.4.4步（图1）和MBC-P实验第2.3.4步（图2）的结果。PA14和∆ndvB菌株均以三重复方式接种至MBC-P和MBC-B实验中。完成MBC-B实验步骤1.0–1.4以及MBC-P实验步骤2.0–2.3后，将存活的细胞涂布于LB琼脂平板上。妥布霉素浓度（μg/ml）标注在细胞图像左侧。PA14的MBC-B值为100 μg/ml，∆ndvB的MBC-B值为12.5 μg/ml。PA14和∆ndvB突变株的MBC-P值均为8 <...

讨论

浮游细胞中的抗生素耐药性定义为：由于细胞发生永久性改变（例如突变），导致抗生素的最低抑菌浓度（MIC）升高。迄今为止已发现的生物膜特异性耐药或耐受机制，均源于生物膜内野生型基因的表达。因此，传统的耐药性定义不适用于生物膜。然而，另一套定义已被提出：耐药机制阻止抗生素到达其作用靶点，而耐受机制则使抗生素的靶点失活¹⁰。生物膜特异性的抗生素耐药机制涵盖了上述两种定义。本实验方案中通篇使用了“耐药性"这一术语，但尚需进一步实验以确定某个基因是参与耐药性还是耐受性。

MBC-P 和 MBC-B 检测方法可适用于任何能够形成生物膜的细菌菌株以及任何杀菌性抗菌剂。将该检测方法应用于其他细菌或其他抗菌剂时，有两个关键标准：一是确定能够诱导生物膜形成的条件，二是利用目标野生型菌株确定抗菌剂的合适浓度范围。合适的生物膜形成条件可通过参考 George O'Toole 在 JoVE 上发表的生物膜形成实验方案来确定⁹。为了确定 MBC-B 检测的合适浓度范围，一个有效的经验法则是将 25 × MIC（最低抑菌浓度^...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1x M63			配制为5倍浓度溶液 M63 培养基母液：溶解 15 g KH2PO4，35克 K2HPO4 和10克(NH₄)₂SO₄4)2SO4 在1 L水中。该储备液无需高压灭菌，可室温保存。  稀释5倍 储备液1:5，高压灭菌，冷却后加入所需组分。
KH2PO4	Fisher	P285-500
K2HPO4	Fisher	P288-500
(NH4)2SO4	Sigma	A5132
硫酸镁	Fisher	M63-500	加入至终浓度为 1 mM。  用水配制成1 M的储存液，并进行高压灭菌。
妥布霉素	Sigma		制备 50 mg/m 储备液。分装后于 -20°C.
精氨酸	Sigma	A5131	加入至终浓度为 0.4%。  用水配制成20%的储存液，并通过滤膜除菌。  这种替代性碳源/能源可取代葡萄糖和酪蛋白氨基酸
96孔微孔板	康宁	3595	无菌、平底、低蒸发
Tranferpette（多通道移液器）	BrandTech	2703610	8通道，20-200 μl
多臂装置	Dan-Kar	MC48	48 个插针插入 ½ 96孔微孔板