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方法文章

远程磁控微米级探针 原位 细菌生物膜物理特性的三维映射

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DOI：

10.3791/50857

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2014年5月2日

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1Physicochime Curie, CNRS UMR 168, Institut Curie, Sorbonne Universités, UPMC, 2Unité de Génétique des Biofilms, Institut Pasteur, 3Laboratoire Jean Perrin, CNRS UMR 8237, Sorbonne Universités, UPMC

本文内容

摘要

本文展示了一种基于磁性颗粒在细菌生物膜中植入并利用特制磁镊进行远程操控的原创方法，用于测量 原位 微生物在界面处构建的复杂活体材料的局部力学性能。

摘要

细菌在界面上的黏附与生长会形成被称为生物膜的三维异质结构。这些结构中的细胞通过由胞外聚合物物质网络介导的物理相互作用相互连接。细菌生物膜对人类活动具有广泛影响，深入理解其特性对于有效控制其发育（根据其有害或有益效应选择维持或清除）至关重要。本文介绍了一种旨在测量 原位 生物膜的局部物理特性，迄今为止仅从宏观和均质材料的角度进行过研究。本文所述的实验 通过将磁性颗粒引入生长中的生物膜，以植入可在不干扰生物膜结构特性的前提下远程操控的局部探针。为此专门开发了磁镊装置，可在生物膜内每个嵌入的颗粒上施加定义明确的作用力。该装置安装在显微镜载物台上，以实现对 记录颗粒牵引过程中的延时图像。随后从牵引序列中提取颗粒轨迹，并根据每个颗粒的位移曲线推导出局部黏弹性参数，从而获得参数的三维空间分布。从工程学角度而言，了解生物膜的力学特性对于生物膜控制至关重要；同时，从基础研究的角度，也有助于阐明这些结构的构型特性与其特定生物学功能之间的关系。

引言

细菌生物膜是由与生物或人工表面相关的细菌组成的群落1-3。它们通过黏附-生长机制形成，并伴随产生富含多糖的胞外基质，从而保护并稳定这一结构4,5。这些生物膜并非仅仅是附着在表面上的被动细胞集合，而是有序且动态的复杂生物系统。当细菌从浮游状态转变为生物膜生活方式时，会观察到基因表达和细胞生理的改变，同时对抗微生物剂和宿主免疫防御的能力增强，这正是许多持续性和慢性感染的根源6。然而，对这些活体结构的可控性发育也为工业和环境应用提供了机会，例如危险废物场所的生物修复、工业用水的生物过滤，或形成生物屏障以保护土壤和地下水免受污染。

尽管与生物膜生活方式相关的分子特征正被越来越多地描述，但驱动群落发育和维持的机制仍不明确。利用扫描电化学显微技术或荧光显微技术在微尺度测量方面的最新进展，已发现这些生命群体表现出显著的结构、化学和生物学异质性7然而，迄今为止，生物膜力学特性主要在宏观尺度上进行研究。例如，通过观察生物膜丝状结构在流体流速变化下的形变8,9,  从琼脂培养基上取下的生物膜片段或在盖玻片上生长的生物膜的单轴压缩10,11，从环境中采集的生物膜经剪切后转移至平行板流变仪12,13，使用附着在原子力显微镜悬臂上的玻璃珠并涂覆有细菌生物膜的原子力谱学14 或一种用于测量脱离生物膜碎片拉伸强度的专用微悬臂梁方法15,16 在过去的十年中已实施，为材料的粘弹性特性提供了有用的信息17然而，有关信息似乎很可能 原位 当材料从其原始环境中移除时，生物膜的力学特性会丧失，这在上述方法中经常出现。此外，将生物膜视为均质材料处理，忽略了群落内部物理性质可能存在异质性的信息。因此，生物膜结构力学在生物膜形成以及基因表达模式或化学梯度等生物学特征中的确切作用难以被准确识别。为了实现对生物膜物理特性的微尺度描述，需要开发新的专用工具。

本文详细介绍了一种为实现局部力学参数测量而设计的原创方法 原位，不破坏生物膜的结构，从而能够绘制微尺度材料特性的空间分布图，进而揭示其力学异质性。该实验的原理在于将磁性微粒掺入生长中的生物膜，随后利用磁镊对成熟生物膜中的微粒施加远程作用力。在显微镜下观测微粒在受控磁力作用下的位移，可推导出局部的黏弹性参数，每个微粒均反映其所在局部微环境的特性。基于这些数据，可构建生物膜的三维力学图谱，揭示其空间分布及环境条件依赖性。整个实验过程将在此以一种 E. coli 由携带去阻遏F型质粒的基因工程菌株形成的生物膜。相关结果详见近期发表的一篇论文18 为完整生物膜力学的内部结构提供独特的观察视角。

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方案

1. 细菌培养与菌悬液制备

  1. 从一个新鲜培养的Lysogeny Broth (LB) 琼脂平板上挑取单菌落，接种于5 ml含有100 µg/ml氨苄青霉素和7.5 µg/ml四环素的液体LB培养基中，在37 °C摇床中培养5至6小时。
  2. 然后，取100 µl细菌培养物加入5 ml补充有0.4%葡萄糖及相同浓度抗生素的最低培养基（M63B1）中。将此新鲜稀释的培养物在37 °C摇床中过夜培养。
  3. 培养16小时后，取100 μl过夜培养物加入5 ml M63B1培养基（含0.4%葡萄糖）中。将试管置于37 °C摇床中继续培养，直至达到0.5的OD值。此时菌悬液即可用于注入实验通道以进行生物膜形成。

2. 磁性颗粒的制备

  1. 从储备液中取10 μl磁性颗粒（直径2.8 µm），使用磁性样品架，用190 μl最低培养基洗涤3次。
  2. 将颗粒浓度调整至5 × 106 个微珠/毫升。通常将50 μl洗涤后的微珠溶液与950 µl含0.4%葡萄糖的M63B1培养基混合。

3. 通道制备与生物膜培养

  1. 通道安装
    1. 将两根长10 cm、边长为800 µm的方形硼硅酸盐玻璃毛细管切割成两段各8 cm长的片段。
    2. 将这两段毛细管用速干氰基丙烯酸酯胶（俗称超级胶）粘附在已预先切成两半的载玻片上，两段之间相距2 cm，每端各伸出1 cm，如图1所示。
    3. 对整个装置以及后续连接通道所需的管路进行高压灭菌处理。
    4. 在超净工作台内准备好所有无菌材料：i) 已安装的通道和捕获装置1，ii) 管路和连接器，iii) 两个气泡捕获装置——一种为常用于儿童输液滴管的气泡过滤器（捕获装置1），另一种为自制的气泡捕获装置，即一段直径较大的4 cm长管（捕获装置2），iv) 夹具，v) 装有M63B1培养基（含0.4%葡萄糖）的30 ml注射器，vi) 废液瓶。
    5. 使用Luer Lock连接器或接头按以下顺序连接整个系统：由注射泵控制的50 ml M63B1注射器、儿科用气泡过滤器、自制气泡捕获装置、毛细管（图1，面板B）以及通向废液瓶的管路。然后用无菌M63B1（含0.4%葡萄糖）填充整个系统，并以约10 ml/hr的流速启动注射泵，该流速应高于实验所需流速。仔细观察并彻底清除回路中的所有气泡。
    6. 让培养基以该流速流经系统10–15分钟；同时，将第1.3节中制备的OD值为0.5的1 ml细菌悬液与第2.2节中制备的1 ml洗涤后微珠溶液混合。
    7. 在管路的两个位置（毛细管前后）安装夹具（暂不关闭）。随后关闭流体流动。
    8. 使用1 ml注射器将细菌-微珠混合液注入自制气泡捕获装置后的毛细管中，操作时注意抬高管路末端以防止空气进入。重新连接管路后关闭夹具。
    9. 对第二个毛细管重复相同操作，并检查所有管路中是否存在气泡。
    10. 将装置转移至显微镜下，静置15–20分钟，使细菌沉降并附着于毛细管内表面。将毛细管安装到显微镜载物台上，废液容器应略高于毛细管位置。将注射泵放置在显微镜旁的实验台面上。将毛细管前的气泡捕获装置略微抬高至高于毛细管平面，以便有效捕获气泡。
  2. 生物膜生长
    1. 调节注射泵的流速并开始流动，生物膜将在毛细管表面按实验所需时间生长——本实验中通常为24或48小时。
    2. 聚焦于毛细管底部平面，开始样品图像的时间序列记录——通常以每分钟采集2张图像的频率即可充分反映生物膜的生长过程。该视频用于监测生物膜生长的对照后阶段（参见视频1、2和3中的片段）。

4. 磁力镊子安装

  1. 将磁镊手动旋紧在可控制的 X-Y-Z 微操纵器上，并将微操纵器固定在显微镜载物台上，以调节磁镊相对于毛细管的位置。参照图2放置磁镊，确保在观察区域产生适当的磁场梯度。
  2. 通过功率放大器将磁镊连接至函数发生器，生成一个40秒周期的信号，其中包括24秒的零信号和16秒的4 A直流电流，并在20秒时向明场光源快门发送触发信号以实现信号同步，从而形成如图3所示的事件序列。
    注意：这两项操作可在毛细管安装完成至测量开始前的任意时间进行。实验概览示意图见图4。

5. 蠕变曲线获取

  1. 使用显微镜载物台的 XY 方向移动控制，将左侧磁极边缘与毛细管左侧边缘移至同一观察视野中。将分析坐标系的原点设在由毛细管边缘和磁极片边缘分别定义的 X 轴与 Y 轴交点处（见图2）。
  2. 通过显微镜的精细调焦旋钮调节毛细管的垂直位置。通常，首个观察平面位于毛细管底部上方 4 至 7 µm 处。视频1 对应的空间视野，其左上角位于空间坐标系的原点。
  3. 开启电流发生器，同时手动触发图像采集程序，启动第 4.2 节及图3中所述的 40 秒事件序列，以获取视频1。
  4. 将显微镜载物台向左移动 250 µm，使毛细管移至相邻的右侧视野，并按照第 5.3 节操作生成第 2 层的视频2，依此类推，直至获得所需视频。通常，在更换观察平面前，沿 X 轴方向采集 3 至 4 个大小为 250 × 250 µm2 的视野；随后更换焦平面，并对新平面重复上述操作。

6. 力的校准

  1. 通过将39.8 g甘油与190 µl双蒸水和10 μl浓度为2 × 109 particles/ml的磁性颗粒混合，制备甘油溶液，并用该混合液填充实验通道，然后将其放置于显微镜载物台上，操作方式与生物膜样品相同。
  2. 按照第4节所述安装磁镊装置后，依照第5.4节说明施加磁力，并进行延时成像，以提取毛细管中每个单个颗粒的速度（v）及其位置，从而生成校准文件。该文件应包含根据斯托克斯定律F = 6πRηv（R：颗粒半径）得出的作用力随毛细管分析区域中位置变化的函数关系。

7. 分析

  1. 使用“粒子追踪”软件获取所有按第5节所述采集的图像序列中每一帧的粒子位置文本文件。根据图像序列的采集频率，计算粒子位移随时间的变化函数例如 图5 和 视频 4).
  2. 使用力校准文件，将位移曲线转换为柔量曲线（材料的总柔量）—— J(t) — 随时间变化) 根据顺应性公式：
    Equation showing J(t)=d(t)(6πR/F); dynamic measurement; physics formula.
    建立了嵌入不可压缩均质粘弹性介质中的半径为 R 的探针粒子的材料应变与施加应力之间的关系，该关系此前由 Schnurr 及其同事确立19.
  3. 将蠕变柔量曲线拟合到广义 Burgers 黏弹性材料模型，并推导黏弹性参数， J0, J1, η0, η1 每个颗粒图6）根据伯格斯公式：
    Viscoelasticity equation J(t) formula, modeling time-dependent material response.
    注意：该现象学分析方法此前已广泛应用于多种材料，包括生物膜等生物材料，以解释宏观流变学数据20-22.

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结果

典型的分析可在不破坏活体生物膜原有结构的情况下，提供微米尺度下黏弹性参数的空间分布。典型结果如图7所示，其中展示了弹性柔量 J0 随生物膜深度方向（z轴）和侧向维度（y轴）的变化情况。每个数据点对应一个微珠，其 J0 值由蠕变曲线分析获得。数据表明，局部柔量在生物膜深度方向上变化近三个数量级，同时在生物膜所有高度上均存在显著的侧向异质性。

这些数据还揭示了顺应性值的分布情况，显示出广泛且不对称的形态（图8），强烈表明生物膜的机械性能由高度交联的聚合物凝胶所支撑。事实上，类似的行为此前已在高浓度且高度交联的肌动蛋白凝胶中得到证实23。

此外，这些 原位 在不同环境条件下（如较低流速）对生物膜局部特性进行测量，能够揭示此类变化对生物膜内部结构的影响。在 图9在0.1 ml/hr流速下生长的生物膜，其顺应性值显示出仍然高度异质的力学特性，但与在1 m...

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讨论

该磁性颗粒接种与牵引实验使得 原位 在原始状态下对生长中生物膜的黏弹性参数进行三维映射。该方法揭示了生物膜的力学异质性 大肠杆菌 此处生长的生物膜提供了线索，指明了支持生物膜物理特性的组分，强烈提示胞外基质具有重要作用，更确切地说，其交联程度尤为关键。

识别细菌生物膜中机械性能的模式对于构建这些复杂材料的全面表征至关重要。这些发现为进一步阐明机械模式与生物学异质性（如基因表达微环境）之间的因果关系指明了方向，有助于揭示驱动生物膜发育的根本作用力。

迄今为止，生物膜力学特性的研究主要从宏观角度进行，且通常通过从其初始附着位点刮取生物膜来开展8,9,12,13，这代表了重要的信息丢失风险。我们的非侵入性方法首次实现了 原位 在原始环境中表征生物膜三维力学特性

该方法目前仍存在局限性，源于胶体探针磁驱动远程操控的特性。实际上，可施加的作用力范围受限于磁极与颗粒之间的距离、磁极材料的性质以及线圈的性能。当...

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披露

我们没有需要披露的内容。

致谢

本工作部分得到了法国国家研究局（Agence Nationale pour la Recherche）PIRIbio 项目 Dynabiofilm 和法国国家科学研究中心（CNRS）跨学科风险项目的资助。我们感谢 Philippe Thomen 对手稿的审阅，以及 Christophe Beloin 提供本研究中使用的 E. coli 菌株。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
表1： 试剂与细胞
磁性颗粒Life technologies14307D微米级磁性颗粒，直径2.8 µm
氨苄青霉素（抗生素）Sigma-AldrichA9518
四环素（抗生素）Sigma-Aldrich87128
细菌菌株 MG1655gfpFUGB, Institut Pasteur, France表面产生F菌毛，对氨苄青霉素和四环素具有抗性。
表2： 毛细管与管路
儿科灌注用滤器Prodimed-Plastimed6932002
方形中空毛细管Composite Metal Scientific8280-100由硼硅酸盐玻璃制成，截面为0.8 mm × 0.8 mm的正方形
过氧化硅胶管路VWR international228-0512直径1 mm
过氧化硅胶管路VWR international228-0700直径3 mm
表3： 生物膜培养
胰蛋白胨肉汤（LB）溶液Amresco-VWRJ106-10PK用于培养细菌的标准培养基。
M63B1溶液自制用于培养细菌的标准最低培养基。
葡萄糖Sigma-AldrichG8270用于配制含0.4%葡萄糖的M63B1培养基。
表4： 电子设备
EMCCD相机  HamamatsuC9100-02
加热控制器World precision instruments300354
函数发生器Agilent technologies33210A
功率放大器自制可输出最大4 A电流信号。
注射泵Kd ScientificKDS-220
快门Vincent AssociatesUniblitz T132
磁镊自制两个电磁极，每个由2120匝直径0.56 mm的铜线绕制而成，并配有软磁合金磁芯（Supra50-Arcelor Mittal，法国），磁芯形状为正方形，结构如图10所示。两个磁芯以北极对南极的方式安装，以便在毛细管长度方向上产生单向磁力。线圈绕制细节见图11。
表5： 光学设备
倒置显微镜 NikonTE-300
S Fluor ×40物镜（NA 0.9，WD 0.3）Nikon该物镜工作距离较长，可用于深度观察生物膜。
落射荧光滤光片：1）绿色荧光：激发480/20 nm；二向色镜495；发射510/20  2）红色荧光：激发540/25 nm；二向色镜565；发射605/55Chroma1)#49020 2)#31002施加力后颗粒位移的记录使用红色荧光滤光片组。
表6： 图像分析
ImageJNIH - 粒子追踪插件

参考文献

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  12. Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. Commonality of elastic relaxation times in biofilms. Physical Review Letters. 93, (2004).
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  17. Guélon, T., Mathias, J. -D., Stoodley, P. Biofilm Highlights. Series on Biofilms (eds Hans-Curt Flemming, Jost Wingender, & Ulrich Szewzyk). 5, Springer. Berlin Heidelberg. (2011).
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  19. Schnurr, B., Gittes, F., MacKintosh, F. C., Schmidt, C. F. Determining Microscopic Viscoelasticity in Flexible and Semiflexible Polymer Networks from Thermal Fluctuations. Macromolecules. 30, 7781-7792 (1997).
  20. Aggarwal, S., Hozalski, R. M. Effect of Strain Rate on the Mechanical Properties of Staphylococcus epidermidis Biofilms. Langmuir. 28, 2812-2816 (2012).
  21. Towler, B. W., Cunningham, A., Stoodley, P., McKittrick, L. A model of fluid-biofilm interaction using a Burger material law. Biotechnol Bioeng. 96, 259-271 (2007).
  22. Jones, W. L., Sutton, M. P., McKittrick, L., Stewart, P. S. Chemical and antimicrobial treatments change the viscoelastic properties of bacterial biofilms. Biofouling. 27, 207-215 (2011).
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