Caenorhabditis elegans 是研究多不饱和脂肪酸在发育和生理功能中作用的有用模型。本方案描述了一种高效地向 C. elegans 饮食中添加多不饱和脂肪酸的方法。
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本文内容
摘要
摘要
脂肪酸对多种细胞功能至关重要。它们可作为高效的能量储存分子，构成膜的疏水核心，并参与多种信号通路。Caenorhabditis elegans 能够合成一系列 omega-6 和 omega-3 脂肪酸所需的所有酶。这一特性，结合其简单的解剖结构和丰富的可用遗传工具，使其成为研究脂肪酸功能的理想模型。为了研究介导膳食脂肪酸生理效应的遗传通路，我们建立了一种向 C. elegans 饮食中补充不饱和脂肪酸的方法。补充脂肪酸是一种有效改变线虫脂肪酸组成的方法，也可用于挽救脂肪酸缺乏突变体的缺陷表型。本方法使用添加了脂肪酸钠盐的线虫生长培养基琼脂（NGM）。在添加脂肪酸的培养板中，脂肪酸会整合到细菌食物来源的膜中，随后被取食这些细菌的 C. elegans 摄取。我们还描述了一种气相色谱分析方案，用于监测补充脂肪酸后线虫体内脂肪酸组成的变化。该方法可高效地用于大量或少量 C. elegans 群体的饮食补充，具有广泛的应用前景。
引言
脂肪酸不仅是细胞膜的重要结构组分，也是高效的能量储存分子。此外，脂肪酸可由脂肪酶从细胞膜上切割下来，并通过酶促修饰生成信号效应分子1。天然存在的多不饱和脂肪酸（PUFAs）含有两个或两个以上cis构型的双键。ω-3脂肪酸与ω-6脂肪酸的区别在于其双键相对于脂肪酸甲基端的位置不同。健康的饮食需要同时摄入ω-6和ω-3脂肪酸。然而，西方饮食中特别富含ω-6脂肪酸，而缺乏ω-3脂肪酸。较高的ω-6与ω-3脂肪酸比例与心血管疾病和炎症性疾病风险增加相关，但特定脂肪酸确切的有益和有害作用尚不明确2。线虫Caenorhabditis elegans在研究脂肪酸功能方面具有重要价值，因为它能够合成一系列ω-6和ω-3脂肪酸所需的所有酶，包括ω-3去饱和酶——这一活性在大多数动物中并不存在3,4。缺乏脂肪酸去饱和酶的突变体无法合成特定的多不饱和脂肪酸，从而导致多种发育和神经系统的缺陷4-6。
为了研究膳食脂肪酸的生理效应，我们建立了一种生化检测方法，该方法可与遗传分析相结合，利用C. elegans的突变体及RNAi基因敲低技术进行研究。特定多不饱和脂肪酸（PUFA）的补充是通过在倒平板前将脂肪酸钠盐溶液加入琼脂培养基中实现的。这使得E. coli食物来源吸收PUFA，并在其细菌膜中积累。当C. elegans摄食含有PUFA的细菌后，膳食补充足以挽救PUFA缺乏突变体的表型缺陷。大多数脂肪酸的补充对野生型动物无不良影响，然而，特定的ω-6脂肪酸，尤其是二高-γ-亚麻酸（DGLA, 20:3n-6），会导致C. elegans生殖细胞发生永久性破坏7,8。
气相色谱法用于监测添加的脂肪酸在细菌食物来源（OP50 或 HT115）以及线虫体内的摄取情况。E. coli 和线虫对脂肪酸的摄取效率更高，培养基中添加去垢剂 Tergitol（NP-40）可使脂肪酸在整个培养皿中均匀分布。我们发现，不饱和脂肪酸可被细菌和 C. elegans 有效摄取，而饱和脂肪酸的摄取效率则低得多。本文将逐步介绍如何在琼脂培养基中添加脂肪酸，以及如何利用气相色谱法监测线虫对脂肪酸的摄取情况。
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方案
多不饱和脂肪酸对热、光和氧气敏感。因此，在制备脂肪酸补充培养板时需格外注意，避免脂肪酸暴露于过量的热和光条件下。含有0.1% Tergitol（NP-40）的NGM培养基经高压灭菌后部分冷却，随即在持续搅拌下加入脂肪酸钠盐。平板需在避光条件下晾干。随后可通过气相色谱法检测在这些平板上培养的C. elegans对脂肪酸的摄取情况。
1. 脂肪酸补充培养基的制备
- 将培养基组分称量至适当大小的烧瓶中。每 1 L 加入 17 g Bacto-琼脂、2.5 g 胰蛋白胨、3 g NaCl、1 ml 5 mg/ml 溶于乙醇的胆固醇，以及 10 ml 10% 溶于水的Tergitol。
- 加入最终所需体积 80% 的Millipore水，并将培养基连同空玻璃瓶（数量等于待测试的不同脂肪酸浓度数）以及合适的量筒一同灭菌。
- 将培养基置于设定为 55 °C 的水浴中冷却。在培养基冷却的同时，采取安全防护措施打开玻璃小瓶，制备脂肪酸钠盐的工作液，确保玻璃碎屑不混入脂肪酸中。称取足量脂肪酸以配制 100 mM 的工作液。
- 用纯化水将脂肪酸溶液调节至终浓度为 100 mM。脂肪酸钠盐完全溶解通常需要约 20–30 分钟。用氩气或氮气对脂肪酸工作液进行吹扫，因惰性气体可防止氧化。盖上瓶盖并将工作液避光保存，直至培养基冷却。
- （可选）若需制备RNAi培养基，此时称取氨苄青霉素和异丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (IPTG) 溶液。
- 当琼脂冷却至 55 °C 时，每 1 L 加入：1 ml 1 M MgSO4、1 ml 1 M CaCl2 和 25 ml 磷酸盐缓冲液（每 1 L 含 108.3 g KH2PO4 和 35.6 g K2HPO4，经高压灭菌）。若制备RNAi平板，则加入经滤膜除菌的氨苄青霉素和IPTG溶液。对于所有类型的平板，加入无菌水使培养基最终体积达到 1 L。
- 在火焰旁将培养基转移至已灭菌且大小合适的量筒中，然后加入温热的无菌水至所需体积。再将培养基转移回初始烧瓶中，通过搅拌混合均匀。
- 在火焰旁，使用已灭菌且大小合适的量筒，将培养基分装至若干个玻璃瓶中（数量等于待测试的浓度数）。将分装后的培养基置于水浴中保持液态，直至脂肪酸工作液完全溶解。
- 取其中一瓶置于磁力搅拌器上，搅拌至培养基手感温热但不烫手。确保留有足够时间在培养基开始凝固前完成脂肪酸工作液的混匀和倒板操作。若搅拌器具有温度控制功能，将其设定为 55 °C。
- 将 100 mM 脂肪酸工作液稀释至所需的终浓度。持续搅拌培养基，直至白色沉淀完全溶解（约 1 分钟）。之后培养基可能仍略显浑浊。
- （可选）若需制备RNAi培养基，将氨苄青霉素加入至终浓度 0.1 mg/ml，IPTG 加入至终浓度 2 mM。
- 使用自动移液器和无菌 25 ml 移液管倒板，每 60 mm 培养皿加入 8 ml 培养基，每 100 mm 培养皿加入 25 ml 培养基。对剩余的玻璃瓶重复脂肪酸添加和倒板步骤。
- 琼脂凝固后，用盒子盖住添加了脂肪酸的平板，或将其置于通风良好的抽屉中于室温避光保存，以防止光氧化。
- 平板干燥两天后，接种 E. coli OP50。对于 60 mm 培养皿，加入 300 µl 过夜培养的OP50菌液（37 °C 培养）。若已制备RNAi平板，则在平板干燥四天后接种 300 µl RNAi细菌。由于不同实验室环境湿度差异，平板干燥时间可能需要相应调整。
- 将平板置于黑暗环境中室温孵育，直至细菌菌膜完全干燥。
2. 通过补充二高-γ-亚麻酸诱导生殖细胞破坏
- C. elegans 在含有 0.3 mM DGLA (20:3n-6) 的培养板上生长后会因生殖细胞在幼虫期和成虫期均被破坏而出现不育现象。
- 通过用碱性次氯酸盐溶液处理产卵雌雄同体虫以制备同步化的 L1 幼虫群体（配制 10 ml 溶液：0.5 ml 5M NaOH、2.5 ml 家用漂白剂和 7 ml H2O）。将产卵雌雄同体虫在此溶液中轻轻振荡，直至成虫溶解。卵将得以保留，并可通过低速离心收集沉淀。
- 用 M9 缓冲液（3 g KH2PO4、6 g Na2HPO4、5 g NaCl、1 ml 1 M MgSO4，加 H2O 至 1 L；高压灭菌后加入 MgSO4）清洗卵悬液三次。为提供充足氧气，将卵重悬于 15 ml 塑料管中，最终体积为 5 ml M9 缓冲液，并在摇床上振荡过夜。
- 在接种 OP50 两天后，或铺 RNAi 细菌一天后，将 L1 幼虫转移至添加了 DGLA 的培养板中。将线虫在 20 °C 下培养三天，或直至其发育至成虫阶段。
- 可使用解剖显微镜对成虫进行不育性评分，显微镜需具备足够高的放大倍数以观察子宫内发育中的胚胎。成功的生殖细胞丢失表现为子宫透明、无卵。
- 也可通过固定并用核酸染料 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）染色来评估线虫。通过将线虫挑入载玻片凹槽中的一滴 M9 缓冲液即可实现快速 DAPI 染色9。
- 向凹槽中加入 1 ml 浓度为 0.2 ng/ml 的 DAPI 95% 乙醇溶液，静置约 5 分钟。
- 将线虫挑入载玻片上的一滴 VectaShield 封片剂中，然后加盖盖玻片。
- 用封片剂密封盖玻片，并在 4 °C 黑暗条件下过夜孵育以获得最佳染色效果，但也可立即观察。使用配备紫外灯和滤光片的荧光显微镜观察生殖细胞核和发育中胚胎核的存在与否，并进行评分。
3. 通过气相色谱法确认脂肪酸的摄取
C. elegans 的总脂肪酸组成可通过生成脂肪酸甲酯（FAMEs），然后使用气相色谱法进行分离和定量来确定4。
- 用清水将500–1,000条成虫从培养板上冲洗下来，并转移至一支硅化处理的13 mm × 100 mm玻璃螺口管中。
- 让虫体依靠重力自然沉降，随后用玻璃巴斯德吸管尽可能吸除上清水相。
- 用清水洗涤虫体一次，再尽可能吸除水分。
- 通过加入1 ml 含2.5% H2SO4的甲醇溶液，并在70 °C水浴中加热1小时，生成脂肪酸甲酯（FAMEs）。
- 将试管从水浴中取出，冷却1分钟。
- 加入1.5 ml 水和0.25 ml 正己烷，以萃取FAMEs。
- 盖紧管盖并剧烈振荡。
- 将试管放入台式临床离心机中，以最高速度离心1分钟 ，使正己烷与水相完全分离。
- 将正己烷层（上层）小心转移至气相色谱（GC）小瓶内的插件中，注意避免带入任何水相。进行GC分析时，取1–2 μl溶于正己烷的FAMEs样品注入适合FAMEs分析的极性毛细管气相色谱柱。安捷伦7890气相色谱仪的进样口温度设为250 °C，载气流速为1.4 ml/min；色谱柱升温程序设定为初始温度130 °C，保持1分钟；随后以10 °C/min升温至190 °C，再以5 °C/min升温至210 °C，并保持1分钟。
- 为确认DGLA已被摄取，应采用火焰离子化检测器（FID）或质谱（MS）检测FAMEs，并使用标准品对照鉴定C. elegans脂肪酸的组成。
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结果
秀丽隐杆线虫（C. elegans）饮食中补充脂肪酸的能力受限于其细菌食物来源吸收并将其整合到细菌膜中的能力。为确定大肠杆菌（E. coli）OP50 将不同脂肪酸整合入其细胞膜的能力，将 OP50 分别接种于未添加补充物、添加 0.1 mM 和 0.3 mM 硬脂酸（18:0）、油酸钠（18:1n-9）或二高-γ-亚麻酸钠（DGLA, 20:3n-6）的培养基平板上。平板在室温下避光干燥 2 天，随后在 20 °C 培养 3 天。用火焰灭菌的刮刀轻轻刮取菌苔并收集至水中。细菌经离心沉淀后，用含 2.5% H2SO4 的甲醇处理以生成脂肪酸甲酯，随后依照实验方案第 3 步所述方法进行气相色谱-质谱（GC/MS）分析。结果表明，不饱和脂肪酸（油酸和 DGLA）在 OP50 中的整合量高于饱和脂肪酸硬脂酸（图 1A）。
此外，将L1期N2幼虫接种于同一批添加补充物的平板上，并在培养三天后收获 20 °C将线虫从培养板上冲洗下来，通过气相色谱-质谱法（GC/MS）分析整个线虫...
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讨论
本文介绍了一种向秀丽隐杆线虫（C. elegans）补充膳食不饱和脂肪酸的方法。如上所述，在制备添加多不饱和脂肪酸（PUFA）的培养板时需格外注意，由于多不饱和脂肪酸中的双键具有较高的反应活性，易受热和光的影响而发生氧化11。为避免氧化，应在培养基冷却至55 °C后，再将PUFA加入液态琼脂培养基中，并将培养板储存于避光环境中。
其他研究者曾使用 DMSO 或乙醇作为载体将游离脂肪酸引入 C. elegans，或通过显微注射直接将脂肪酸注入阴门12-14。在无需使用 Tergitol(NP40) 的情况下，通过在培养板中补充脂肪酸已实现对突变表型的部分挽救14-15。显然，存在多种有效的方法可将脂肪酸导入 C. elegans，但由于在大多数实验中并未监测线虫对脂肪酸的摄取情况，因此难以比较各种方法的效率。我们发现，本方法能够对从少量到数万条不等的线虫群体实现稳定且高效的不饱和脂肪酸补充。
我们发现，监测外源...
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢 Chris Webster 完成了代表性结果中图3所示的初步实验，感谢 Jason Watts 和 Chris Webster 对手稿提出的有益意见。本研究的资金由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（R01DK074114）提供给 JLW。本研究中使用的一些线虫品系由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供，该中心由 NIH 研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂（Bacto-Agar） | Difco | 214010 | |
| 胰蛋白胨（Tryptone） | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 特吉托尔（Tergitol） | Sigma | NP40S-500mL | |
| 胆固醇（Cholesterol） | Sigma | C8667-25G | （溶于乙醇，5 mg/mL） |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| 二高-γ-亚麻酸钠（Sodium dihomogamma linolenate） | NuCHEK | S-1143 | |
| 温热的无菌Millipore水 | |||
| 用于收集线虫的无菌水 | |||
| 用于DGLA储备液的无核酸酶水（Nuclease-free Water） | Ambion | AM9932 | |
| 氨苄青霉素（Ampicillin） | Fisher Scientific | BP1760-25 | 溶于水，100 mg/mL（用于RNAi平板） |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG） | Gold Biotechnology | 12481C100 | 溶于水，1 M（用于RNAi平板） |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| 甲醇（Methanol） | Fisher Scientific | A452-4 | |
| 己烷（Hexane） | Fisher Scientific | H302-4 | |
| 二氨基二苯基吲哚（diamindinophenylindole, DAPI） | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 玻璃烧瓶 | Corning | 4980-2L | |
| 可高压灭菌的带搅拌子玻璃瓶 | Fisherbrand | FB-800 | |
| 可高压灭菌的玻璃量筒 | Fisherbrand | 08-557 | |
| 磁力搅拌器 | VWR | 97042-642 | |
| 55+ °C 水浴锅 | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| 螺口棕色玻璃小瓶 | Sun SRI | 200 494 | |
| 氩气钢瓶 | |||
| 自动移液器辅助装置（Automated Pipette aid） | Pipette-Aid | P-90297 | |
| 无菌血清移液管（25 ml） | Corning | 4489 | |
| 本生灯（Bunsen Burner） | VWR | 89038-534 | |
| 解剖显微镜 | Leica | TLB3000 | |
| 硅烷化玻璃管 | Thermo Scientific | STT-13100-S | 用于脂肪酸甲酯（FAMEs）衍生化 |
| 聚四氟乙烯（PTFE）螺口盖 | Kimble-Chase | 1493015D | |
| 临床台式离心机 | IEC | ||
| GC压盖小瓶（GC Crimp Vial） | SUN SRi | 200 000 | |
| GC小瓶内插管（GC Vial Insert） | SUN SRi | 200 232 | |
| GC小瓶盖（GC Vial cap） | SUN SRi | 200 100 | |
| 气相色谱仪（Gas Chromatograph） | Agilent | 7890A | |
| 质谱检测器（Mass Spectrometry Detector） | Agilent | 5975C | |
| 气相色谱柱 | Suppelco | SP 2380 | 30 m × 0.25 mm 熔融石英毛细管柱 |
参考文献
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