两种用于指定还原性α-和ε-二甲胺核磁共振信号的方法 13C-甲基化 N-末端赖氨酸的描述。一种方法利用还原性甲基化反应的pH诱导选择性，另一种方法使用氨肽酶选择性去除 N末端赖氨酸
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摘要
摘要
核磁共振（NMR）波谱法是研究蛋白质结构与动力学的成熟技术。利用NMR研究蛋白质时，通常通过代谢方式引入稳定的磁性同位素，以提高检测灵敏度并实现共振信号的序列归属。还原性13C-甲基化是一种替代性蛋白质标记方法，适用于那些难以通过细菌宿主过表达（同位素标记最常用的方法）进行标记的蛋白质。还原性13C-甲基化是一种在温和条件下进行的化学反应，可将蛋白质的伯氨基（赖氨酸的ε-氨基以及N-末端的α-氨基）修饰为13C-二甲氨基基团。大多数蛋白质的结构与功能在该修饰后保持不变，因此该方法是代谢标记的一种可行替代方案。由于还原性13C-甲基化引入的是稀疏分布的同位素标记，传统的NMR信号归属方法不再适用。为此，已开发出一种结合质谱法（MS）辅助完成蛋白质13C-二甲胺NMR信号归属的替代方法。该方法依赖于每个伯氨基上不同程度的部分13C-标记。当蛋白质的N-末端残基为赖氨酸时，该方法存在一个局限性，即Lys1的α-和ε-二甲氨基基团无法通过质谱单独测定。为克服这一局限，本文描述了两种方法，用于鉴定与N-末端α-胺和侧链ε-胺相关的13C-二甲胺的NMR共振信号。在1H-13C异核单量子相干谱中，成功识别了鸡蛋清溶菌酶Lys1的N-末端α-二甲胺和侧链ε-二甲胺的NMR信号。
引言
核磁共振（NMR）波谱法是蛋白质结构解析的重要工具1核磁共振波谱法可用于测定蛋白质在天然状态下的溶液结构。为了克服稳定磁性同位素天然丰度低的问题，有必要引入 13C 和 15N 引入目标蛋白。最常用的方法是在细菌宿主中进行重组表达。2-3然而，使用细菌宿主进行过表达有两个缺点：无法产生翻译后修饰，且并非对所有蛋白质都有效。3-4当细菌表达无法作为蛋白质生产的可行途径时，可采用非细菌宿主进行过表达，但同位素标记困难且成本较高5替代表达方法用于整合 13C 和 15用于核磁共振分析的蛋白质氮同位素标记包括利用甲基标记的代谢前体进行稀疏标记的技术6 和单个 13C, 15N 氨基酸7-9一种本文所采用的稀疏标记化学方法是成熟的还原性 13C-甲基化反应（图1），其中蛋白质上的伯氨基—— N-末端α-氨基和赖氨酸侧链的ε-氨基被甲基化。一旦生成单甲基胺，由于其更高的pKa值，氨基易于再次发生甲基化，形成二甲基胺。
还原性甲基化最初由 Means 和 Feeney 提出，作为一种化学修饰蛋白质的方法10该反应的优点在于其广泛的适用性....
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方案
1. 溶菌酶的还原甲基化
- 配制 500 ml 50 mM 的磷酸钠缓冲液（pH 7.5）。室温保存。
- 标记三个 1 ml 微量离心管，分别用于完全标记样品（FLS）、低 pH 部分标记样品（LpH）和高 pH 部分标记样品（HpH）。
- 称取 10 mg 溶菌酶，溶于 2 ml 磷酸钠缓冲液中，制成浓度为 5 mg/ml 的水溶液。 用铝箔覆盖管口，防止甲醛因光照而降解。向每根管中加入 500 μl 溶菌酶溶液。
- 新鲜配制 1.0 M 的二甲胺硼烷复合物（DMAB）和 13C-甲醛溶液。0 °C 下保存。
- 对于完全标记样品，采用 1:10 的摩尔比（反应性胺基 : 甲醛）；对于部分标记样品，采用 1:5 的摩尔比。也可根据需要优化该比例。例如，为了在低 pH 条件下突出 α-13C-二甲胺峰，需使用 2:7 的比例。
- 向 FLS 中加入 6.1 μl 1.0 M DMAB，向 LpH 和 HpH 中各加入 3.2 μl 1.0 M DMAB，并轻轻涡旋混匀。然后向 FLS 中加入 12.3 μl 1.0 M 13C-甲醛，向 LpH 和 HpH 中各加入 6.1 μl 1.0 M 13C-甲醛。将反应混合物在 4 °C 下振荡反应 2 小时。
- 按上一步相同体积再次加入 1.0 M DMAB 和 ....
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结果
还原甲基化与 pH
pH诱导的化学选择性还原 13C-甲基化反应已在溶菌酶上得到验证。在低pH条件下，该反应更倾向于 N-末端α-氨基相较于侧链ε-氨基，反之亦然，在高pH条件下。在溶液中，蛋白质的氨基在游离胺与共轭酸之间存在平衡，该平衡可通过pH调节。此反应的最佳pH范围取决于所用还原剂。本例中，二甲基胺硼烷的最佳pH为7.0–9.0。在还原剂的最佳范围之外进行反应虽会降低反应效率，但在此情况下反而成为优势。还原甲基化反应优先修饰 N- 在 pH 6.0 时由于较低的酸解离常数（pK）而导致的末端 α-胺基aα-氨基的（~7）23 与ε-氨基（约10个）相比32在 pH 6.0 时，平衡显著向有利于共轭酸的方向移动；此时 α-氨基以游离胺形式存在，浓度最高，是还原甲基化反应中的活性形式。在 pH 10.0 时，平衡则有利于游离胺。尽管 α-氨基的 pK 值较低a 几乎完全以游离胺形式存在，ε-氨基为更强的碱且更具反应性。在限量存在的情况下 <.......
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讨论
指派还原性 13C-甲基化蛋白质对于充分使用这种同位素标记方法是必要的。利用质谱（MS）通过部分信号的相关性来辅助核磁共振（NMR）信号的归属 13C-结合数据是一种颇具前景的技术。该技术相较于其他指认方法的优势在于仅需蛋白质的一级氨基酸序列。质谱辅助的指认方法在以下情况下存在局限性：当 N-末端氨基酸是赖氨酸，因为 13α-二甲胺和ε-二甲胺的碳同位素掺入无法通过质谱法单独测定。滴定实验通常显示α-二甲胺化学位移具有pH依赖性，但盐桥及其他结构因素使化学位移成为一种不可靠的归属方法。采用本文所述方法不仅解决了这一问题，还避免了测定各个位点的困难 13C %-掺入率用于α-和ε-二甲基氨基肽的质谱分析。由于一个位点被标记，因此 13C %-掺入可直接通过质谱法（MS）测量。由于此前仅使用平均值，赖氨酸1（Lys1）的α-和ε-二甲胺化修饰的归属存在歧义。 13C %-掺入量的测定34采用pH和氨肽酶方法，可直接指定α-和ε-二甲基胺峰，其结果与其他研究者的指定结果一致.......
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本研究获得了美国国立卫生研究院研究资源中心资助编号R00RR024105的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 乙腈 | Sigma | 34851 | |
| Amicon Ultra 4 ml 离心滤膜（3k MWCO） | Fisher Scientific | UFC800308 (8pk) | |
| 氨肽酶 | Creative Biomart | Aminopeptidase-86A | |
| 碳酸氢铵 | Sigma | A6141 | |
| 硫酸铵 | Sigma | A5132 | |
| 硼烷-二甲胺复合物 | Sigma | 180238 | 使用前新鲜配制 1 M 溶液。 |
| 硼酸 | Sigma | B6768 | |
| 牛胰岛素 | Sigma | I5500 | |
| C18 离心柱 | Thermo Scientific | 89870 | |
| 重水 | Cambridge Isotope Laboratories | DLM-4-100 | |
| 1,2-二氯乙烷-13C2 | Sigma | 714321 | 80 mM 储存液，保存于 -80 °C。NMR 谱图中以 24 mM 作为参考。 |
| 甲醛（36.5% wt/wt） | Sigma | 33220 | 使用前新鲜配制 1 M 溶液。 |
| 13C-甲醛（99%） | Cambridge Isotope Laboratories | CLM-806-1 | 使用前新鲜配制 1 M 溶液。 |
| 溶菌酶（鸡蛋清来源） | Sigma | L6376 | |
| 磷酸钠（七水合二碱） | Sigma | S9390 | |
| 磷酸钠（单碱） | Sigma | S9638 | |
| Tricine | Sigma | T0377 | |
| 三氟乙酸 | Sigma | 302031 | |
| 700 MHz Varian VNMRS 配备 5 mm HCN 5922 探头 | Agilent Technologies | ||
| Bruker UltrafleXtreme MALDI TOF/TOF | Bruker |
参考文献
- Bax, A., Grzesiek, S. Methodological Advances in Protein NMR. Accounts of Chemical Research. 26 (4), 131-138 (1993).
- Shimba, N., Yamada, N., Yokoyama, K., Suzuki, E. Enzymatic Labeling of Arbitrary Proteins. Analytical Biochemistry. 301 (1), 123-127 (2002).
- Palomares, L.,....
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