Caenorhabditis elegans 是研究多不饱和脂肪酸在发育和生理功能中作用的有用模型。本方案描述了一种高效地向 C. elegans 饮食中添加多不饱和脂肪酸的方法。
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本文内容
摘要
摘要
脂肪酸对多种细胞功能至关重要。它们可作为高效的能量储存分子，构成膜的疏水核心，并参与多种信号通路。Caenorhabditis elegans 能够合成一系列 omega-6 和 omega-3 脂肪酸所需的所有酶。这一特性，结合其简单的解剖结构和丰富的可用遗传工具，使其成为研究脂肪酸功能的理想模型。为了研究介导膳食脂肪酸生理效应的遗传通路，我们建立了一种向 C. elegans 饮食中补充不饱和脂肪酸的方法。补充脂肪酸是一种有效改变线虫脂肪酸组成的方法，也可用于挽救脂肪酸缺乏突变体的缺陷表型。本方法使用添加了脂肪酸钠盐的线虫生长培养基琼脂（NGM）。在添加脂肪酸的培养板中，脂肪酸会整合到细菌食物来源的膜中，随后被取食这些细菌的 C. elegans 摄取。我们还描述了一种气相色谱分析方案，用于监测补充脂肪酸后线虫体内脂肪酸组成的变化。该方法可高效地用于大量或少量 C. elegans 群体的饮食补充，具有广泛的应用前景。
引言
脂肪酸不仅是细胞膜的重要结构组分，也是高效的能量储存分子。此外，脂肪酸可由脂肪酶从细胞膜上切割下来，并通过酶促修饰生成信号效应分子1。天然存在的多不饱和脂肪酸（PUFAs）含有两个或两个以上cis构型的双键。ω-3脂肪酸与ω-6脂肪酸的区别在于其双键相对于脂肪酸甲基端的位置不同。健康的饮食需要同时摄入ω-6和ω-3脂肪酸。然而，西方饮食中特别富含ω-6脂肪酸，而缺乏ω-3脂肪酸。较高的ω-6与ω-3脂肪酸比例与心血管疾病和炎症性疾病风险增加相关，但特定脂肪酸确切的有益和有害作用尚不明确2。线虫Caenorhabditis elegans在研究脂肪酸功能方面具有重要价值，因为它能够合成一系列ω-6和ω-3脂肪酸所需的所有酶，包括ω-3去饱和酶——这一活性在大多数动物中并不存在3,4。缺乏脂肪酸去饱和酶的突变体无法合成特定的多不饱和脂肪酸，从而导致多种发育和神经系统的缺陷4-6。
为了研究膳食脂肪酸的生理效应，我们建立了一种生化检测方法，该方法可与遗传分析相结合，利用C. elegans的突变体及RNAi基因敲低技术进行研究。特定多不饱和脂肪酸（PUFA）的补充是通过在倒平板前将脂肪酸钠盐溶液加入琼脂培养基中实现的。这使得E. coli食物来源吸收PUFA，并在其细菌膜中积累。当C. elegans摄食含....
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方案
多不饱和脂肪酸对热、光和氧气敏感。因此，在制备脂肪酸补充培养板时需格外注意，避免脂肪酸暴露于过量的热和光条件下。含有0.1% Tergitol（NP-40）的NGM培养基经高压灭菌后部分冷却，随即在持续搅拌下加入脂肪酸钠盐。平板需在避光条件下晾干。随后可通过气相色谱法检测在这些平板上培养的C. elegans对脂肪酸的摄取情况。
1. 脂肪酸补充培养基的制备
- 将培养基组分称量至适当大小的烧瓶中。每 1 L 加入 17 g Bacto-琼脂、2.5 g 胰蛋白胨、3 g NaCl、1 ml 5 mg/ml 溶于乙醇的胆固醇，以及 10 ml 10% 溶于水的Tergitol。
- 加入最终所需体积 80% 的Millipore水，并将培养基连同空玻璃瓶（数量等于待测试的不同脂肪酸浓度数）以及合适的量筒一同灭菌。
- 将培养基置于设定为 55 °C 的水浴中冷却。在培养基冷却的同时，采取安全防护措施打开玻璃小瓶，制备脂肪酸钠盐的工作液，确保玻璃碎屑不混入脂肪酸中。称取足量脂肪酸以配制 100 mM 的工作液。
- 用纯化水将脂肪酸溶液调节至终浓度为 100 mM。脂肪酸钠盐完全溶解通常需要约 20–30 分钟。用氩气或氮气对脂肪酸工作液进行吹扫，因惰性气体可防止氧化。盖上瓶盖并将工作液避光保存，直至培养基冷却。
- （可选）若需制备RNAi培养基，此时称取....
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结果
秀丽隐杆线虫（C. elegans）饮食中补充脂肪酸的能力受限于其细菌食物来源吸收并将其整合到细菌膜中的能力。为确定大肠杆菌（E. coli）OP50 将不同脂肪酸整合入其细胞膜的能力，将 OP50 分别接种于未添加补充物、添加 0.1 mM 和 0.3 mM 硬脂酸（18:0）、油酸钠（18:1n-9）或二高-γ-亚麻酸钠（DGLA, 20:3n-6）的培养基平板上。平板在室温下避光干燥 2 天，随后在 20 °C 培养 3 天。用火焰灭菌的刮刀轻轻刮取菌苔并收集至水中。细菌经离心沉淀后，用含 2.5% H2SO4 的甲醇处理以生成脂肪酸甲酯，随后依照实验方案第 3 步所述方法进行气相色谱-质谱（GC/MS）分析。结果表明，不饱和脂肪酸（油酸和 DGLA）在 OP50 中的整合量高于饱和脂肪酸硬脂酸（图 1A）。
此外，将L1期N2幼虫接种于同一批添加补充物的平板上，并在培养三天后收获 20 °C将线虫从培养板上冲洗下来，通过气相色谱-质谱法（GC/MS）分析整个线虫.......
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讨论
本文介绍了一种向秀丽隐杆线虫（C. elegans）补充膳食不饱和脂肪酸的方法。如上所述，在制备添加多不饱和脂肪酸（PUFA）的培养板时需格外注意，由于多不饱和脂肪酸中的双键具有较高的反应活性，易受热和光的影响而发生氧化11。为避免氧化，应在培养基冷却至55 °C后，再将PUFA加入液态琼脂培养基中，并将培养板储存于避光环境中。
其他研究者曾使用 DMSO 或乙醇作为载体将游离脂肪酸引入 C. elegans，或通过显微注射直接将脂肪酸注入阴门12-14。在无需使用 Tergitol(NP40) 的情况下，通过在培养板中补充脂肪酸已实现对突变表型的部分挽救14-15。显然，存在多种有效的方法可将脂肪酸导入 C. elegans，但由于在大多数实验中并未监测线虫对脂肪酸的摄取情况，因此难以比较各种方法的效率。我们发现，本方法能够对从少量到数万条不等的线虫群体实现稳定且高效的不饱和脂肪酸补充。
我们发现，监测外源.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
感谢 Chris Webster 完成了代表性结果中图3所示的初步实验，感谢 Jason Watts 和 Chris Webster 对手稿提出的有益意见。本研究的资金由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目（R01DK074114）提供给 JLW。本研究中使用的一些线虫品系由线虫遗传学中心（Caenorhabditis Genetics Center）提供，该中心由 NIH 研究基础设施项目办公室（P40 OD010440）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 细菌琼脂（Bacto-Agar） | Difco | 214010 | |
| 胰蛋白胨（Tryptone） | Difco | 211705 | |
| NaCl | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 特吉托尔（Tergitol） | Sigma | NP40S-500mL | |
| 胆固醇（Cholesterol） | Sigma | C8667-25G | （溶于乙醇，5 mg/mL） |
| MgSO4 | J.T. Baker | 2504-01 | |
| CaCl2 | J.T. Baker | 1311-01 | |
| K2HPO4 | J.T. Baker | 3254-05 | |
| KH2PO4 | J.T. Baker | 3246-05 | |
| 二高-γ-亚麻酸钠（Sodium dihomogamma linolenate） | NuCHEK | S-1143 | |
| 温热的无菌Millipore水 | |||
| 用于收集线虫的无菌水 | |||
| 用于DGLA储备液的无核酸酶水（Nuclease-free Water） | Ambion | AM9932 | |
| 氨苄青霉素（Ampicillin） | Fisher Scientific | BP1760-25 | 溶于水，100 mg/mL（用于RNAi平板） |
| 异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG） | Gold Biotechnology | 12481C100 | 溶于水，1 M（用于RNAi平板） |
| HSO4 | J.T. Baker | 9681-03 | |
| 甲醇（Methanol） | Fisher Scientific | A452-4 | |
| 己烷（Hexane） | Fisher Scientific | H302-4 | |
| 二氨基二苯基吲哚（diamindinophenylindole, DAPI） | Sigma | D9542 | |
| VectaShield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| 玻璃烧瓶 | Corning | 4980-2L | |
| 可高压灭菌的带搅拌子玻璃瓶 | Fisherbrand | FB-800 | |
| 可高压灭菌的玻璃量筒 | Fisherbrand | 08-557 | |
| 磁力搅拌器 | VWR | 97042-642 | |
| 55+ °C 水浴锅 | Precision Scientific Inc. | 66551 | |
| 螺口棕色玻璃小瓶 | Sun SRI | 200 494 | |
| 氩气钢瓶 | |||
| 自动移液器辅助装置（Automated Pipette aid） | Pipette-Aid | P-90297 | |
| 无菌血清移液管（25 ml） | Corning | 4489 | |
| 本生灯（Bunsen Burner） | VWR | 89038-534 | |
| 解剖显微镜 | Leica | TLB3000 | |
| 硅烷化玻璃管 | Thermo Scientific | STT-13100-S | 用于脂肪酸甲酯（FAMEs）衍生化 |
| 聚四氟乙烯（PTFE）螺口盖 | Kimble-Chase | 1493015D | |
| 临床台式离心机 | IEC | ||
| GC压盖小瓶（GC Crimp Vial） | SUN SRi | 200 000 | |
| GC小瓶内插管（GC Vial Insert） | SUN SRi | 200 232 | |
| GC小瓶盖（GC Vial cap） | SUN SRi | 200 100 | |
| 气相色谱仪（Gas Chromatograph） | Agilent | 7890A | |
| 质谱检测器（Mass Spectrometry Detector） | Agilent | 5975C | |
| 气相色谱柱 | Suppelco | SP 2380 | 30 m × 0.25 mm 熔融石英毛细管柱 |
参考文献
- Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease. Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).
- de Lorgeril, M., Salen, P. New insights into the health effects of dietary satu....
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重印与许可
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