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方法文章

NF-κB依赖性成体神经发生的调控与分析方法

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DOI：

10.3791/50870

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2014年2月13日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cell Biology, University of Bielefeld, 2Molecular Neurobiology, University of Bielefeld

本文内容

摘要

本文描述了调控和分析NF-κB依赖性成年海马神经发生的实验方法。提供了一种详细的实验方案，用于检测小鼠认知功能的齿状回依赖性行为学测试（称为“空间模式分离-巴恩斯迷宫”）。该技术也有助于在其他实验条件下开展相关研究。

摘要

海马体在情景记忆的形成与巩固以及空间定向中起着关键作用。传统上，成年海马体被认为是一种非常静态的哺乳动物脑部解剖区域。然而，最近的研究发现，海马体的齿状回在成年期具有极强的可塑性，不仅涉及现有神经回路的修饰，还包括成年神经发生。这种可塑性受复杂的转录调控网络控制，其中转录因子NF-κB发挥着重要作用。为了研究和操控成年神经发生，可采用一种用于前脑特异性神经元中抑制NF-κB活性的转基因小鼠模型。

本研究描述了分析NF-κB依赖性神经发生的多种方法，包括其结构特征、神经元凋亡和前体细胞增殖，以及认知意义，其中认知功能通过依赖齿状回（DG）的行为学实验——空间模式分离-巴恩斯迷宫（SPS-BM）进行特异性评估。SPS-BM方案可简便地适用于其他转基因动物模型，用于评估特定基因对成年海马神经发生的影响。此外，SPS-BM还可应用于其他旨在研究和调控依赖齿状回的学习功能的实验场景，例如使用药理学试剂进行干预。

引言

从发生学角度来看，海马是已知最古老的脑解剖结构之一。它负责多种复杂的任务，例如在长期记忆的调控、空间定向以及相关记忆的形成与巩固中发挥关键作用。从解剖学上看，海马由包含锥体细胞层（stratum pyramidale）的结构组成，包括阿蒙角（CA1、CA2、CA3 和 CA4）区域以及齿状回（gyrus dentatus），后者在其颗粒下层含有颗粒细胞和少量神经前体细胞。颗粒细胞通过所谓的苔藓纤维（颗粒细胞的轴突）向 CA3 区域投射。

直到上个世纪末，人们一直认为成年哺乳动物的大脑是一个静态器官，缺乏细胞可塑性和神经发生能力。然而，在过去二十年中，越来越多的证据明确表明，成年神经发生至少发生在两个脑区：侧脑室下区（SVZ）和海马齿状回的颗粒下区。

我们之前的研究以及其他研究团队的工作表明，转录因子 NF-κB 是成体神经发生的关键分子调控因子之一，其失调会导致严重的海马结构缺陷和认知功能障碍1-6。NF-κB 是一类可诱导的转录因子的通称，由五种 DNA 结合亚基——p50、p52、c-Rel、RelB 和 p65（RelA）——以不同的二聚体组合构成，其中后三种亚基含有转录激活结构域。在脑组织中，细胞质内最丰富的形式是 p50 与 p65 组成的异源二聚体，该二聚体通过 κB 抑制蛋白（IκB 蛋白）维持在非活性状态。

为了研究并直接操控由 NF-κB 驱动的神经发生过程，我们采用转基因小鼠模型，以实现特异性地抑制前脑中所有 NF-κB 亚基的活性7（见图 1）。为此，我们将以下两种转基因小鼠品系进行杂交：IκB/- 和 -/tTA。其中，转基因 IκB/- 品系是利用 NF-κB 抑制因子 IκBa 的显性负性突变体（超级抑制型 IκBa-AA1）构建而成8。与野生型 IκBα 不同，IκBα-AA1 的两个丝氨酸残基突变为丙氨酸（V32 和 V36），从而阻碍了该抑制因子的磷酸化及其随后的蛋白酶体降解。为了实现 IκBa-AA1 转基因在前脑神经元中的特异性表达，将 IκB/- 小鼠与携带钙调蛋白依赖性激酶 IIα（CAMKIIα）启动子且可由四环素转录激活因子（tTA）驱动的小鼠进行杂交9。

p65基因敲除小鼠由于出现严重的肝脏细胞凋亡而表现出胚胎致死表型10，因此本文所示方法为研究NF-κB在出生后及成年神经发生中的作用提供了一种巧妙的途径。

研究空间学习与记忆的经典行为学实验由 Richard Morris 在 20 世纪 80 年代提出，该实验被称为莫里斯水迷宫（Morris water-maze, MWM）11。在此开放场水迷宫中，动物通过定向能力以及迷宫外线索，学会从不透明的水中找到隐藏平台以逃离。MWM 的一种干式变体被称为巴恩斯迷宫（Barnes maze, BM）12。该实验使用一个圆形平板，其边缘设有 20 个等距排列的圆形孔洞，其中一个特定孔洞连接逃逸箱，动物可利用迷宫外的视觉线索进行定位。这两种实验范式均依赖于啮齿类动物对水环境或开阔、明亮照明空间的厌恶所引发的逃避行为。两种测试均可用于评估空间定向能力及相关记忆表现。尽管海马体在空间记忆形成中具有普遍且关键的作用，但不同测试所涉及的海马亚区有所不同。巴恩斯迷宫所检测的记忆依赖于内嗅皮层（enthorinal cortex, EC）与海马 CA1 区锥体神经元之间的神经活动，而齿状回（DG）并不参与其中13–16。特别是经典的巴恩斯迷宫主要依赖于从 EC III 经颞-穹窿通路至 CA1 再至 EC V 的单突触通路进行导航。重要的是，齿状回在所谓的空间模式识别17中起关键作用，该过程不仅涉及视觉与空间信息的处理，还包括将相似的表征或记忆转化为不相似且无重叠的表征。这一功能依赖于从 EC II 至 DG，再至 CA3，然后至 CA1 及 EC VI 的功能性三突触回路，而该回路的功能无法在巴恩斯迷宫中进行检测15。

为应对这些挑战，我们设计了SPS-BM作为一项行为学测试，用于特异性评估对照动物以及在NF-κB抑制后IκB/tTA超级抑制模型中齿状回依赖性认知功能的表现。重要的是，与MWM或BM相比，SPS-BM能够揭示因神经发生受损所导致的细微行为缺陷。由于空间模式分离严格依赖于内嗅皮层II层与齿状回、CA3、CA1及内嗅皮层VI层之间的功能性环路，该测试对神经发生的变化、苔藓纤维通路的修饰或齿状回内组织稳态的改变具有高度敏感性。

从技术上讲，我们的实验设置基于 Clelland 的研究 等人， 使用木质八臂放射状迷宫（RAM）检测空间分离模式19在我们改进的装置中，八个臂被替换为七个相同的黄色食物屋。总之，本文展示的方法，包括海马体内表达双皮质素（DCX+）细胞的分析、苔藓纤维投射、神经元细胞死亡，尤其是本文所呈现的SPS-BM，均可应用于研究其他携带影响成体神经发生的转基因小鼠模型。进一步的应用可能包括药理学药物的研究及其对齿状回和空间模式分离影响的评估。

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方案

伦理声明

本研究严格遵循德国北莱茵-威斯特法伦州政府动物护理与使用委员会（LANUV，德国杜塞尔多夫）的相关规定进行。所有动物实验均经杜塞尔多夫LANUV批准，许可证号为8.87–51.04.20.09.317（LANUV，北威州）。在研究中已尽一切努力将动物痛苦降至最低，并尽量减少所需动物数量。

1. 动物护理与饲养

  1. 所有用于本方案中的动物均应饲养在欧洲实验动物科学联合会（FELASA）所定义的特定病原体-free环境中。
  2. 小鼠应饲养在标准笼具中，环境温度和湿度需控制在22 °C，采用12小时光照/12小时黑暗的昼夜循环条件，并配备HEPA过滤空气。
  3. 应提供标准化的食物和水 随意.
  4. 若使用 IκB/tTA 和 IκB /- 对照小鼠，应按照所述方法对每只动物进行基于 PCR 的基因分型7,18.
  5. 年龄差异小于四天的雄性动物应被用于减少个体差异。
  6. （可选）：对于NF-κB再激活实验，需在饮水中给予多西环素（2 mg/ml，含 2.5% 蔗糖）至少 14 天。

2. 空间模式分离-巴恩斯迷宫（SPS-BM）

  1. 所有行为学测试均应依据国际和当地的指导原则进行。
  2. 重要提示！仅使用年龄在六个月或以上的雄性小鼠。同一系列实验中的动物年龄差异应小于四天。每一系列实验必须由同一操作者完成。在测试前，小鼠应接受标准饮食，以进一步提高由甜食奖励部分驱动的动机。
  3. 设置一个由硬质塑料制成的白色圆形板（直径 120 cm，参见 图5A在湿度和温度受控的房间（22 °C）中进行，使用至少4根80 W和3根215 W的氖荧光灯照明。重要提示！务必确保使用正确的光照条件，因为小鼠进入食屋的动机部分源于其对明亮、暴露环境的厌恶。
  4. 设置视频追踪系统。摄像头应置于培养板中心正上方115 cm处（参见 图 5A).
  5. 将多色的额外迷宫线索（EMC）固定在白色布料上，位置应便于动物观察，距离平台边缘约100 cm（参见 图5A).
  6. 使用快速消毒剂仔细清洁培养板，以去除实验装置中的任何气味。
  7. 放置七个相同的黄色食物屋（12 cm × 7 cm × 8 cm，见 图 5A）放在白色培养皿上。位置应明确标记（参见 图 5A).
  8. 将甜味食物颗粒奖励（四分之一个Kellogg's Froot Loop/食物屋）放置于所有食物屋的指定位置（参见 图 5A）且仅有一个定义的食物位置可自由供动物取用（位置 F，见 图 5A). 用透明薄膜封闭非目标食物屋。
  9. 测试前进行适应性训练（在开始任务的前一天）。使所有食物仓均可自由进入，让小鼠自由探索迷宫并获取食物颗粒奖励（每只动物10分钟）。
  10. 打开计算机和相机，启动视频追踪系统软件。
  11. 开始记录。
  12. 将动物置于圆形平板上指定的起始点（图 5A，S：起始位置），让小鼠寻找目标食物屋10分钟。
  13. 停止视频追踪。
  14. 重要提示！每次试验后，须使用快速消毒剂清洁圆形培养板和食物室。
  15. 对每只动物连续七天每天重复一次该测试。
  16. 使用适当的统计学软件分析结果（潜伏期、移动距离和错误次数）。将错误定义为接近错误的食物屋和/或接触正确的盒子但未进入并获取食物颗粒奖励。进行分组分析时，采用双因素方差分析（two-way ANOVA），并进行Bonferroni事后检验。
  17. （可选） 处死小鼠，并按如下所述分析海马组织。

3. BrdU 标记

  1. 连续3天每天一次腹腔注射50 mg/kg BrdU（用于分析分化与整合），或单次注射200 mg/kg（用于分析增殖）。
  2. 处死动物，分离海马组织，并按以下方法制备40 µm厚的切片。
  3. 用2 M HCl处理切片10分钟进行变性，随后在0.1 M硼酸缓冲液中孵育10分钟。
  4. 对每只动物的一组间隔为240 μm的40 μm切片（即每12片取1片）进行免疫组织化学染色，具体方法如下，使用抗BrdU抗体进行标记。
  5. 通过共聚焦显微镜分析颗粒细胞层及其下方的亚颗粒区全长范围内的标记细胞数量。将计数结果乘以12，得到每个海马体中BrdU标记细胞的估计总数，再除以2，获得每个齿状回（DG）中的标记细胞总数。

4. 非灌注动物脑组织的取出及冷冻切片制备

  1. 遵循当地批准的动物安乐死操作规程。可通过颈椎脱位法直接对小鼠实施安乐死。
  2. （可选）可根据当地和国际指南在实施安乐死前对动物进行麻醉。 例如 通过腹腔注射0.8 ml Avertin（新鲜配制：将150 ml储存液与1.85 ml生理盐水或生理缓冲液混合，储存液由2.2 mg 2,2,2-三溴乙醇溶于1 ml 异戊醇中制得）对33 g小鼠进行麻醉。
  3. 用浸有碘伏（10%聚维酮碘）的纱布对头部进行消毒，随后用70%乙醇浸湿的纱布擦拭。
  4. 使用合适的手术剪将动物断头，并将皮肤拉开。
  5. （可选）可使用固定器以防止滞后的皮肤向后折叠。
  6. 在颅骨中线处做一切口，并小心将颅骨碎片向两侧推开。
  7. 使用适当的外科器械小心地取出完整的大脑（例如 Moria Spoon)
  8. 将25 ml异戊烷加入50 ml烧杯中，预先冷却例如 肖特杜伦）降至 -30 置于干冰中，-40 °C保存。
    注意：对于游离漂浮染色的 "厚" 适用于共聚焦激光扫描显微镜的脑组织切片，取出脑组织，用缓冲液冲洗3次，然后置于50 ml离心管中，加入含30%蔗糖的磷酸盐缓冲液，4 °C保存，直至脑组织沉至管底（通常过夜）。
  9. 将脑组织小心置于Nescofilm（Parafilm）上，加入足量TissueTek OCT包埋剂覆盖，于2-甲基丁烷中在Nescofilm上速冻，随后在-80 °C保存备用。
    注意：若需在 -20 °C 长期保存，请置于含 9% 蔗糖、7 mM MgCl 的溶液中储存2，50 mM 磷酸盐缓冲液，44% 甘油。
  10. 在适当的冷冻切片机上将脑组织切成10–12 μm厚的切片。
    注意：对于较厚的游离切片，需在适当型号的冷冻切片机的冷冻台上冻结脑组织（例如使用Reichert Jung Frigomobil切片机在-20°C至-25°C下切取40 μm厚的水平切片。用细毛刷从刀片上收集切片，置于缓冲液中，或于-20°C保存在储存液（步骤4.9）中以长期保存。
  11. 将两个切片小心地贴附于单个显微镜载玻片上。强烈推荐使用Superfrost UltraPlus载玻片，以最大程度增强切片的黏附性。
  12. 室温干燥载玻片5分钟。载玻片可于-80 °C保存至使用。

5. 灌注动物组织切片的制备

  1. 按照上述方法（步骤 4.2）对动物进行麻醉。
  2. 通过左心室灌注并剪开右心房，使用含有肝素（0.025 g/100 ml PBS）和普鲁卡因（0.5 g/100 ml PBS）的磷酸盐缓冲液（PBS）进行经心脏灌注 2–4 分钟，随后用 PBS 配制的 4% 多聚甲醛灌注 10–15 分钟。灌注时可采用约 1.2–1.4 m 的静水压力，或使用设定流速约为 15 ml/min 的蠕动泵。理想的灌注效果应使脑组织呈淡白色，无可见的红色血管。
  3. 取出脑组织，并在 4 °C 条件下用 4% 多聚甲醛后固定 24 小时。
  4. 将脑组织置于含 30% 蔗糖的 PBS 溶液中，于 4 °C 下进行冷冻保护，时间不少于 24 小时。
  5. 将脑组织置于冷冻切片机载物台上进行冷冻。
  6. 使用合适的冷冻切片机对整个前脑制备 40 µm 厚的水平切片。
  7. 载玻片可存放于冷冻保护液（0.1 M 磷酸盐缓冲液，50% 甘油，0.14% MgCl2，8.6% 蔗糖）中，于 -20 °C 保存，直至使用。

6. 未灌注动物脑切片的免疫组织化学

  1. 使用 -20 °C 的冷甲醇对上述制备的冷冻切片进行后固定，处理 10 分钟。
  2. 用含有 0.3% Triton-X 的 5% 正常血清（来源于制备二抗的物种）在 4 °C 下封闭过夜。
  3. 用 1× PBS 漂洗 3 次，然后在 4 °C 下与一抗孵育过夜。
  4. 用 1× PBS 漂洗 3 次，随后在室温下与二抗孵育 1 小时。
  5. 用 1× PBS 漂洗 3 次
  6. 使用 SYTOX Green、DAPI（或其他替代性 DNA 染料）对切片进行 DNA 复染。
  7. 用 1× PBS 漂洗 3 次
  8. 将切片封埋于水溶性封片介质中。
  9. 让封片介质聚合至少 48 小时。

7. 灌注动物脑切片的免疫组织化学

  1. 按照步骤6.2所述进行封闭，随后将固定的脑切片在含有0.3% Triton-X的PBS中稀释的一抗溶液（游离漂浮法）中，4 °C孵育过夜。
  2. 用1× PBS冲洗三次，在含有0.3% Triton-X的PBS中稀释的二抗溶液（游离漂浮法）中室温孵育3小时。
  3. 用1× PBS冲洗3次
  4. 使用SYTOX Green 或DAPI（或其它DNA染料）对切片进行DNA复染。
  5. 用1× PBS冲洗三次
  6. 将切片封埋于水溶性封片介质中。
  7. 让封片介质聚合至少48小时。

8. 苔藓纤维投射的研究

  1. 处死动物，按上述方法制备40 µm冠状切片，并使用神经丝蛋白M（neurofilament M）抗体对海马切片进行染色。
  2. 使用共聚焦激光扫描显微镜在适当波长下扫描切片，以观察苔藓纤维和细胞核。从低倍镜开始扫描。
  3. 利用低倍镜图像进行定位，并靶向具有苔藓纤维投射的海马区域。
  4. 以高分辨率和高倍镜对切片进行连续光学切片（z-sectioning）扫描。
  5. 分析通过NF-M染色所显示的苔藓纤维的形态特征及其连接性。
  6. （可选）分析海马叶片的大小和体积，测量时使用DNA信号。

9. 氟代玉红C染色法（神经元细胞死亡检测）

  1. 处死动物，解剖海马组织，并按上述方法制备12 µm切片。
  2. 将切片在室温下干燥30分钟。
  3. 用4%多聚甲醛（PFA）在室温下固定切片40分钟。
  4. 用ddH2O短暂洗涤切片3次。
  5. 在持续轻柔振荡条件下，用0.06%高锰酸钾（KMnO4）溶液孵育切片10分钟。
  6. 用ddH2O洗涤切片3次。
  7. 在室温下，用0.002%Fluoro-Jade C溶液孵育切片20分钟。
  8. （可选）如需同时进行核染色，可在0.002%Fluoro-Jade C溶液中添加10 µg/ml DAPI。
  9. 用ddH2O短暂洗涤切片3次。
  10. 将切片在室温下干燥30分钟。
  11. 用二甲苯孵育切片（1分钟）。
  12. 使用基于二甲苯的封片介质（D.P.X.）封片。

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结果

IκB/- 转基因小鼠与 tTA 转基因小鼠杂交可实现海马区 NF-κB 活性的条件性抑制。

为了研究双转基因小鼠中IκBα-AA1转基因的表达（图1A），分离脑组织，进行冷冻切片，并使用抗GFP（绿色荧光蛋白）抗体染色。共聚焦激光扫描显微镜显示，该转基因在CA1区、CA3区以及DG区均有高水平表达（图1B）。

IκBα-AA1 转基因在 2b 型前体细胞中表达，并在中间未成熟阶段及成熟的颗粒细胞中具有活性。
为了确定海马神经发生区域中表达 CAMKIIα 驱动的 IκBα-AA1 的最早细胞类型，对 IκB/tTA 动物的海马冰冻切片进行了双皮质素（DCX）和转基因（GFP）染色。共聚焦分析显示，在年轻的 DCX 阳性颗粒细胞中存在 GFP 信号，表明 CAMKIIα 活性诱导了该转基因的表达（图 2，箭头所示）。

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讨论

成年神经发生，以及通过在神经元中抑制 NF-κB 来操控这一过程的可能性，并随后通过多西环素重新激活， 为研究成年大脑中的新生神经元以及神经元的退化与再生提供了一个引人入胜的系统。该系统的优点在于，神经元中 NF-κB 信号通路的抑制不仅导致神经元细胞死亡、前体细胞增殖与迁移的变化，以及严重的结构和解剖学改变，还会引发明显的学习功能缺陷。重要的是，IκB/tTA 动物模型的表型在给予多西环素后可通过实验手段实现逆转和挽救。这种表型逆转包括结构层面的恢复，也可显著改善依赖齿状回（DG）的学习能力2。

为了确保行为学实验结果具有可解释性，必须仅使用年龄差异小于四天的雄性动物。此外，所有测试系列应由同一操作者完成。关于测试房间，我们强烈建议在声学隔离的环境中进行实验，以避免外界噪音引起的应激反应和注意力分散。为防止动物依赖气味线索而非迷宫外线索进行定位，应确保封闭的食物屋对动物不可进入，同时允许正常的空气流通和气味扩散。此外，实验所用平台应由无气味且耐清洁剂的材料制成，并在每次实验之间彻底清洁。另一个可能引起实验变异的因素是室内照明。光源应足够明亮，以利于...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

感谢Angela Kralemann-Köhler提供的出色技术支持。本文所述实验工作在我们实验室完成，得到了德国研究基金会（DFG）向CK和BK 提供的资助项目以及德国联邦教育与研究部（BMBF）向BK提供的资助项目的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
梅里亚 MC17 带孔勺子 FST10370-18脑组织的取出
解剖显微镜卡尔·蔡司Stemi SV8脑组织的取出
手术剪刀 FST14084-08脑组织的取出
手术剪刀 FST14381-43脑组织的取出
杜蒙特 #5 镊子FST11254-20脑组织的取出
SuperFrost 载玻片卡尔·罗思1879免疫组织化学用载玻片
多聚甲醛西格玛-奥德里奇P6148固定剂
TissueTek OCT 包埋剂樱花精细科技1004200018脑组织包埋
正常山羊血清杰克逊免疫实验室005-000-001免疫组织化学封闭
正常兔血清杰克逊免疫实验室011-000-001免疫组织化学封闭
正常驴血清杰克逊免疫实验室017-000-001免疫组织化学封闭
抗-神经丝蛋白-M 抗体发育研究杂交瘤库2H3免疫组织化学，稀释比例 1:200
抗-双皮质素 抗体sc-8066圣克鲁兹免疫组织化学，稀释比例 1:800
抗-GFP 抗体Abcamab290免疫组织化学，稀释比例 1:2,000
抗-BrdU 抗体OBT0030GAccurate Chemicals免疫组织化学，稀释比例 1:2,000 
Fluoro-Jade CFJ-CHistoChem神经元细胞死亡检测
聚维酮碘曼迪普拉玛D08AG02消毒剂
冷冻切片机徕卡CM1900脑切片制备
肝素钠盐西格玛-奥德里奇H3393灌流
硬质塑料圆形板（直径 120 cm）实验室自制无SPS-BM 实验用板，直径 120 cm
Buraton 快速消毒剂 Schülke Mayr113 911消毒剂
视频追踪系统 TSE VideoMot 2 及配套软件包 VideoMot2TSE Systems302050-SW-KITSPS-BM 的追踪与分析
Triton X-100 西格玛-奥德里奇T8787通透处理/免疫组织化学
冷冻切片机Reichert Jung/徕卡Frigomobil 1206制备 40 µm 脑切片
Mowiol 4-88卡尔·罗思货号 0713载玻片封片
SYTOX Green英潍捷基S7020细胞核染色
食物颗粒（Kellog's Froot Loops）Kellog'sSPS-BM 实验
Prism 软件，版本 3.0Graph Pad Software, San Diego, USASPS-BM 数据的统计分析
Zen 2008 或 Zen 2011 软件卡尔·蔡司软件（共聚焦显微镜）
D.P.X西格玛-奥德里奇317616Fluoro-Jade C 染色封片介质

参考文献

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