介绍了在秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）中检测抗精神病药物（APDs）作用的方法。描述了用于评估药物对发育和存活率以及咽部泵动速率影响的实验方案。这些方法也可应用于除APDs以外其他药物类别的药物遗传学实验。
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摘要
摘要
Caenorhabditis elegans 是一种结构简单的遗传学模式生物，适用于大规模的正向和反向遗传筛选以及化学遗传筛选。C. elegans 基因组中包含在人类中保守的潜在抗精神病药物（APD）靶点，包括编码神经递质合成相关蛋白以及突触结构和功能相关蛋白的基因。抗精神病药物的暴露会以浓度依赖的方式导致线虫出现发育延迟和/或致死现象。这些表型部分是由于抗精神病药物抑制了咽部泵动所致1,2。因此，该发育表型具有神经肌肉基础，使其适用于抗精神病药物的药物遗传学研究。本文详细演示了检测抗精神病药物对线虫发育及咽部泵动影响的实验方法。在发育实验中，将同步化的胚胎置于含有抗精神病药物的线虫生长培养基（NGM）平板上，随后每日记录发育中个体所处的发育阶段。在咽部泵动速率检测中，选取特定发育阶段的年轻成虫在含有抗精神病药物的NGM平板上进行测试，记录单位时间内的咽部泵动次数，并计算泵动速率。这些实验方法也可用于研究其他多种小分子甚至大分子的作用。
引言
Caenorhabditis elegans 是一种结构简单的遗传学模式生物，适用于大规模的正向和反向遗传筛选以及化学遗传筛选。C. elegans 对多种生物活性化合物具有敏感性，因此已被成功用于阐明多种此类化合物的作用机制。例如，利用线虫药物遗传学研究的生物活性化合物包括乙酰胆碱受体激动剂（例如 左旋咪唑、尼古丁、莫仑太尔和吡喹酮）、麻醉剂（例如 氟烷）、咖啡因、胆碱酯酶抑制剂（例如 涕灭威、克百威和敌百虫）、氟化物、GABA相关化合物（例如 GABA和蝇蕈醇）、伊维菌素、百草枯、佛波酯以及5-羟色胺相关药物（例如 5-羟色胺和丙米嗪）3。此外，C. elegans 已被用于大规模小分子筛选，有助于发现新的生物活性化合物并鉴定新的遗传靶点4。
的 秀丽隐杆线虫 基因组包含在人类中保守的潜在抗精神病药物（APD）靶点，包括编码神经递质合成以及突触结构和功能相关蛋白的基因5因此， 秀丽隐杆线虫 神经遗传学与神经生物学为发现抗精神病药物（APDs）作用的新型分子机制提供了方法。在秀丽线虫中，发育早期暴露于抗精神病药物会导致发育延迟，而在较高浓度下则会导致死亡2,6成....
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方案
1. 发育迟缓/致死率检测：在12孔板中，对野生型（N2）及两种突变型（Mut1 和 Mut2）菌株在三种氯氮平浓度下进行测试
- 第1天，将2 ml NGM培养基10倒入12孔板的每个孔中（每孔直径为2 cm），在室温（RT）下静置过夜使其凝固。同一天，挑取一单个大肠杆菌（Escherichia coli）OP50菌落，接种至50 ml LB液体培养基中，在37 °C、220 rpm摇床中过夜培养。
- 第2天，将20 µl OP50菌液转移至每个NGM孔的中央。将培养板置于37 °C培养箱中，或在室温下过夜放置，以促进细菌菌膜增厚。
- 通过将氯氮平溶解于DMSO（二甲基亚砜）溶剂中，配制80 mM氯氮平储备液。然后根据表1，用储备液与1.7 mM乙酸稀释，配制80 µl工作溶液。
注意：针对特定研究药物的工作浓度，需通过一系列预实验浓度梯度测试，确定最适浓度以区分野生型与突变体。 - 将80 µl氯氮平工作溶液转移至已接种细菌的NGM孔中，轻轻旋转培养板使溶液均匀分布于表面。待培养板干燥后，当天即可用于实验，或置于20 °C培养箱中保存，次日使用。
注意：由于氯氮平溶解度较低，尤其在高浓度时，工作溶液为药物悬浮液。因此，在将溶液转移至药物板前，需充分涡旋混....
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结果
1. 发育迟缓/致死性实验结果
发育延迟/致死性实验的典型结果如图1a和图1b所示。当对照组中的野生型个体已发育至产卵成虫阶段时（图1a），暴露于氯氮平的野生型个体仍处于幼龄幼虫阶段或已死亡（图1b）。图1c展示了在三种不同浓度的氯氮平处理下，抑制型突变体（Mut1）和增强型突变体（Mut2）与野生型的代表性结果比较。在所有三种氯氮平浓度下，Mut1的致死率均低于野生型，而Mut2的致死率则高于野生型。Mut1存活个体的发育阶段较野生型更为成熟，而Mut2存活个体则表现出相较于野生型的发育延迟。
2. 咽泵频率检测结果
图2展示了在两种氯氮平浓度下，抑制型突变体（Mut.......
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讨论
本文描述了检测抗精神病药物（APDs）对秀丽隐杆线虫（C. elegans）发育和行为影响的方法。由于该类药物在水中溶解度较低，因此使用二甲基亚砜（DMSO）或乙醇来溶解氯氮平。已有报道指出溶剂可能影响C. elegans的生物学特性12，因此必须设置仅含DMSO或仅含乙醇的对照组。我们在实验中使用的最高DMSO浓度为3%，此浓度对C. elegans的发育无明显影响。DMSO可用于溶解多种小分子，甚至某些大分子，例如 脂酸。
这些检测中使用的APD浓度高于给予人类的剂量。这在大多数小分子研究中是常见的 秀丽隐杆线虫，因为高浓度是穿透所必需的 秀丽隐杆线虫 角质层。HPLC 分析表明，氯氮平在 秀丽隐杆线虫 发育测定中的组织接近人脑中预期的组织2.
对于大分子的研究而言，穿透角质层是一个特别值得关注的问题。acs-20突变体以及Bu.......
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披露
作者声明不存在利益冲突。
致谢
本工作获得了美国国立卫生研究院临床科学家发展奖K08NS002083、谢尔弗特·弗雷泽研究所研究基金以及NARSAD青年研究者奖的资助，上述奖项均授予Edgar A. Buttner。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氯氮平 | Sigma | C6305 | |
| 二甲基亚砜 (DMSO) | Sigma | D8418 | |
| 乙酸 (HAC) | Fisher | BP2401 | |
| 氢氧化钠 (NaOH) | EMD | SX0590-13 | |
| 次氯酸盐 | Sigma-Aldrich | 425044 | |
| 5810 型离心机 | Eppendorf | 5810 000.017 | |
| 摇床培养箱 | New Brunswick Scientific | M1246-0006 | |
| 低温培养箱 815 | Precision Scientific | J1790-1B | |
| 体视显微镜 | Olympus | SZX12 | |
| 35 × 10 mm 培养皿 | Fisher Scientific | NC9434271 | |
| 12 孔组织培养板 | BD Falcon | REF 353043 |
参考文献
- Donohoe, D. R., Jarvis, R. A., Weeks, K., Aamodt, E. J., Dwyer, D. S. Behavioral adaptation in C. elegans produced by antipsychotic drugs requires serotonin and is associated with calcium signaling and calcineurin inhibition. Neurosci. Res. 64, 280-289 (2009).
- Karmacharya, R., et al.
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重印与许可
