从成年大脑中分离获取的神经干细胞正越来越多地应用于神经系统发育的基础研究，以及再生医学中潜在临床应用的探索。因此，严格控制这些细胞的分离和培养条件，对于获得可靠的实验结果至关重要。
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摘要
摘要
近期研究表明，中枢神经系统（CNS）的再生与肿瘤发生均涉及存在于成年大脑中的干细胞（SCs）群体。然而，这些通常处于静息状态的细胞如何维持神经网络的正常功能，以及其在脑损伤修复和神经退行性过程缓解中的作用，目前仍知之甚少。这些细胞存在于被称为 "生态位" 为中枢神经系统干细胞提供由血管系统和免疫系统共同介导的调节信号所构成的维持性环境。在排除未知因素的明确培养条件下对中枢神经系统干细胞进行分离、维持和分化，使其能够接受药理学或遗传学手段的干预，从而有助于深入理解其生物学特性 体内 行为。本文提供了从成年大脑不同区域生成中枢神经系统干细胞（CNS SCs）培养物的详细方法，以及评估其向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化潜能的技术方案。 体外该技术可获得均一的细胞群体，以单层培养形式呈现，便于观察单个施万细胞（SCs）及其子代细胞。此外，该方法可应用于不同的动物模型系统及临床样本，此前已被用于预测成年神经系统损伤后的再生反应。
引言
一个多世纪前，拉蒙·卡哈尔（Ramón Y. Cajal）通过对脑细胞结构的基本观察，确立了神经生物学的中心教条，即鉴于中枢神经系统（CNS）中神经网络的复杂性，青春期后神经发生极不可能发生1。尽管20世纪60年代阿尔特曼（Altman）以及后来卡普兰（Kaplan）的研究表明，3H-胸腺嘧啶可出现在成熟神经元中，提示成年动物大脑特定区域确有新神经元生成，但该教条仍长期占据主导地位2,3。随后，诺特博姆（Nottebohm）关于鸣禽脑内神经元数量随季节变化的研究进一步积累了支持证据4。直到1999年，古尔德（Gould et al.）发表研究，证明大鼠在执行联想学习任务时海马区神经元生成增加，同时科纳克（Kornack）和拉基奇（Rakic）观察到成年恒河猴中持续存在神经发生，学界才开始承认大脑具有较低刚性、更高可塑性的概念5,6。
寻找这些de novo新生神经元的细胞来源，促使人们发现了一群定位于被称为“生态位”（niches）的脑区内的离散干细胞（SCs）群体7。脑室下区和海马体颗粒下区被认为是两个主要的神经发生区域8,9。从这些区域分离出的细胞表现出胚胎或胎儿来源干细胞的经典特征，即自我更新能力和多向分化潜能。对于神经干细胞（NSCs）而言，它们可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。此外，这些干细胞 对胎儿神经干细胞标志物呈阳性染色，例如中间丝蛋白nestin10。近期的研究进一步表明，干细胞可能不仅局限于这两个区域，实际上在全脑范围内均有分布，是一类与血管系统紧密关联、多数处于静息状态的细胞群体11。
观察发现，施万细胞（SCs）会在损伤后被动员，这提示了利用这些细胞进行再生修复以促进神经退行性疾病和中风恢复的可能性12,13。这一作用与间充质干细胞（MSCs） 在结缔组织修复中的作用相似，MSCs作为血管周围细胞，具有分化为成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的潜能14。然而，神经干细胞（NSCs）无法像MSCs那样通过常规的骨髓穿刺和密度梯度离心技术从骨髓中获取，并用于自体细胞治疗。因此，研究人员已广泛探索了其他细胞来源，例如利用胎儿NSCs或由胚胎干细胞衍生的神经前体细胞，在动物疾病和损伤模型中进行了不同程度的成功研究15。利用体细胞来源的诱导性多能干细胞技术为开发适用于多种应用的治疗性细胞疗法提供了另一条潜在途径，克服了胚胎细胞和胎儿组织在可用性及伦理方面的限制16。然而，将这些研究成果转化为临床应用已被证明是一项艰巨的任务，这在尝试用干细胞为基础的治疗方法治疗各种神经系统疾病的过程中已有所体现17,18，同时也面临着艰难的监管审批路径。作为一种替代策略，使用特定的药物干预可调节NSC的数量，并在帕金森病和中风模型中促进功能恢复19。无论采取何种策略，要有效操控这些细胞，都需要一个可及的体外系统。
NSCs 培养可采用集落培养（又称神经球）或单层培养形式进行8,20两种技术均已得到广泛应用，使得定义明确的培养条件得以建立， 即 使用表皮生长因子（EGF）或碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）作为有丝分裂原来源，可促进多能前体细胞的扩增。尽管神经球培养体系更适用于研究分离细胞类型的克隆增殖能力，但该体系在扩增过程中已被证实会产生混合的细胞群体21此外，神经球的闭合结构使得对细胞进行药理学操作变得不切实际，且由于神经球内部形成的微环境，这些因素可能产生的影响也难以准确解析。相比之下，单层培养可用于小分子文库的高通量筛选，为研究调控干细胞增殖与分化的信号转导机制提供了有力工具，同时也为发现特异性靶向该细胞群体的新型化合物创造了机会。
因此，能够可重复地从大脑不同感兴趣区域生成成年神经干细胞（NSC）培养物，可用于广泛的研究领域，从中枢神经系统（CNS）的发育研究到探索新的再生医学方法。本文所展示的实验方案演示了如何分离并评估从成年啮齿类动物脑中获取的中枢神经系统干细胞（CNS SC）的分化潜能。
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方案
本研究遵循《赫尔辛基宣言》和ARVO动物研究声明。实验动物用于组织采集，所有相关方法均按照德累斯顿大学动物实验中心的指导进行。动物的饲养和管理遵循德国联邦关于实验动物使用与护理的指导方针，研究方案经德累斯顿地方管理局（Landesdirektion Dresden）批准。有关适当的安乐死方法，请咨询您所在机构的兽医政策（如IACUC或其他伦理委员会）。
特定试剂的储存浓度和工作浓度可在本实验方案附带的试剂表中找到。
1. 培养皿准备
- 用足量的75 μg/ml多聚-L-鸟氨酸包被培养皿（即 2 ml/孔，置于6孔板中），在预定解剖日期前2天放入细胞培养箱中孵育过夜。
- 次日吸除聚-L-鸟氨酸，并用 PBS 洗涤每孔 2 次 用 3 ml PBS 洗涤 5 分钟。
- 去除最后一次洗涤液，然后向孔板中加入纤连蛋白（用PBS按1:250稀释，终浓度为4 μg/ml），将培养皿置于培养箱中孵育过夜。
- 吸除纤连蛋白 解剖当天用 PBS 清洗两次。将仍含有最后一次 PBS 清洗液的培养板放回培养箱 直到解离的组织准备好进行培养时，弃去PBS，再将组织接种。
- 将经多聚-L-鸟氨酸包被的培养板置于培养箱中，可保存长达3周。经纤维连接蛋白包被的培养板可保存长达1周。若急需使用，纤维连接蛋白包被可在2小时内完成。纤维连接蛋白易发生变性；避免震荡溶液，且勿使培养皿干燥。
2. 解剖/铺板
- 本方案适用于3只成年大鼠（3至6月龄）。
- 在处死大鼠前，将脑切片包埋模置于冰上冷却。
- 将15 含有添加了bFGF的5 ml N2培养基的冰上ml Falcon管。
- 根据所在机构的兽医政策对大鼠实施安乐死。
- 沿头部正中线切开，将脑组织从颅骨中取出。使用镊子剥离颅骨，小心取出脑组织。
- 将脑组织放入含有冰冻 PBS 的 10 cm 培养皿中。这将去除任何残留的毛发和血液。图1A)
- 将脑组织放入预冷的切片包埋块中。图1B)
- 如图所示，将一片新的洁净剃须刀片插入模块中 图1C.
- 在第一个切口后方3 mm处插入第二把干净的剃须刀片，如图所示 图1D.
- 小心地将刀片从包埋块上抬起，同时带起目标切片部分。
- 将切片浸入 PBS 中，使其从刀片上漂浮起来。图1E)
- 从目标区域采集组织（在本示例中，我们使用了前连合（前部）ACA） 图1F使用5号镊子夹取并收集到含有1 ml含bFGF的N2培养基的15 ml锥形管中。
- 将试管转移至超净工作台，在无菌条件下继续完成后续实验步骤。
- 使用连接在P1000移液器上的1 ml移液器吸头对组织进行机械解离。将移液器吸头开口抵住锥形管底部，反复吹打数次（约20次，每秒1个移液循环） (图示 1G 1-3当溶液变得均匀时，停止吹打。
- 让溶液静置 2 分钟，使任何较大的未解离组织沉降到管底。图1G 4)
- 收集均一的上清液，转移至含有8.5 ml N2培养基的锥形管中，培养基中添加20 ng/ml bFGF、500 ng/ml Dll4、500 ng/ml Ang2和200 nM JAK抑制剂。
- 将稀释后的细胞悬液按每孔3 ml接种至6孔板中的3个孔内。
- 将培养板放入37 °C、5% CO₂的加湿细胞培养箱中2，5% O₂2.
3. 日常护理
- 铺板后24小时，将培养皿中的培养基更换为含有bFGF、Ang2、Dll4和JAK抑制剂的N2培养基。
- 次日，一次性加入bFGF、Dll4、Ang2和JAK抑制剂。
- 持续进行这种交替更换培养基和添加因子的操作，共持续10-14天。
4. 诱导分化
- 吸出含 bFGF、Dll4、Ang2 和 JAK 抑制剂的培养基，替换为不含任何额外因子的 N2 培养基。
- 每隔两天更换一次培养基。
- 培养 10 天后固定细胞，并进行免疫细胞化学染色。
5. 免疫细胞化学检测
- 吸去培养基，加入 2 ml 4% 多聚甲醛固定细胞培养板，孵育 20 分钟。
- 用 3 ml PBS 洗涤 2 次，每次 5 分钟。
- 吸去 PBS，加入含 5% 正常驴血清（NDS）和 0.1% Triton X-100 的 PBS 溶液 2 ml，进行细胞通透和封闭，孵育 20 分钟。
- 在含 5% NDS 的 PBS 中配制一抗混合液。可使用抗 nestin 抗体鉴定 SCs，而 TuJ1（III 类 β-微管蛋白）、GFAP 和 CNPase 抗体可联合使用，进行分化标志物的三重染色。
- 吸去封闭液，每孔加入 1.5 ml 一抗混合液，室温孵育 90 分钟。
- 去除一抗，用 3 ml PBS 洗涤 2 次，再用含 5% NDS 的 PBS 洗涤 1 次，每次 5 分钟。
- 在含 5% NDS 的 PBS 中配制二抗溶液。
- 吸去最后一次洗涤液，每孔加入 1.5 ml 二抗溶液，室温避光孵育 40 分钟。
- 去除二抗溶液，每孔加入 2 ml 新鲜配制的 DAPI 染液（500 ng/ml 溶于 PBS），孵育 3 分钟。
- 吸去 DAPI 溶液，用 3 ml PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟 。此时可用荧光显微镜观察细胞。
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结果
确定用于获取神经干细胞的兴趣区域是关键的第一步，这将决定获得融合细胞层所需的时间。例如，侧脑室下区（SVZ）是一个经典的神经发生区域，因此含有相对更高比例的神经干细胞。然而，本文介绍的技术也可用于其他在成年期通常不被认为具有显著神经发生潜能的脑区。在本实验方案中，我们使用了前连合（前部）。尽管在接种后部分细胞和碎片会沉降，但由于 triturate 后存在大量细胞物质，培养基通常仍会保持浑浊状态。24小时后的首次换液将清除大部分残留物。即使在首次换液后，通过光学显微镜观察仍可见大量细胞物质以及血管残留。在接下来的数天内，一种形态独特的增殖性细胞群体将逐渐形成可见的克隆集落（图2A）。这些即为在含有bFGF、Ang2、Dll4和JAK抑制剂的N2培养基选择作用下得以生长的神经干细胞。此外，也可能存在一类更为细长的梭形细胞群体（图2B和图2C）。这些并非神经干细胞（根据形态学和染色特征判断，可能为放射状胶质细胞），它们最终将被增殖速度更快的神经干细胞群体所取代。在7至14天内，细胞密度逐渐增加，直至达到融合状态（图2D
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讨论
成功分离、扩增和分化成年脑源性神经干细胞的关键步骤大多与标准组织培养技术相通。需要牢记的目标是，从成年脑组织中分离获得的神经干细胞应尽可能保持其原有的 体内 尽可能多的特征（图2J。通常需要在必要的谨慎与适当的速度之间取得平衡。在从颅骨中分离脑组织时操作细致，将显著有助于目标区域的识别。在动物安乐死后尽快取出组织，并在收获和清洗过程中保持脑组织低温，可使其更加坚固，从而在将组织放入不锈钢切片模具时更易于操作。这也能最大程度地降低切片过程中组织撕裂的风险。此外，该方案的优势还在于能够快速将细胞处理至铺板阶段，从而在细胞接种后提高其存活率。 体外在切片前对组织进行适当的清洗也有助于减少培养物中污染的可能性。在解离过程中，使用1 ml移液器反复吹打 移液枪头吹打时应充分有力，但需避免产生过多气泡或细胞悬液起泡，以免对细胞存活造成不利影响。首次更换培养基尤为关键，可清除大部分未贴壁细胞以及组织解离过程中产生的细胞碎片，这些物质含有对干细胞群体初期存活有害的因子。为了改善免疫染色后的观察效果，可将 freshly isolated cells 接种于置于6孔...
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披露
我们没有需要披露的内容。
致谢
本工作部分由亥姆霍兹联盟ICEMED——环境代谢性疾病成像与治疗项目，通过亥姆霍兹协会的倡议与网络基金、Else Kroener-Fresenius基金会资助以及德国研究基金会（SFB 655：细胞形成组织）的资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔组织培养皿 | BD Biosciences | 353934 | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P-3655 | 用双蒸水配制浓度大于5 mg/ml的储存液（在-20 °C下可稳定保存数月）。 工作浓度为0.5 mg/ml的水溶液（在4 °C下可稳定保存1个月）。 |
| 纤连蛋白 | R&D Systems | 1030-Fn | 切勿震荡储存液 |
| 过滤装置 | Corning Life Sciences | 430769 | |
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | 详见下方注释以完成N2培养基的配制 |
| 脱铁转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-0516 | |
| 腐胺 | Sigma-Aldrich | P-5780 | 用ddH2O配制1 M储存液（在20 °C下可稳定保存6个月） |
| 亚硒酸钠 | Sigma-Aldrich | S-5261 | 用ddH2O配制500 µM储存液（在-20 °C下可稳定保存6个月） |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P-8783 | 用乙醇配制100 µM储存液（在-20°C下可稳定保存6个月） |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Mediatech | 21-040-CV | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | R&D Systems | 233-FB | 工作浓度为20 ng/ml |
| Delta4（Dll4） | R&D Systems | 1389-D4 | 工作浓度 为500 ng/ml |
| 血管生成素2（Ang2） | R&D Systems | 623-AN | 工作浓度 为500 ng/ml |
| JAK抑制剂 | Calbiochem | 420099 | 工作浓度为200 nM |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A-2058 | |
| 15 ml和50 ml锥形管 | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | |
| 其他必需物品包括：常规解剖器械（如剃刀刀片和镊子）、成年大鼠（3–6月龄；Sprague-Dawley或Long Evans品系）、CO2中毒室、用于细胞培养的层流罩及培养箱（湿度控制，37 °C，5% CO2，5% O2）。注：配制完整的N2培养基时，向一瓶DMEM/F-12（500 ml）中加入0.05 g脱铁转铁蛋白、0.0125 g胰岛素（用1 ml 10 mM NaOH新鲜预溶解）、50 μl腐胺储存液、30 μl亚硒酸钠储存液、100 μl孕酮储存液以及5 ml青霉素/链霉素溶液。 必要时调节pH至7.2。过滤除菌后于4 °C避光保存，最多可保存3周。 | |||
| 免疫荧光试剂表 | |||
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15719 | |
| 正常驴血清（NDS） | Sigma-Aldrich | D-9663 | |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma-Aldrich | D-8417 | 用甲醇配制5 mg/ml储存液 |
| 一抗抗体表 | |||
| Nestin | Chemicon | MAB353 | 稀释倍数：1:400 种属：小鼠IgG1 |
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 | 稀释倍数：1:100 种属：兔IgG |
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | 稀释倍数：1:100 种属：小鼠IgG2a |
| CNP酶 | Chemicon | MAB326 | 稀释倍数：1:200 种属：小鼠IgG1 |
| β-微管蛋白III（TUJ1） | R&D Systems | MAB1195 | 稀释倍数：1:500 种属：小鼠IgG2a |
| 胶质纤维酸性蛋白（GFAP） | Dako North America | Z0334 | 稀释倍数：1:500 种属：兔 |
| 二抗抗体表 | |||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 | 稀释倍数：1:200 种属：山羊抗小鼠IgG1 |
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 | 稀释倍数：1:200 种属：山羊抗小鼠IgG2a |
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 | 稀释倍数：1:200 种属：山羊抗兔 |
参考文献
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