方法文章

使用视频分析系统对小鼠进行情境与线索性恐惧条件反射测试

57K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/50871

⸱

2014年3月1日

 ,  ,  , 
1Division of Systems Medical Science, Institute for Comprehensive Medical Science, Fujita Health University, 2Japan Science and Technology Agency, Core Research for Evolutionary Science and Technology (CREST), 3Center for Genetic Analysis of Behavior, National Institute for Physiological Sciences, National Institutes of Natural Sciences

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用视频分析系统评估小鼠恐惧学习与记忆的场景性和提示性恐惧条件反射实验方案。

摘要

情境与线索性恐惧条件反射测试是一种行为学实验，用于评估小鼠学习和记忆环境线索与厌恶刺激之间关联的能力。在该测试中，将小鼠放入一个条件反射训练箱内，给予其条件刺激（听觉信号）与非条件刺激（足部电击）的配对。经过一段延迟时间后，将小鼠分别暴露于相同的训练箱以及另一个形状不同的箱体中，并再次呈现听觉信号。测试期间小鼠的僵直行为被用作恐惧记忆的指标。为了实现行为的自动分析，我们开发了一套基于ImageFZ应用软件的视频分析系统，该软件可从http://www.mouse-phenotype.org/免费下载。本文旨在详细展示我们的实验方案，以C57BL/6J小鼠为例，演示使用ImageFZ系统进行情境与线索性恐惧条件反射测试的具体操作流程。此外，我们通过将ImageFZ系统或基于光束检测的计算机测量系统所记录的僵直时间与人工观察者评分的结果进行比较，验证了本实验方案及视频分析系统的有效性。如代表性结果所示，ImageFZ系统获得的数据与人工观察者分析结果相似，表明使用ImageFZ系统进行行为分析具有高度可靠性。本视频文章提供了有关测试流程的详细信息，有助于加深对实验情境的理解。

引言

情境与线索性恐惧条件反射测试是一种用于评估啮齿类动物联想性恐惧学习与记忆的行为范式1-3。该测试已被广泛用于研究转基因和基因敲除小鼠中恐惧学习与记忆的神经生物学机制1,4-16。冻结行为是指除呼吸外完全不动的状态，是面对恐惧情境时常见的反应。在此行为范式中，动物在经历声音线索与足底电击配对后，会对引发恐惧的刺激产生冻结行为反应，该反应被用作评估联想性恐惧学习与记忆的指标。与其他学习和记忆任务相比，该测试所需的设备更简单，实验人员体力消耗更少，且小鼠训练时间显著缩短；通常每只小鼠每天仅需约5-10分钟，持续2天即可完成。尽管测试流程简便且耗时较短，但实验人员必须仔细观察并准确测量小鼠行为；因此，目前已开发出多种自动化测量系统以进行行为分析17-20。我们开发的基于ImageFZ软件程序的视频分析系统，可便捷地分析冻结行为，并获得高度可靠的结果。本文详细介绍了我们的测试流程，并说明了如何使用ImageFZ软件程序。

方案

所有实验均应根据当地动物护理与使用委员会制定的指导原则和操作规程进行。

1. 仪器设置

  1. 条件化和情境测试所用装置是一个带有可通电栅格地板、声源和校准过的电击发生器的方形实验箱。可使用不同尺寸的实验箱，其尺寸范围从54 cm × 27 cm × 30 cm21到25 cm × 35 cm × 30 cm22。在本方案中，装置由一个丙烯酸材质的方形实验箱（33 cm × 25 cm × 28 cm；前后壁透明，侧壁为白色）组成，箱底为金属栅格（直径0.2 cm ，间距0.5 cm），顶部覆盖透明丙烯酸盖板（图1A）。为分析黑色、阿古提（agouti）或稀释棕色小鼠的行为，必须将实验箱放置在白色丙烯酸底板上（图1B），因为使用ImageFZ软件程序（可免费下载，见材料/试剂表）的图像分析系统通过每一帧视频图像将深色动物与白色背景区分开来。白化小鼠则可使用黑色金属栅格和黑色丙烯酸底板进行测试（图1B）。发光二极管（LED）光源安装在装置上方的天花板上，通过LED灯将栅格地板照度调节至100 lux。一个连接至白噪声/音调发生器的扬声器（图1C）安装在盖板上方5 cm处的天花板上，用于提供听觉刺激（白噪声，55 dB）作为条件刺激（CS）。栅格通过导线连接至电击发生器（图1C），以传递足底电击作为非条件刺激（US）。测试箱置于一个隔音室（170 cm × 210 cm × 200 cm）内（图1D），以尽量减少测试期间的外界噪音干扰。该设置还可防止未接受测试的小鼠听到测试小鼠的听觉刺激或发声。
  2. 线索测试所用装置由一个与条件化实验箱具有不同特性的实验箱组成，以提供新的环境背景。必须尽可能改变感官线索，使小鼠感知到的新环境与条件化实验箱无关。通常使用不同形状的盒子或三角形实验箱。此外，还可向小鼠提供不同的光照和/或嗅觉线索。在本方案中，装置为一个丙烯酸材质的三角形实验箱（33 cm × 29 cm × 32 cm；各侧壁均为白色），底部为平坦的白色底板（适用于黑色、阿古提或稀释棕色小鼠）或平坦的黑色底板（适用于白化小鼠），顶部覆盖透明丙烯酸盖板（图1E）。LED光源安装在装置上方的天花板上，地面照度设定为30 lux。扬声器安装在盖板上方5 cm处的天花板上，用于提供与条件化阶段相同的听觉刺激。三角形实验箱位于与条件化和情境测试所用房间不同的另一个隔音室内。
  3. 每个实验箱均配备一个安装在天花板上的电荷耦合器件（CCD）摄像机，通过四路视频分路器和USB图像采集设备连接至Windows计算机，用于监测小鼠行为。实验箱及小鼠的图像由应用软件ImageFZ捕获并进行分析（见方案6）。白噪声和足底电击发生器由ImageFZ软件程序自动控制；白噪声和电击的开始时间及持续时间必须写入一个文本文件（参见视频中展示的示例文件“simple-cond”，了解参数在文件中的具体写法），该文件随后被程序读取。
  4. 每次测试开始前，需用浸有超低浓度次氯酸水（pH 6–7）的毛巾擦拭丙烯酸壁和底板，栅格则用70%乙醇清洁，以避免因残留气味线索造成偏差。栅格使用乙醇而非次氯酸水擦拭，以确保栅格不会因生锈而降低导电性能。

2. 动物准备

  1. 通常每笼饲养2至4只小鼠，饲养环境为温度可控的动物房（23±2 °C），光照周期为12小时 hr 光照/黑暗循环（例如 7:00 开灯。
  2. 在本实验方案中，为减少笼具运输对小鼠行为的可能影响，并使小鼠适应实验环境，需在每次测试开始前至少30分钟，将装有小鼠的笼具从动物饲养室转移至紧邻隔音测试室的隔音待测室。
  3. 所有实验（图2A每天应在光照期或黑暗期的相同时段进行，以尽量减少因在不同时间测试而产生的行为差异23,24在本实验方案中，所有实验均在光周期开始后1小时至暗周期开始前1小时之间进行（即光周期的上午8:00至下午6:00）。若仅有一套实验装置，应以交叉平衡顺序对每种基因型的小鼠进行测试，以减少实验时间及测试顺序对动物行为表现的潜在影响。ImageFZ最多可同时控制4套装置。通过4套装置以交叉平衡顺序同时测试4只小鼠，可节省实验时间，并降低实验参数对小鼠行为的可能影响。

3. 条件化处理

  1. 将小鼠放入条件化实验箱中，通常允许小鼠自由探索箱体环境120秒。随后，呈现听觉刺激（如白噪声、音调或听觉点击声）作为条件刺激（CS），持续30秒，并在声音的最后2秒给予小鼠0.1–0.8 mA的足底电击作为非条件刺激（US）。重复呈现CS-US配对以增强两者之间的关联。在最后一次刺激呈现后，将小鼠继续留在箱内一段时间，以进一步建立箱体环境与厌恶体验之间的联系。在本实验方案中，小鼠在自由探索120秒后，呈现听觉刺激（白噪声，55 dB）30秒，并在白噪声的最后2秒持续给予0.3 mA的足底电击。90秒后，再次向实验对象呈现听觉刺激与足底电击的配对。每轮实验中，CS-US配对共重复三次（分别在条件化开始后的120秒、240秒和360秒）（图2B）。最后一次电击结束后，将小鼠在箱内静置90秒，不进行干扰。
  2. 在条件化实验开始前，运行ImageFZ应用程序，选择插件菜单中的“FZ Conditioning and FZ Online (4 chamber)”，并按以下步骤逐步设置参数值。
    1. 步骤1：项目编号（Project ID）。指定一个用于存储数据文件的文件夹。
    2. 步骤2：实验会话名称（Session Name）。在“Session”框中输入任意文字，例如 实验日期；在“Reference”框中选择一个参考文本文件，该文件中包含白噪声和足底电击的开始时间及持续时间。示例文本文件在视频中展示。
    3. 步骤3：参数设置（Parameter Settings）。在各输入框中填入以下参数值。
      1. 采集速率（Rate，帧/秒）：图像采集的帧率，例如 1帧/秒。
      2. 持续时间（Duration，秒）：在条件化实验中，总持续时间为480秒。
      3. 分段时间（Bin duration，秒）：例如 60秒；数据将以每60秒为一个时间段进行分析。
      4. 目标大小-最小值（Subject size - min，像素）：ImageFZ在每帧图像中将小鼠和噪声识别为白色背景上的黑色颗粒（若干像素组成的区域）。当黑色颗粒的面积（像素）小于“目标大小-最小值”设定值（例如 100像素）时，该颗粒被视为噪声并从图像分析中排除。
      5. 目标大小-最大值（Subject size - max，像素）：当黑色颗粒的面积超过“目标大小-最大值”设定值时，该颗粒将被排除在分析之外。
      6. 视野尺寸-宽度/高度（Frame size - width/height，厘米）：实验箱的尺寸，即 宽33厘米，高25厘米。
      7. 僵直判定阈值（Freezing criterion，像素）：例如 30像素，详见 方案6。
      8. 僵直持续时间-最小值（Freezing duration - min，秒）：例如 2秒；若未检测到小鼠运动的时间少于2秒，则该行为不计为“僵直”。
      9. 电击速率（Shock rate，帧/秒）：详见 方案6。
    4. 步骤4：实验对象编号（Subject ID）。输入实验对象的识别编号。
    5. 步骤5：相机设置（Camera Settings）。调节所采集图像的亮度和对比度。
    6. 步骤6：阈值设置（Threshold Settings）。调整阈值，以在每帧图像的白色背景中将黑色小鼠正确识别为黑色像素，并准确判断小鼠行为为“僵直”或“非僵直”（详见方案6）。若分析白化小鼠，请勾选“invert mode”复选框，并适当调整阈值。
    7. 步骤7：设定笼区（Set Cage Field）。指定每个实验箱的成像区域。在工具栏中点击矩形按钮后，在实时图像窗口中围绕实验箱底部绘制一个矩形。接着，选择对应的箱号并点击“Set”按钮。最后，点击“Complete”按钮完成设置。
  3. 完成参数设置后，应在当天首次正式实验前，使用练习用小鼠（非正式实验对象）进行一次预备测试，以确认图像分析系统以及白噪声/电击发生器是否正常工作。
  4. 将装有练习用小鼠的饲养笼从相邻的等候室移至隔音测试室，并将每只小鼠放入条件化实验箱中。小鼠放入箱内后，立即点击ImageFZ的开始按钮。应用程序将按照参考文件中设定的顺序，向小鼠呈现听觉刺激和/或足底电击。
  5. 480秒结束后，将小鼠放回其饲养笼，并将笼子放回饲养室的架子上。
  6. 仔细清洁实验箱。然后点击“Next Analysis”按钮，并对正式实验小鼠重复步骤3.2.4–3.6。
  7. ImageFZ以TIFF格式存储实时图像和轨迹图像。该程序支持离线分析，允许使用修改后的参数值重新分析图像。若进行离线分析，请选择插件菜单中的“Fear Conditioning and FZ Offline”，并选择需要重新分析的数据文件夹。随后再次输入参数值，并点击“Complete”按钮。

4. 情境测试

  1. 条件刺激结束后，将小鼠放回相同的条件刺激箱中，记录其僵直行为以评估情境性条件恐惧（情境测试）。通常将条件刺激与情境测试之间的间隔时间设定为24小时。在本实验方案中，为评估近期记忆和远期记忆（分别通过条件刺激后1天和28天以上的测试进行测量）25，小鼠将在条件刺激后约24小时 和30天接受情境测试。将小鼠放入条件刺激箱中，在不呈现条件刺激（CS）和非条件刺激（US）的情况下，允许其自由探索箱体环境300秒（图2C）。
  2. 运行ImageFZ软件程序，并以与条件刺激阶段相同的方式设置应用程序的参数值（参见第 3.2.3节）；但需将本次测试的持续时间修改为300秒，并选择用于情境测试的参考文本文件。完成设置更改后，应使用练习用小鼠进行一次预测试，以检查ImageFZ系统的运行情况。
  3. 将每只小鼠放入条件刺激箱中，点击开始按钮。300秒结束后，将小鼠放回其原饲养笼中，并保持笼子不受干扰，直至线索测试开始。
  4. 清洁测试箱。然后点击“Next Analysis”按钮，并在测试小鼠中重复步骤4.3–4.4。

5. 提示测试

  1. 线索测试在情境测试的同一天或第二天进行。在该测试中，将小鼠放入另一个具有显著不同特性的测试箱中，提供一个与训练箱无关的新环境，持续3分钟。在最初的3分钟结束后，在新环境中向小鼠呈现训练时使用的听觉线索，持续3分钟。在本方案中，线索测试在情境测试数小时后进行。允许小鼠在三角形测试箱中自由探索360秒。在前3分钟内，不呈现条件刺激（CS）或非条件刺激（US），随后在最后3分钟内呈现CS（55 dB的白噪声）。
  2. 运行ImageFZ软件程序，并以与训练阶段相同的方式设置参数值，但需将测试持续时间修改为360秒，并为线索测试选择相应的参考文本文件。完成设置后，应使用练习用小鼠进行一次预备测试，以检查ImageFZ系统的运行情况。
  3. 将每只小鼠放入三角形测试箱中，点击开始按钮。360秒结束后，将小鼠放回其原饲养笼，并将笼子放回饲养室的架子上。
  4. 清洁测试箱。然后点击“Next Analysis”按钮，并在测试小鼠中重复步骤5.3–5.4。
  5. 为进一步检测远期记忆，可在训练阶段约30天后重复进行方案 4–5 （图2A）。

6. 图像分析

  1. 使用 ImageFZ 自动执行数据采集与分析。该应用软件基于美国国立卫生研究院（National Institutes of Health）开发的公共领域软件 ImageJ（由 Wayne Rasband 开发，可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/ 获取），并由 Tsuyoshi Miyakawa 修改而成（ImageFZ 应用软件，可免费下载，详见材料/试剂表）。
  2. 在所有实验中，以给定的帧率采集图像（例如 1 fps）下使用USB视频采集设备（包括视频摄像机）通过ImageFZ进行记录。为测量连续图像中移动的距离，需调整程序中的“threshold min”值（例如 80像素），用于将图像分割为黑色颗粒（小鼠）和白色背景。移动距离通过每组x-y坐标之间的距离计算得出 连续图像中粒子重心的坐标。
  3. 为了从连续图像中测量冻结行为，调整程序的“threshold min (xor)”值例如 160像素），该参数用于将图像分割为黑色颗粒（小鼠）和背景，然后计算每对连续图像中颗粒之间非重叠区域的面积（像素）。通过调整阈值工具的滑块，使每幅图像中的黑色颗粒与小鼠整个身体（不包括尾巴）的形状相匹配。如果非重叠区域的面积低于“冻结判定标准”值（例如 30像素），则该行为被视为“僵直”（freezing）图3），通常定义为除呼吸和心跳外完全无任何运动。当活动区域超过该阈值时，该行为被视为“非僵直状态”（图3）。应根据“僵直”的定义来判断。小鼠有时会表现出轻微运动和短暂的静止，这可能并不构成反映恐惧的僵直行为。这种持续时间较短的静止（例如 少于2秒）可能与恐惧表现不同，可通过设定僵直时间阈值从分析中排除。要设置时间阈值，请输入“僵直持续时间—最小值（秒）”数值（例如 2 秒。
  4. ImageFZ 程序可自动计算移动距离（cm）和僵直百分比。结果保存在文本文件中，实时图像和轨迹图像以 TIFF 格式存储。为测量移动距离（cm）作为电足底电击敏感性的指标，ImageFZ 程序还以高帧率采集图像例如 4 fps）持续6秒，从给药前2秒开始测量 在在线分析期间，从足部电击开始前2秒持续到足部电击结束后2秒。为设置足部电击前、期间和之后的图像采集帧率，请在“Shock rate (frame/sec)”框中输入数值。在线分析完成后，选择插件菜单“FZ Shock Offline”进行离线分析，以获取移动距离的数据。
  5. ImageFZ 程序的参数值应进行优化，以使结果与预备测试中人工观察者获得的结果相似。对于手动评分，分析过程中使用秒表和事件记录程序，或每 3–10 秒进行一次瞬时时间取样法，持续测量冻结行为。通常由两名观察者进行行为观察。为调整 ImageFZ 程序的参数值，确保图像分析结果与人工观察结果一致，需对 ImageFZ 程序执行离线分析，并修改“阈值最小值 (xor)”和“冻结判定标准”参数。进行离线分析时，选择插件菜单中的“FZ Offline”选项，并输入任意参数值。

7. 故障排除

  1. 如何获取并安装 ImageFZ 程序？
    ImageFZ 程序可从我们的网站免费下载（参见材料/试剂表），适用于 Windows 计算机。请下载 ImageFZ 的压缩文件夹，并在计算机上安装该软件。安装详情请参阅“readme.txt”文件，并按照其中的分步说明进行操作。
  2. 为何会显示“设置捕获设备时出错”的错误信息？
    检查摄像头电缆的连接情况以及USB图像采集设备的驱动程序安装。如果设置没有问题，则ImageFZ软件可能与您的图像采集设备不兼容。有关与ImageFZ软件兼容的设备信息，请参阅“readme.txt”文件。
  3. ImageFZ 无法将小鼠的整个身体识别为一个粒子。
    将“threshold min”和/或“threshold min (xor)”的值设置为低于当前值。如果 ImageFZ 无法在特定位置检测到小鼠， 例如 测试室角落可能存在测试条件不足的情况，例如地面光照均匀，或小鼠与背景之间的对比度差异较小。为解决此问题，可调整参数值（例如 调整ImageFZ中实时图像的亮度和对比度及阈值，控制光源的数量和位置，或对黑色小鼠使用白色背景。
  4. 高帧率图像采集会减缓在线分析期间计算机的运行速度。
    将帧率设置为低于当前速率的值，并进行在线分析。ImageFZ 分析以每秒1帧的速率采集图像，足以准确测量僵直行为，代表性结果部分已展示其有效性。
  5. ImageFZ 分析结果与人工评分结果不一致。
    检查存储的图像和判断结果文件。如果 ImageFZ 高估了僵直时间，则将“僵直判定阈值”设置为低于当前值的数值，并重新进行离线分析。如果 ImageFZ 低估了僵直时间，则将“僵直判定阈值”设置为高于当前值的数值。
  6. 在光遗传学和 体内 电生理实验中，连接在小鼠头部的光纤电缆会干扰对僵直行为的判断。
    用白色包裹线缆以用于黑色小鼠，并调整相机的位置和角度，直至线缆无法被检测到。
  7. 离线分析需要哪些条件？
    在 ImageFZ 程序的根目录下创建一个名为‘Image_FZ’的文件夹。在该文件夹中，创建两个子文件夹：‘Images’和‘Sessions’。将一幅8位灰度图像移至‘Images’文件夹，并在‘Sessions’文件夹中创建一个文本文件，其中写入该图像文件的文件名。随后，运行 ImageFZ 离线分析，并按照程序的指示进行操作。

结果

在恐惧条件反射测试中，人类实验人员通常通过耗时费力的直接观察来量化冻结行为26-29，但近年来基于光束的计算机测量（例如 “Freeze Monitor”系统和图像分析系统已被用于自动测量僵直行为26,30-32. ImageFZ 是一种自动图像分析系统，其分析结果与人工观察所得结果具有可比性，如下所述。本研究在不同参数条件下比较了人工观察与 ImageFZ 分析的结果，参数包括“速率（帧/秒）”和“僵直判定标准（像素）”。实验中使用了5只雄性 C57BL/6J 小鼠（平均体重 ± 标准差（g）：31.4±3.55；平均体长 ± 标准差（像素）：351.6±62.2），年龄为15至27周。人工观察采用事件记录程序（Macintosh OS9 软件程序）进行；当小鼠出现静止不动的行为且按键事件持续2秒或以上时，记为“僵直”。每次测试中每60秒计算一次僵直百分比，并用于相关性分析。两名观察者所记录的僵直百分比（观察者间信度：条件化阶段 r=0.879；环境测试阶段 r=0.957；线索测试阶段 r=0.866；所有情况总体 r=0.888）取平均值，作为人工评分结果。ImageFZ 所测得的僵直百分比与不同帧率下的结果之间的相关性（即 1、2 和 4 fps）以及通过人工观察获得的结果进行了比较分析。如图所示 图4通过ImageFZ（1、2和4 fps）计算得到的僵直百分比与两名观察者测量结果的平均值高度相关。值得注意的是，以较高的帧率采集图像并不总能产生最佳的相关性。在各项测试中，以1 fps进行图像分析所得结果与人工观察结果相似。在不同“僵直判定标准（像素）”条件下，通过人工观察与使用ImageFZ测得的僵直百分比之间的相关性（即 20、30 和 40 像素）进行了考察。在“冻结判定标准（像素）”分别设置为 20、30 和 40 像素时，使用 ImageFZ 计算得到的冻结百分比在所有情况下均与人工观察结果高度相关。图5）。如图所示 图 5D，当设定较低的僵直判定阈值时，人工观察者认为小鼠的轻微运动属于“僵直”，而ImageFZ会将其判定为“非僵直”；反之，若将阈值设为较高，则人工观察者判定为“非僵直”的小鼠运动，ImageFZ会将其识别为“僵直”（图5C、5F，以及 5I因此，为了获得最可靠的结果，应使用通过人工观察在每种测试环境中获取的数据，对 ImageFZ 程序的每个参数进行校准。

此外，我们将人类观察者使用基于光束的计算机测量系统（Freeze Monitor 系统）获得的结果与使用 ImageFZ 获得的结果进行了比较（见图6）。人类观察者对处理分组及 ImageFZ 评分结果设盲。对于 Freeze Monitor 系统的参数设置，我们采用了先前已验证系统中的三种冻结百分比测量方法30。简言之，记录动物在每个 10 秒时间段内穿越该时间段第一个新光束所需时间超过 1 秒或 2 秒的时间段数量（分别记为 1sec 10sec 和 2sec 10sec），并测量每个 5 秒时间段开始至该时间段内第三次新光束中断之间的潜伏期（Latency3）。计算小鼠处于冻结状态的时间段所占百分比，或计算触发第三次光束中断所需的总时间所占百分比。

各系统中测得的僵直百分比见图6。采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）对各组进行比较，随后进行t检验（见表1）。使用ImageFZ测得的僵直百分比（图6B）比基于光束系统获得的数据（图6C-E）更接近人工观察评分的结果（图6A）。在每次测试中，ImageFZ程序测得的僵直百分比与人工观察评分结果高度相关（条件化阶段，r=0.947；环境测试，r=0.970；提示测试，r=0.934），而基于光束的计算机测量系统（1sec 10sec、2sec 10sec 或 Latency3）测得的僵直百分比与人工观察之间的相关性较低（条件化阶段，r=0.503、0.593 和 0.761；环境测试，r=0.772、0.819 和 0.912），低于ImageFZ与人工观察之间的相关性（图7A和图7B）。此外，图7显示，每只小鼠中人工观察与ImageFZ测得的僵直百分比之间的差异最小。这些结果表明，使用ImageFZ测得的僵直百分比与人工观察结果相似，ImageFZ在测量僵直程度方面具有高度准确性。

显示实验箱、网格、电击发生器和隔音室的动物行为实验装置。
图1. 情境与线索恐惧条件反射测试所用装置。 （A）用于条件化和情境测试的亚克力方形实验箱；（B）白色塑料底板上的金属网格，适用于黑色、绒鼠色或稀释棕色小鼠（上图），以及黑色塑料底板上的可通电黑色金属网格，适用于白色小鼠（下图）；右侧面板展示了网格的放大图像；（C）白噪声/音调发生器和电击发生器；（D）隔音室；以及（E）用于线索测试的带平坦底面的亚克力三角形实验箱。 点击此处查看高清图像。

情境与条件性恐惧制约测试示意图；条件刺激/非条件刺激呈现、实验设置、时间线。
图2. 实验方案示意图。 （A）情境与条件性恐惧制约测试总体流程，（B）制约阶段，（C）情境测试阶段，以及（D）条件性提示测试阶段。 点击此处查看高清大图。

使用二值化阈值和异或运算进行运动分析以检测僵直行为；实验示意图。
图3. 使用ImageFZ软件进行图像分析。 对于每一对连续图像，ImageFZ会计算小鼠移动所覆盖的区域面积（像素）。当该面积低于某一特定阈值（例如，30像素）时，该行为被判定为“僵直”；当面积等于或超过该阈值时，则被视为“非僵直”行为。 点击此处查看高清图像。

静态平衡；散点图；人工观察与ImageFZ分析结果的比较；相关性分析结果
图4. 使用ImageFZ在不同帧率下分析图像所得的僵直百分比与人工观察测量结果的比较。 恐惧条件反射实验使用雄性C57BL/6J小鼠（n=5）进行。实验过程中，由两名观察者对动物的僵直行为进行评分。同时，使用ImageFZ程序以4 fps的帧率实时采集图像。将4 fps采集的视频文件提取帧后进行降频处理，以模拟1 fps或2 fps采集的图像。将“速率（帧/秒）”参数分别设为1、2或4 fps，利用ImageFZ进行离线分析，计算每个60秒时间区间的僵直百分比。每个数据点代表一个60秒区间的僵直百分比。计算人工观察结果与ImageFZ分析结果之间的Pearson相关系数。点击此处查看高清图像。

ImageFZ 与人工观察在条件刺激、环境及提示测试下的相关性散点图
图5. 使用ImageFZ在不同冻结判定阈值下由图像计算得到的冻结百分比与人工观察测量结果的比较。 恐惧条件反射测试使用雄性C57BL/6J小鼠（n=5）进行。测试过程中，两名观察者记录小鼠的冻结行为，同时使用ImageFZ程序采集实时图像。通过ImageFZ离线分析，以每秒1帧的速率对图像进行处理，并将“冻结判定标准（像素）”参数分别设为20、30或40像素，计算每个60秒时间窗内的冻结百分比。每个数据点代表一个60秒时间窗的冻结百分比。在每次测试中，分别计算人工观察结果与ImageFZ分析结果之间的Pearson相关系数。点击此处查看高清大图。

比较条件化与非条件化受试者随时间变化的僵直行为的图表。
图6. 使用自动化系统和人工观察方法测量雄性C57BL/6J小鼠在非条件化组和条件化组中的僵直百分比（每组n=5）。(A) 人工观察，(B) ImageFZ，(C) Freeze Monitor系统1（1秒/10秒），(D) Freeze Monitor系统2（2秒/10秒)，以及(E) Freeze Monitor系统3（Latency3)。组间比较采用双因素重复测量方差分析，随后进行t检验（非条件化组 vs. 条件化组，*，P<0.05；†，p<0.01）。ImageFZ获得的数据与人工观察评分结果相似。点击此处查看高清图像。

ImageFZ、Freeze Monitor 和人工观察在僵直分析中的相关性与直方图比较。
图 7. 使用自动化系统与人工观察测得的僵直百分比之间的差异相关性及频率分布。（A-B）显示了通过自动化系统与人工观察所评分的僵直百分比之间的散点图及皮尔逊相关系数。使用 ImageFZ 计算得到的僵直百分比与人工观察结果高度相关。（C-F）当使用 ImageFZ 分析的数据与人工观察分析的数据进行比较时，自动化系统与人工观察所得僵直百分比差异小于 10% 的情况出现频率最高。点击此处查看高清大图。

方差分析（ANOVAs）
条件时间条件 × 时间
第1天（条件化）
人工观察（Human）F(1,8)=28.53, p=0.0007F(7,56)=20.79, p<0.0001F(7,56)=16.58, p<0.0001
ImageFZF(1,8)=13.97, p=0.0057F(7,56)=21.40, p<0.0001F(7,56)=11.69, p<0.0001
Freeze Monitor (1秒10秒)F(1,8)=5.16, p=0.0528F(7,56)=2.39, p=0.0329F(7,56)=0.72, p=0.6572
Freeze Monitor (2秒10秒)F(1,8)=4.07, p=0.0782F(7,56)=3.44, p=0.0039F(7,56)=1.52, p=0.1803
Freeze Monitor (潜伏期3)F(1,8)=4.44, p=0.0682F(7,56)=9.94, p<0.0001F(7,56)=4.33, p=0.0007
第2天（环境）
人工观察（Human）F(1,8)=42.94, p=0.0002F(4,32)=1.91, p=0.1336F(4,32)=1.48, p=0.2302
ImageFZF(1,8)=49.61, p=0.0001F(4,32)=2.06, p=0.1087F(4,32)=0.83, p=0.5174
Freeze Monitor (1秒10秒)F(1,8)=20.28, p=0.002F(4,32)=1.63, p=0.1918F(4,32)=0.55, p=0.6997
Freeze Monitor (2秒10秒)F(1,8)=40.20, p=0.0002F(4,32)=2.66, p=0.0504F(4,32)=1.20, p=0.3306
Freeze Monitor (潜伏期3)F(1,8)=35.30, p=0.0003F(4,32)=2.49, p=0.0626F(4,32)=1.09, p=0.3793

表1. 统计学比较。

讨论

情境与线索性恐惧条件反射测试是评估学习与记忆最常用的范式之一。该测试属于经典条件反射的一种，通过将特定环境和/或条件刺激（听觉线索）与厌恶刺激（足底电击）建立关联。即使仅经历一次环境/听觉线索与足底电击的配对，小鼠在再次暴露于该环境或线索时仍会表现出持久的僵直反应。在此测试中，僵直行为被用作恐惧记忆的指标。药理学与损毁研究已表明，记忆的形成、巩固与提取受到多个脑区的调控，例如杏仁核、海马以及前额叶皮层3,33-35。此外，分子遗传学研究利用基因工程小鼠，揭示了这些脑区中特定基因与分子在学习与记忆过程中的作用36。因此，该测试简便且有效，适用于探索恐惧学习与记忆背后的神经生物学机制。在本视频文章中，我们介绍了实验方案，旨在为研究者提供详尽的信息，以帮助理解并顺利开展该测试。

通过实验人员直接观察来量化冻结行为。训练有素的实验人员应在多次观察中产生可靠且稳定的结果。然而，该方法可能存在一些问题，例如观察方法的差异、观察者偏差以及简单的量化错误，这使得不同实验人员和不同实验室之间的结果难以直接比较。基于光电束的自动化计算机测量系统也已被使用26,30-32。然而，该系统在测量冻结行为时也存在潜在问题。由于传感器的布局，该系统可能无法检测到通常在人工观察中被判定为“活动”的微小头部运动。此外，冻结期间的颤抖可能被误判为非冻结状态，因为当动物冻结时，由于颤抖会导致光电束出现间歇性中断。作为替代方法，已开发出基于图像和视频分析的自动化系统17-20,37,38。Anagnostaras 等37 描述了几种采用图像分析软件的系统，这些系统具有良好的有效性，并能准确评分冻结行为17,20,37-38。然而，这些系统和分析程序大多需从商业供应商处获取，通常价格昂贵。我们开发了用于分析冻结行为的ImageFZ软件程序，该程序作为免费软件分发。ImageFZ将小鼠识别为像素集合（即粒子），并通过连续图像对中粒子间非重叠区域的面积变化来区分细微的小鼠运动属于“冻结”或“非冻结”。如代表性结果所示，使用ImageFZ程序进行的测量结果与其他方法相比具有一致性，甚至更为准确。因此，ImageFZ程序能够依据明确定义的标准，自动测量人类观察者所判定的冻结行为。此外，ImageFZ程序还能计算在足底电击暴露前、期间和之后小鼠移动的距离（cm），有助于评估电击敏感性并对冻结行为进行分析。

不同实验室之间存在方法学上的差异。这些差异可能导致实验室间数据难以比较，以及在不同实验室中重复实验结果困难。为了获得更稳定且可比的数据，有必要尽可能地对检测方案进行标准化。采用ImageFZ分析系统可实现检测流程的自动化，从而有助于实现实验室间所用方案的标准化。

在分析僵直行为时，必须考虑多种行为反应。首先，当动物面临恐惧情境时，可能会选择逃跑而非僵直39逃跑是恐惧反应的一种，其发生会导致对恐惧记忆的低估。其次，僵直行为可能依赖于整体活动水平，因此需要检测实验组与对照组小鼠的活动水平。例如，尽管缺乏M1毒蕈碱型乙酰胆碱受体的小鼠相较于野生型小鼠表现出较低程度的僵直，但多项行为学测试表明，该结果可能源于其过度活跃的表型，而非记忆功能受损。18ImageFZ 可计算受试对象移动的距离（cm）。该数据可用于分析不同受试对象之间的一般活动水平是否存在差异。若在移动距离上存在组间差异，一种可能的处理方法是将训练最初 2 分钟内的移动距离视为基线活动水平，并采用抑制比率（抑制比率 =（测试期间的活动量）/（基线期间的活动量 + 测试期间的活动量））作为恐惧的次要指标。17,40最后，疼痛敏感性的差异（如有）可能会引起对电足底刺激反应性的变化，从而导致僵直行为的差异。ImageFZ 还可详细计算在刺激呈现前 2 秒内的移动距离（cm） 持续6秒，从足部电击开始前2秒到电击结束后2秒（共6秒），可作为足部电击敏感性的指标。

已开发出视频分析系统，用于测量白化、黑色、刺鼠色以及浅棕色小鼠的僵直行为。ImageFZ 使用黑色地板托盘和黑色栅格来检测白色小鼠（见图1B）。这些黑色栅格由特殊处理的金属制成，表面涂有黑色涂料，其电导率与通常用于黑色小鼠的未涂层金属栅格相似。ImageFZ 还可通过调整程序参数，分析大鼠及其他啮齿类动物的僵直行为。在 ImageFZ 的当前版本中，通过从顶部墙壁架设的摄像机记录受试动物的行为，以进行僵直分析。ImageFZ 也可用于从实验箱侧面拍摄图像的实验设置。此外，ImageFZ 最多可同时控制 4 套装置。该功能使研究人员能够同时检测 4 只小鼠，节省时间，并减少因各受试个体实验执行时间不同及测试顺序差异对行为结果造成的潜在影响。因此，ImageFZ 简化了僵直行为的测试流程与分析过程，使行为实验的检测更加省力，且无需对操作人员进行专门培训。

在宫川实验室中，我们利用视频分析系统对超过110种基因工程小鼠及野生型对照小鼠进行了情境性和提示性恐惧条件反射测试，以阐明特定基因对学习与记忆的影响41-42。我们已获得超过5000只小鼠的大量原始数据。用于已发表研究论文4-16的原始数据已被收录于公共数据库“小鼠表型数据库”中（网址：http://www.mouse-phenotype.org/）。本视频文章详细介绍了我们的实验操作流程，有助于加深对测试情境的理解。

披露

我们确认，本出版物不存在任何已知的利益冲突，且本研究未获得可能影响其结果的重大经济支持。

致谢

本文展示的部分数据是在美国国家精神卫生研究所Jacqueline N. Crawley博士的实验室中获得的，我们感谢她允许我们在论文中展示这些数据。我们还要感谢中西一雄在开发用于行为分析的ImageFZ程序过程中提供的帮助。本研究得到了日本文部科学省科学研究费补助金（B类）（21300121）、创新领域研究费补助金（综合脑科学网络）、神经信息学日本中心（NIJC）资助以及日本科学技术振兴机构（JST）CREST项目的资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ImageFZ 程序由 Tsuyoshi Miyakawa 开发该程序可通过日本东京的 O'Hara & Co. 获取，并可在 http://www.mouse-phenotype.org/ 免费下载。该软件适用于 32 位 Windows XP/Vista/7 系统。 
条件化实验箱O’Hara & Co., 日本CL-3002L适用于小鼠。
提示测试实验箱O’Hara & Co., 日本CLT-3002L适用于小鼠。
接口装置O’Hara & Co., 日本CL-1040该接口包含白噪声/音调发生器，可通过 ImageFZ 程序进行控制。
随机电击发生器O’Hara & Co., 日本SGA-2040电击发生器可通过 ImageFZ 程序进行控制。
电击栅格检测仪（电流表）O’Hara & Co., 日本SG-T
USB 视频采集设备XLR8USB2IVOSX
四通道图像分路器Wireless Tsukamoto Co., Ltd., 日本400AS
隔音室O’Hara & Co., 日本CL-4210
Freeze MonitorSan Diego Instruments, Inc., CA, 美国16 x 16 光束阵列 （2.5 cm 间距）

参考文献

  1. Crawley, J. N. What's wrong with my mouse: behavioral phenotyping of transgenic and knockout mice. , John Wiley & Sons. New York. (2007).
  2. Fanselow, M. S., Poulos, A. M. The neuroscience of mammalian associative learning. Annu. Rev. Psychol. 56, 207-234 (2005).
  3. LeDoux, J. E. Emotion circuits in the brain. Annu. Rev. Neurosci. 23, 155-184 (2000).
  4. Nakajima, R., et al. Comprehensive behavioral phenotyping of calpastatin-knockout mice. Mol. Brain. 1, 7 (2008).
  5. Ikeda, M., et al. Identification of YWHAE, a gene encoding 14-3-3epsilon, as a possible susceptibility gene for schizophrenia. Hum. Mol. Genet. 17, 3212-3222 (2008).
  6. Sakae, N., et al. Mice lacking the schizophrenia-associated protein FEZ1 manifest hyperactivity and enhanced responsiveness to psychostimulants. Hum. Mol. Genet. 17, 3191-3203 (2008).
  7. Fukuda, E., et al. Down-regulation of protocadherin-alpha A isoforms in mice changes contextual fear conditioning and spatial working memory. Eur. J. Neurosci. 28, 1362-1376 (2008).
  8. Imayoshi, I., et al. Roles of continuous neurogenesis in the structural and functional integrity of the adult forebrain. Nat. Neurosci. 11, 1153-1161 (2008).
  9. Nakatani, J., et al. Abnormal behavior in a chromosome-engineered mouse model for human 15q11-13 duplication seen in autism. Cell. 137, 1235-1246 (2009).
  10. Takao, K., et al. Comprehensive behavioral analysis of calcium/calmodulin-dependent protein kinase IV Knockout mice. PLoS ONE. 5, (2010).
  11. Tamada, K., et al. Decreased exploratory activity in a mouse model of 15q duplication syndrome; implications for disturbance of serotonin signaling. PLoS ONE. 5, (2010).
  12. Watanabe, Y., et al. Relaxin-3-deficient mice showed slight alteration in anxiety-related behavior. Front. Behav. Neurosci. 5, 50 (2011).
  13. Takeuchi, H., et al. P301S mutant human tau transgenic mice manifest early symptoms of human tauopathies with dementia and altered sensorimotor gating. PLoS ONE. 6, (2011).
  14. Koshimizu, H., et al. Adenomatous polyposis coli heterozygous knockout mice display hypoactivity and age-dependent working memory deficits. Front. Behav. Neurosci. 5, 85 (2011).
  15. Yao, I., Takao, K., Miyakawa, T., Ito, S., Setou, M. Synaptic E3 ligase SCRAPPER in contextual fear conditioning: extensive behavioral phenotyping of Scrapper heterozygote and overexpressing mutant mice. PLoS ONE. 6, (2011).
  16. Shoji, H., et al. Comprehensive behavioral analysis of ENU-induced Disc1-Q31L and -L100P mutant mice. BMC Res. Notes. 5, 108 (2012).
  17. Anagnostaras, S. G., Josselyn, S. A., Frankland, P. W., Silva, A. J. Computer-assisted behavioral assessment of Pavlovian fear conditioning in mice. Learn. Mem. 7, 58-72 (2000).
  18. Miyakawa, T., Yamada, M., Duttaroy, A., Wess, J. Hyperactivity and intact hippocampus-dependent learning in mice lacking the M1 muscarinic acetylcholine receptor. J. Neurosci. 21, 5239-5250 (2001).
  19. Marchand, A. R., Luck, D., DiScala, G. Evaluation of an improved automated analysis of freezing behaviour in rats and its use in trace fear conditioning. J. Neurosci. Methods. 126, 145-153 (2003).
  20. Kopec, C. D., et al. A robust automated method to analyze rodent motion during fear conditioning. Neuropharmacology. 52, 228-233 (2007).
  21. Wehner, J. M., et al. Quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in mice. Nat. Genet. 17, 331-334 (1997).
  22. Quirk, G. J., Armony, J. L., LeDoux, J. E. Fear conditioning enhances different temporal components of tone-evoked spike trains in auditory cortex and lateral amygdala. Neuron. 19, 613-624 (1997).
  23. Chaudhury, D., Christopher, S. C. Circadian modulation of learning and memory in fear-conditioned mice. Behav. Brain Res. 133, 95-108 (2002).
  24. Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
  25. Frankland, P. W., Bontempi, B. The organization of recent and remote memories. Nat. Rev. Neurosci. 6, 119-130 (2005).
  26. Contarino, A., Baca, L., Kennelly, A., Gold, L. H. Automated assessment of conditioning parameters for context and cued fear in mice. Learn. Mem. 9, 89-96 (2002).
  27. Kinney, J. W., et al. Deficits in trace cued fear conditioning in galanin-treated rats and galanin-overexpressing transgenic mice. Learn. Mem. 9, 178-190 (2002).
  28. Hefner, K., Holmes, A. Ontogeny of fear-, anxiety- and depression-related behavior across adolescence in C57BL/6J mice. Behav. Brain Res. 176, 210-215 (2007).
  29. Wellman, C. L., et al. Impaired stress-coping and fear extinction and abnormal corticolimbic morphology in serotonin transporter knock-out mice. J. Neurosci. 27, 684-691 (2007).
  30. Valentinuzzi, V. S., et al. Automated measurement of mouse freezing behavior and its use for quantitative trait locus analysis of contextual fear conditioning in (BALB/cJ × C57BL/6J)F2 mice. Learn. Mem. 5, 391-403 (1998).
  31. Valentinuzzi, V. S., et al. Effect of circadian phase on context and cued fear conditioning in C57BL/6J mice. Learn. Behav. 29, 133-142 (2001).
  32. Bothe, G. W. M., Bolivar, V. J., Vedder, M. J., Geistfeld, J. G. Genetic and behavioral differences among five inbred mouse strains commonly used in the production of transgenic and knockout mice. Genes Brain Behav. 3, 149-157 (2004).
  33. Chen, C., Kim, J. J., Thompson, R. F., Tonegawa, S. Hippocampal lesions impair contextual fear conditioning in two strains of mice. Behav. Neurosci. 110, 1177-1180 (1996).
  34. Anagnostaras, S. G., Gale, G. D., Fanselow, M. S. Hippocampus and contextual fear conditioning: Recent controversies and advances. Hippocampus. 11, 8-17 (2001).
  35. Akirav, I., Maroun, M. The role of the medial prefrontal cortex-amygdala circuit in stress effects on the extinction of fear. Neural Plast. , 1-11 (2007).
  36. Johansen, J. P., Cain, C. K., Ostroff, L. E., LeDoux, J. E. Molecular mechanisms of fear learning and memory. Cell. 147, 509-524 (2011).
  37. Anagnostaras, S. G., et al. Automated assessment of pavlovian conditioned freezing and shock reactivity in mice using the video freeze system. Front. Behav. Neurosci. 4, (2010).
  38. Pham, J., Cabrera, S. M., Sanchis-Segura, C., Wood, M. A. Automated scoring of fear-related behavior using EthoVision software. J. Neurosci. Methods. 178, 323-326 (2009).
  39. Blanchard, D. C., Blanchard, R. J. Crouching as an index of fear. J. Comp. Physiol. Psychol. 67, 370-375 (1969).
  40. Frankland, P. W., Bontempi, B., Talton, L. E., Kaczmarek, L., Silva, A. J. The involvement of the anterior cingulate cortex in remote contextual fear memory. Science. 304, 881-883 (2004).
  41. Takao, K., Miyakawa, T. Investigating gene-to-behavior pathways in psychiatric disorders: the use of a comprehensive behavioral test battery on genetically engineered mice. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1086, 144-159 (2006).
  42. Takao, K., Yamasaki, N., Miyakawa, T. Impact of brain-behavior phenotypying of genetically-engineered mice on research of neuropsychiatric disorders. Neurosci. Res. 58, 124-132 (2007).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

ImageFZ

相关文章