远程磁控微米级探针 原位 细菌生物膜物理特性的三维映射

摘要

本文展示了一种基于磁性颗粒在细菌生物膜中植入并利用特制磁镊进行远程操控的原创方法，用于测量 原位 微生物在界面处构建的复杂活体材料的局部力学性能。

摘要

细菌在界面上的黏附与生长会形成被称为生物膜的三维异质结构。这些结构中的细胞通过由胞外聚合物物质网络介导的物理相互作用相互连接。细菌生物膜对人类活动具有广泛影响，深入理解其特性对于有效控制其发育（根据其有害或有益效应选择维持或清除）至关重要。本文介绍了一种旨在测量 原位 生物膜的局部物理特性，迄今为止仅从宏观和均质材料的角度进行过研究。本文所述的实验 通过将磁性颗粒引入生长中的生物膜，以植入可在不干扰生物膜结构特性的前提下远程操控的局部探针。为此专门开发了磁镊装置，可在生物膜内每个嵌入的颗粒上施加定义明确的作用力。该装置安装在显微镜载物台上，以实现对 记录颗粒牵引过程中的延时图像。随后从牵引序列中提取颗粒轨迹，并根据每个颗粒的位移曲线推导出局部黏弹性参数，从而获得参数的三维空间分布。从工程学角度而言，了解生物膜的力学特性对于生物膜控制至关重要；同时，从基础研究的角度，也有助于阐明这些结构的构型特性与其特定生物学功能之间的关系。

引言

细菌生物膜是由与生物或人工表面相关的细菌组成的群落^1-3。它们通过黏附-生长机制形成，并伴随产生富含多糖的胞外基质，从而保护并稳定这一结构^4,5。这些生物膜并非仅仅是附着在表面上的被动细胞集合，而是有序且动态的复杂生物系统。当细菌从浮游状态转变为生物膜生活方式时，会观察到基因表达和细胞生理的改变，同时对抗微生物剂和宿主免疫防御的能力增强，这正是许多持续性和慢性感染的根源⁶。然而，对这些活体结构的可控性发育也为工业和环境应用提供了机会，例如危险废物场所的生物修复、工业用水的生物过滤，或形成生物屏障以保护土壤和地下水免受污染。

尽管与生物膜生活方式相关的分子特征正被越来越多地描述，但驱动群落发育和维持的机制仍不明确。利用扫描电化学显微技术或荧光显微技术在微尺度测量方面的最新进展，已发现这些生命群体表现出显著的结构、化学和生物学异质性⁷然而，迄今为止，生物膜力学特性主要在宏观尺度上进行研究。例如，通过观察生物膜丝状结构在流体流速变化下的形变^8,9,  从琼脂培养基上取下的生物膜片段或在盖玻片上生长的生物膜的单轴压缩^10,11，从环境中采集的生物膜经剪切后转移至平行板流变仪^12,13，使用附着在原子力显微镜悬臂上的玻璃珠并涂覆有细菌生物膜的原子力谱学¹⁴ 或一种用于测量脱离生物膜碎片拉伸强度的专用微悬....

方案

1. 细菌培养与菌悬液制备

1. 从一个新鲜培养的Lysogeny Broth (LB) 琼脂平板上挑取单菌落，接种于5 ml含有100 µg/ml氨苄青霉素和7.5 µg/ml四环素的液体LB培养基中，在37 °C摇床中培养5至6小时。
2. 然后，取100 µl细菌培养物加入5 ml补充有0.4%葡萄糖及相同浓度抗生素的最低培养基（M63B1）中。将此新鲜稀释的培养物在37 °C摇床中过夜培养。
3. 培养16小时后，取100 μl过夜培养物加入5 ml M63B1培养基（含0.4%葡萄糖）中。将试管置于37 °C摇床中继续培养，直至达到0.5的OD值。此时菌悬液即可用于注入实验通道以进行生物膜形成。

2. 磁性颗粒的制备

1. 从储备液中取10 μl磁性颗粒（直径2.8 µm），使用磁性样品架，用190 μl最低培养基洗涤3次。
2. 将颗粒浓度调整至5 × 10⁶ 个微珠/毫升。通常将50 μl洗涤后的微珠溶液与950 µl含0.4%葡萄糖的M63B1培养基混合。

3. 通道制备与生物膜培养

1. 通道安装
   1. 将两根长10 cm、边长为800 µ

结果

典型的分析可在不破坏活体生物膜原有结构的情况下，提供微米尺度下黏弹性参数的空间分布。典型结果如图7所示，其中展示了弹性柔量 J₀ 随生物膜深度方向（z轴）和侧向维度（y轴）的变化情况。每个数据点对应一个微珠，其 J₀ 值由蠕变曲线分析获得。数据表明，局部柔量在生物膜深度方向上变化近三个数量级，同时在生物膜所有高度上均存在显著的侧向异质性。

这些数据还揭示了顺应性值的分布情况，显示出广泛且不对称的形态（图8），强烈表明生物膜的机械性能由高度交联的聚合物凝胶所支撑。事实上，类似的行为此前已在高浓度且高度交联的肌动蛋白凝胶中得到证实²³。

此外，这些 原位 在不同环境条件下（如较低流速）对生物膜局部特性进行测量，能够揭示此类变化对生物膜内部结构的影响。在 图9在0.1 ml/hr流速下生长的生物膜，其顺应性值显示出仍然高度异质的力学特性，但与在1 m.......

讨论

该磁性颗粒接种与牵引实验使得 原位 在原始状态下对生长中生物膜的黏弹性参数进行三维映射。该方法揭示了生物膜的力学异质性 大肠杆菌 此处生长的生物膜提供了线索，指明了支持生物膜物理特性的组分，强烈提示胞外基质具有重要作用，更确切地说，其交联程度尤为关键。

识别细菌生物膜中机械性能的模式对于构建这些复杂材料的全面表征至关重要。这些发现为进一步阐明机械模式与生物学异质性（如基因表达微环境）之间的因果关系指明了方向，有助于揭示驱动生物膜发育的根本作用力。

迄今为止，生物膜力学特性的研究主要从宏观角度进行，且通常通过从其初始附着位点刮取生物膜来开展^8,9,12,13，这代表了重要的信息丢失风险。我们的非侵入性方法首次实现了 原位 在原始环境中表征生物膜三维力学特性

该方法目前仍存在局限性，源于胶体探针磁驱动远程操控的特性。实际上，可施加的作用力范围受限于磁极与颗粒之间的距离、磁极材料的性质以及线圈的性能。当.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
表1： 试剂与细胞
磁性颗粒	Life technologies	14307D	微米级磁性颗粒，直径2.8 µm
氨苄青霉素（抗生素）	Sigma-Aldrich	A9518
四环素（抗生素）	Sigma-Aldrich	87128
细菌菌株 MG1655gfpF	UGB, Institut Pasteur, France		表面产生F菌毛，对氨苄青霉素和四环素具有抗性。
表2： 毛细管与管路
儿科灌注用滤器	Prodimed-Plastimed	6932002
方形中空毛细管	Composite Metal Scientific	8280-100	由硼硅酸盐玻璃制成，截面为0.8 mm × 0.8 mm的正方形
过氧化硅胶管路	VWR international	228-0512	直径1 mm
过氧化硅胶管路	VWR international	228-0700	直径3 mm
表3： 生物膜培养
胰蛋白胨肉汤（LB）溶液	Amresco-VWR	J106-10PK	用于培养细菌的标准培养基。
M63B1溶液	自制		用于培养细菌的标准最低培养基。
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	用于配制含0.4%葡萄糖的M63B1培养基。
表4： 电子设备
EMCCD相机	Hamamatsu	C9100-02
加热控制器	World precision instruments	300354
函数发生器	Agilent technologies	33210A
功率放大器	自制		可输出最大4 A电流信号。
注射泵	Kd Scientific	KDS-220
快门	Vincent Associates	Uniblitz T132
磁镊	自制		两个电磁极，每个由2120匝直径0.56 mm的铜线绕制而成，并配有软磁合金磁芯（Supra50-Arcelor Mittal，法国），磁芯形状为正方形，结构如图10所示。两个磁芯以北极对南极的方式安装，以便在毛细管长度方向上产生单向磁力。线圈绕制细节见图11。
表5： 光学设备
倒置显微镜	Nikon	TE-300
S Fluor ×40物镜（NA 0.9，WD 0.3）	Nikon		该物镜工作距离较长，可用于深度观察生物膜。
落射荧光滤光片：1）绿色荧光：激发480/20 nm；二向色镜495；发射510/20  2）红色荧光：激发540/25 nm；二向色镜565；发射605/55	Chroma	1)#49020 2)#31002	施加力后颗粒位移的记录使用红色荧光滤光片组。
表6： 图像分析
ImageJ	NIH - 粒子追踪插件