从成年大脑中分离获取的神经干细胞正越来越多地应用于神经系统发育的基础研究，以及再生医学中潜在临床应用的探索。因此，严格控制这些细胞的分离和培养条件，对于获得可靠的实验结果至关重要。
从成年大脑中分离获取的神经干细胞正越来越多地应用于神经系统发育的基础研究，以及再生医学中潜在临床应用的探索。因此，严格控制这些细胞的分离和培养条件，对于获得可靠的实验结果至关重要。
近期研究表明，中枢神经系统（CNS）的再生与肿瘤发生均涉及存在于成年大脑中的干细胞（SCs）群体。然而，这些通常处于静息状态的细胞如何维持神经网络的正常功能，以及其在脑损伤修复和神经退行性过程缓解中的作用，目前仍知之甚少。这些细胞存在于被称为 "生态位" 为中枢神经系统干细胞提供由血管系统和免疫系统共同介导的调节信号所构成的维持性环境。在排除未知因素的明确培养条件下对中枢神经系统干细胞进行分离、维持和分化，使其能够接受药理学或遗传学手段的干预，从而有助于深入理解其生物学特性 体内 行为。本文提供了从成年大脑不同区域生成中枢神经系统干细胞（CNS SCs）培养物的详细方法，以及评估其向神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞分化潜能的技术方案。 体外该技术可获得均一的细胞群体，以单层培养形式呈现，便于观察单个施万细胞（SCs）及其子代细胞。此外，该方法可应用于不同的动物模型系统及临床样本，此前已被用于预测成年神经系统损伤后的再生反应。
一个多世纪前，拉蒙·卡哈尔（Ramón Y. Cajal）通过对脑细胞结构的基本观察，确立了神经生物学的中心教条，即鉴于中枢神经系统（CNS）中神经网络的复杂性，青春期后神经发生极不可能发生1。尽管20世纪60年代阿尔特曼（Altman）以及后来卡普兰（Kaplan）的研究表明，3H-胸腺嘧啶可出现在成熟神经元中，提示成年动物大脑特定区域确有新神经元生成，但该教条仍长期占据主导地位2,3。随后，诺特博姆（Nottebohm）关于鸣禽脑内神经元数量随季节变化的研究进一步积累了支持证据4。直到1999年，古尔德（Gould et al.）发表研究，证明大鼠在执行联想学习任务时海马区神经元生成增加，同时科纳克（Kornack）和拉基奇（Rakic）观察到成年恒河猴中持续存在神经发生，学界才开始承认大脑具有较低刚性、更高可塑性的概念5,6。
寻找这些de novo新生神经元的细胞来源，促使人们发现了一群定位于被称为“生态位”（niches）的脑区内的离散干细胞（SCs）群体7。脑室下区和海马体颗粒下区被认为是两个主要的神经发生区域8,9。从这些区域分离出的细胞表现出胚胎或胎儿来源干细胞的经典特征，即自我更新能力....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
本研究遵循《赫尔辛基宣言》和ARVO动物研究声明。实验动物用于组织采集，所有相关方法均按照德累斯顿大学动物实验中心的指导进行。动物的饲养和管理遵循德国联邦关于实验动物使用与护理的指导方针，研究方案经德累斯顿地方管理局（Landesdirektion Dresden）批准。有关适当的安乐死方法，请咨询您所在机构的兽医政策（如IACUC或其他伦理委员会）。
特定试剂的储存浓度和工作浓度可在本实验方案附带的试剂表中找到。
1. 培养皿准备
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
确定用于获取神经干细胞的兴趣区域是关键的第一步，这将决定获得融合细胞层所需的时间。例如，侧脑室下区（SVZ）是一个经典的神经发生区域，因此含有相对更高比例的神经干细胞。然而，本文介绍的技术也可用于其他在成年期通常不被认为具有显著神经发生潜能的脑区。在本实验方案中，我们使用了前连合（前部）。尽管在接种后部分细胞和碎片会沉降，但由于 triturate 后存在大量细胞物质，培养基通常仍会保持浑浊状态。24小时后的首次换液将清除大部分残留物。即使在首次换液后，通过光学显微镜观察仍可见大量细胞物质以及血管残留。在接下来的数天内，一种形态独特的增殖性细胞群体将逐渐形成可见的克隆集落（图2A）。这些即为在含有bFGF、Ang2、Dll4和JAK抑制剂的N2培养基选择作用下得以生长的神经干细胞。此外，也可能存在一类更为细长的梭形细胞群体（图2B和图2C）。这些并非神经干细胞（根据形态学和染色特征判断，可能为放射状胶质细胞），它们最终将被增殖速度更快的神经干细胞群体所取代。在7至14天内，细胞密度逐渐增加，直至达到融合状态（图2D
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
成功分离、扩增和分化成年脑源性神经干细胞的关键步骤大多与标准组织培养技术相通。需要牢记的目标是，从成年脑组织中分离获得的神经干细胞应尽可能保持其原有的 体内 尽可能多的特征（图2J。通常需要在必要的谨慎与适当的速度之间取得平衡。在从颅骨中分离脑组织时操作细致，将显著有助于目标区域的识别。在动物安乐死后尽快取出组织，并在收获和清洗过程中保持脑组织低温，可使其更加坚固，从而在将组织放入不锈钢切片模具时更易于操作。这也能最大程度地降低切片过程中组织撕裂的风险。此外，该方案的优势还在于能够快速将细胞处理至铺板阶段，从而在细胞接种后提高其存活率。 体外在切片前对组织进行适当的清洗也有助于减少培养物中污染的可能性。在解离过程中，使用1 ml移液器反复吹打 移液枪头吹打时应充分有力，但需避免产生过多气泡或细胞悬液起泡，以免对细胞存活造成不利影响。首次更换培养基尤为关键，可清除大部分未贴壁细胞以及组织解离过程中产生的细胞碎片，这些物质含有对干细胞群体初期存活有害的因子。为了改善免疫染色后的观察效果，可将 freshly isolated cells 接种于置于6孔.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
我们没有需要披露的内容。
本工作部分由亥姆霍兹联盟ICEMED——环境代谢性疾病成像与治疗项目，通过亥姆霍兹协会的倡议与网络基金、Else Kroener-Fresenius基金会资助以及德国研究基金会（SFB 655：细胞形成组织）的资助支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 6孔组织培养皿 | BD Biosciences | 353934 | |
| 多聚-L-鸟氨酸 | Sigma-Aldrich | P-3655 | 用双蒸水配制浓度大于5 mg/ml的储存液（在-20 °C下可稳定保存数月）。 工作浓度为0.5 mg/ml的水溶液（在4 °C下可稳定保存1个月）。 |
| 纤连蛋白 | R&D Systems | 1030-Fn | 切勿震荡储存液 |
| 过滤装置 | Corning Life Sciences | 430769 | |
| DMEM/F-12 | Mediatech | 10-090-CV | 详见下方注释以完成N2培养基的配制 |
| 脱铁转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I-0516 | |
| 腐胺 | Sigma-Aldrich | P-5780 | 用ddH2O配制1 M储存液（在20 °C下可稳定保存6个月） |
| 亚硒酸钠 | Sigma-Aldrich | S-5261 | 用ddH2O配制500 µM储存液（在-20 °C下可稳定保存6个月） |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P-8783 | 用乙醇配制100 µM储存液（在-20°C下可稳定保存6个月） |
| 青霉素/链霉素 | Invitrogen | 15140-122 | |
| 磷酸盐缓冲液 | Mediatech | 21-040-CV | |
| 碱性成纤维细胞生长因子（bFGF） | R&D Systems | 233-FB | 工作浓度为20 ng/ml |
| Delta4（Dll4） | R&D Systems | 1389-D4 | 工作浓度 为500 ng/ml |
| 血管生成素2（Ang2） | R&D Systems | 623-AN | 工作浓度 为500 ng/ml |
| JAK抑制剂 | Calbiochem | 420099 | 工作浓度为200 nM |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A-2058 | |
| 15 ml和50 ml锥形管 | Corning Life Sciences | 430053, 430829 | |
| 其他必需物品包括：常规解剖器械（如剃刀刀片和镊子）、成年大鼠（3–6月龄；Sprague-Dawley或Long Evans品系）、CO2中毒室、用于细胞培养的层流罩及培养箱（湿度控制，37 °C，5% CO2，5% O2）。注：配制完整的N2培养基时，向一瓶DMEM/F-12（500 ml）中加入0.05 g脱铁转铁蛋白、0.0125 g胰岛素（用1 ml 10 mM NaOH新鲜预溶解）、50 μl腐胺储存液、30 μl亚硒酸钠储存液、100 μl孕酮储存液以及5 ml青霉素/链霉素溶液。 必要时调节pH至7.2。过滤除菌后于4 °C避光保存，最多可保存3周。 | |||
| 免疫荧光试剂表 | |||
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | 15719 | |
| 正常驴血清（NDS） | Sigma-Aldrich | D-9663 | |
| 吐温X-100 | Sigma-Aldrich | T-8787 | |
| 4,6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Sigma-Aldrich | D-8417 | 用甲醇配制5 mg/ml储存液 |
| 一抗抗体表 | |||
| Nestin | Chemicon | MAB353 | 稀释倍数：1:400 种属：小鼠IgG1 |
| Hes3 | Santa Cruz | sc-25393 | 稀释倍数：1:100 种属：兔IgG |
| Sox2 | R&D Systems | MAB2018 | 稀释倍数：1:100 种属：小鼠IgG2a |
| CNP酶 | Chemicon | MAB326 | 稀释倍数：1:200 种属：小鼠IgG1 |
| β-微管蛋白III（TUJ1） | R&D Systems | MAB1195 | 稀释倍数：1:500 种属：小鼠IgG2a |
| 胶质纤维酸性蛋白（GFAP） | Dako North America | Z0334 | 稀释倍数：1:500 种属：兔 |
| 二抗抗体表 | |||
| Alexa 568 | Invitrogen | A-21124 | 稀释倍数：1:200 种属：山羊抗小鼠IgG1 |
| Alexa 488 | Invitrogen | A-21131 | 稀释倍数：1:200 种属：山羊抗小鼠IgG2a |
| Cy5 | Jackson ImmunoResearch | 59883 | 稀释倍数：1:200 种属：山羊抗兔 |
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表
申请许可