蛋白质可折叠成天然结构，也可错误折叠形成不溶性淀粉样蛋白。有利于错误折叠途径的条件可导致不同类型的淀粉样纤维形成。本文所述方法可实现天然蛋白质向淀粉样蛋白的快速转化 体外.
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本文内容
摘要
摘要
蛋白质通过其特定的三维折叠结构发挥功能，从而在生物体中执行关键任务。尽管多肽链的天然结构已具备多种功能，但目前人们认识到大多数蛋白质能够形成富含β折叠的淀粉样蛋白替代构象。不溶性的淀粉样纤维最初与多种人类疾病相关，但越来越多的研究表明其在多种重要的细胞过程中也发挥功能性作用。此外，患者组织中沉积的淀粉样物质包含 非蛋白质的 成分，如核酸和糖胺聚糖（GAGs）。这些辅因子可促进淀粉样蛋白的形成，从而产生不同类型的不溶性沉淀物。基于对蛋白质通过可溶性淀粉样前体中间阶段发生错误折叠机制的理解，我们设计了一种将天然蛋白质转化为淀粉样纤维的方法。 体外该方法可用于大量制备淀粉样蛋白，研究由特定蛋白生成的淀粉样蛋白的性质，并评估伴随其转化过程的结构变化。
引言
蛋白质是存在于所有类型细胞中最丰富的生物大分子。它们具有多种多样的大小、结构和翻译后修饰形式，在天然状态下执行着极其广泛的生物学功能。已有二十多种异常多肽被证实与多种人类病理状态相关，例如阿尔茨海默病、帕金森病、 以及2型糖尿病1-4。这些终末错误折叠的蛋白质会积累形成淀粉样纤维 ，即在细胞外或细胞内形成的不溶性稳定聚集体。
尽管特定蛋白质与某些疾病相关，但越来越多的证据表明，所有多肽都具有内在特性，能够发生淀粉样变。全基因组序列分析鉴定了“淀粉样组”（amylome），其中从大肠杆菌（E. coli）到人类的所有编码肽段中，约有15%属于易形成淀粉样的片段5。因此，近年来发现了越来越多的功能性淀粉样蛋白，它们参与多种重要的细胞过程。例如，细菌利用淀粉样蛋白组装形成生物膜和芽孢结构，这对它们的生存和致病性至关重要6-9。肽类激素在哺乳动物分泌颗粒中储存时会形成淀粉样沉积物，随后才被释放，这进一步表明蛋白质的淀粉样形态可发挥有益的生物学功能6,10,11。此外，蛋白质还可组装成淀粉样纤维以传递关键的细胞信号12,13。
多年来，最受关注的淀粉样蛋白是由与人类疾病相关的单个肽段制备而来，例如淀粉样β肽或朊病毒肽。这些肽段通常缺乏明确的结构，可在溶液中随时间推移自发形成淀粉样蛋白，该过程由一种部分错误折叠的中间体介导，该中间体是不溶性淀粉样蛋白的前体。淀粉样蛋白的前体也称为可溶性蛋白寡聚体，由天然肽段生成时含量稀少且不稳定14,15。然而，如前所述，原则上几乎任何蛋白质在适当条件下均可形成淀粉样构象。我们近期建立了一种方法，可制备稳定的天然蛋白可溶性寡聚体，该寡聚体在多种辅因子存在下易于形成淀粉样蛋白16。所形成的淀粉样纤维反映了终末蛋白错误折叠聚集体的复杂特性17,18。本文中，我们使用“纯蛋白淀粉样物”指代不含辅因子的蛋白纤维，而使用“杂合淀粉样物”指代含有非蛋白质成分的纤维。
此前，已开发出多种方法用于生成淀粉样蛋白 体外 通过施加已知有利于蛋白质错误折叠的条件，例如高温、疏水环境和pH值变化19-23然而，这些方法存在多种问题，例如效率低、折叠可逆、批次间差异大或动力学缓慢。本文所述方法具有良好的可重复性，易于放大，并可精确控制淀粉样蛋白转化的时间和条件。
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方案
1. 配制 MES 缓冲液
- 使用 MES 缓冲液（0.1 M 2-(N-吗啉代)乙磺酸和 0.9 M NaCl）制备仅含蛋白质的淀粉样蛋白以及稳定的可溶性蛋白寡聚体。称取 1.95 g MES 和 5.27 g NaCl，加入 H2O 并调节 pH 至 4.7，定容至 100 ml。4º C 保存，可使用长达 6 个月。
2. 从天然蛋白质直接制备仅含蛋白质的淀粉样蛋白
- 称取所需蛋白（任何天然蛋白或肽），并用 MES 缓冲液重悬至 10 mg/ml。
- 在 65 ºC 水浴中孵育 4 小时。孵育结束后，溶液中可见白色沉淀。
- 加入 10% (v/v) 的 Tris-HCl (1 M, pH 10.5) 中和样品。
- 将蛋白样品置于透析膜盒中，过夜透析，置换为后续分析所需的缓冲液。
- 可通过执行步骤 2.1、2.3 和 2.4（省略热沉淀步骤 2.2）制备天然蛋白的对照样品。
3. 从天然蛋白质的稳定可溶性寡聚体中制备杂交淀粉样蛋白
- 制备稳定的可溶性蛋白寡聚体
- 称取所需蛋白，并用 MES 缓冲液重悬至浓度为 10 mg/ml，在室温下放置 15 分钟。
- 称取盐酸-1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺（EDC），并用 MES 缓冲液新鲜配制 20 mg/ml 的母液。
- 按体积比 2:5 混合蛋白溶液与 EDC 溶液，即 每 10 mg EDC 对应 2 mg 蛋白。
- 在室温下孵育 2 小时。
- 加入终体积 10% 的 Tris-HCl（1 M，pH 10.5）中和样品。
- 将蛋白样品装入透析盒中，在目标缓冲液中透析过夜，以完成缓冲液置换，用于后续分析。
- 将制备好的稳定可溶性蛋白寡聚体于 4 ºC 保存，可稳定保存长达 4 周。
- 利用稳定的可溶性蛋白寡聚体制备杂交淀粉样纤维。
- 制备含 DNA 的淀粉样纤维：按质量比 1:1 混合 DNA 与稳定的可溶性蛋白寡聚体，于 4 ºC 放置至少 2 小时。在此期间，当初始蛋白浓度为 0.5 mg/ml 或更高时，溶液中可见不溶性沉淀物形成。
- 制备含 RNA 的淀粉样纤维：按质量比 1:1 混合 RNA 与稳定的可溶性蛋白寡聚体，于 4 ºC 放置至少 2 小时。在此期间，当初始蛋白浓度为 0.5 mg/ml 或更高时，溶液中可见不溶性沉淀物形成。
- 制备含肝素的淀粉样纤维：按质量比 1:1 混合肝素与稳定的可溶性蛋白寡聚体，于 4 ºC 放置至少 2 小时。在此期间，当初始蛋白浓度为 0.5 mg/ml 或更高时，溶液中可见不溶性沉淀物形成。
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结果
将天然蛋白质直接转化为淀粉样蛋白的能力依赖于在 MES 缓冲液中高温所引发的构象变化。溶液中出现沉淀是蛋白质聚集以及可能形成淀粉样蛋白的良好指示。另一方面，为了使可溶性蛋白质寡聚体得以稳定，使用 EDC 对蛋白质进行交联，以固化在 MES 缓冲液中诱导产生的寡聚构象。因此，经稳定的蛋白质寡聚体为多聚体蛋白质（图 1），在 SDS-PAGE 分离时，可明显区别于单体形式的天然蛋白质或热诱导形成的聚集体。
稳定的可溶性蛋白质寡聚体在溶液中具有良好的稳定性，因此可以灵活地单独进行辅因子诱导的淀粉样转化，以控制缓冲液条件、蛋白质与辅因子的相对比例或其他参数。寡聚体向淀粉样结构的转化过程发生迅速，因此在与核酸或糖胺聚糖（GAGs）混合后数分钟内即出现不溶性沉淀物，这一现象并不意外。为确保稳定化的可溶性蛋白质寡聚体的质量，可进行若干简单的检测。如先前研究所述16，这些稳定的可溶性蛋白质寡聚体能够以序列非依赖的方式高效结合核酸，包括DNA和RNA。因此，可通过凝胶迁移实验来直观展示稳定化的可溶性蛋白质寡聚体与DNA之间的直接相互作用，表现为...
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讨论
本文所述方法为制备淀粉样纤维提供了一种快速且灵活的手段 体外 几乎可以从任何选定的蛋白质或肽段制备出多种不同类型的淀粉样纤维，包括仅含蛋白质的纤维或含有 DNA、RNA 的杂合聚集体。 或糖胺聚糖。该方法所涉及的操作步骤简单直接，无需高级技术培训。通过此方法制备的淀粉样蛋白相当稳定，可在4 ºC安全保存，或在-80 ºC长期冷冻储存。
确保成功生成淀粉样蛋白及其前体的最关键因素之一是MES缓冲液的适当酸度。根据我们的经验，pH值在3-5.5范围内的MES缓冲液可实现淀粉样蛋白及其前体的成功且可重复的制备。在pH 6.5条件下，生成淀粉样前体的效率显著降低。这一结果与其他先前报道一致——在pH 5.5的醋酸盐缓冲液中加入三氟乙醇，可诱导牛磷脂酰肌醇-3'-激酶的SH3结构域以及大肠杆菌（Escherichia coli）HypF蛋白的氨基末端结构域形成可溶性寡聚体21。人β2-微球蛋白和转甲状腺素蛋白在体外酸性条件下能高效形成淀粉样纤维in vitro 2...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院资助项目 AI074809 以及德克萨斯大学M. D. 安德森癌症中心机构研究资助项目向 W.C. 提供资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-(N-吗啉代)乙磺酸 (MES) | Sigma-Aldrich | M8250 | |
| NaCl | Fisher | BP358-10 | |
| 1-乙基-3-[3-二甲氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐 (EDC) | Thermo/Pierce | 22980 | |
| 鲑鱼精子DNA | Sigma | D1626 | |
| 酵母RNA | Sigma | R6625 | |
| 猪肠黏膜肝素 | Sigma | H3149 | |
| Tris碱 | Fisher | BP152-1 | |
| 设备： | |||
| 水浴锅 | Fisher Science | Isotemp 210 | |
| Slide-A-Lyzer透析盒 | Thermo/Pierce | 66380 |
参考文献
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