神经母细胞迁移是出生后神经发生过程中的基本事件。我们描述了一种通过高效标记神经母细胞的方案 体内 出生后电穿孔及通过急性脑切片的时间推移成像对其迁移过程进行可视化观察。我们还提供了通过视频追踪进行神经母细胞动力学定量分析的方法描述。
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方法文章
体内 新生期电穿孔与小鼠急性脑切片中神经母细胞迁移的实时成像
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
脑室下区（SVZ）是出生后大脑中主要的神经发生微环境之一。在此区域，神经前体细胞增殖并产生神经母细胞，这些神经母细胞能够沿吻侧迁移流（RMS）向嗅球（OB）迁移。这种长距离迁移对于新生神经元在嗅球内的后续成熟至关重要，但调控该过程的分子机制仍不明确。研究调控神经母细胞迁移能力的信号通路，不仅有助于理解神经发生的 fundamental 步骤，还可能具有治疗性再生潜力，因为这些神经母细胞能够靶向损伤、中风或退行性病变所影响的脑区。
在本文中，我们描述了一种详细的实验方案 体内 出生后电穿孔及小鼠RMS中神经母细胞迁移的连续时间成像。出生后电穿孔可高效转染侧脑室下区（SVZ）前体细胞，这些细胞继而产生沿RMS迁移的神经母细胞。利用共聚焦转盘显微镜对急性脑片培养物进行连续时间成像，可在高度接近体内生理环境的条件下监测神经母细胞的迁移过程 体内 条件。此外，可对神经母细胞的运动性进行追踪和定量分析。例如，我们描述了如何使用 体内 通过在出生后对表达GFP的质粒进行电穿孔，以标记并可视化沿RMS迁移的成神经细胞。在利用LoxP系统的条件性基因敲除小鼠中，电穿孔导入表达shRNA或CRE重组酶的质粒也可用于靶向目的基因。此外，可通过药物学手段干预急性脑切片培养，以研究不同信号分子在成神经细胞迁移中的作用。通过结合 体内 通过延时成像结合电穿孔技术，我们希望阐明调控神经母细胞迁移的分子机制，并为促进脑修复的新方法开发提供贡献。
引言
在哺乳动物大脑中，新生神经元的产生（神经发生）主要在出生后两个区域进行，即侧脑室的室下区（SVZ）和海马齿状回的颗粒下区1。近年来积累的大量证据表明，出生后神经发生在海马和嗅球的记忆功能中具有关键作用1-3。尤为重要的是，由于出生后神经发生与退行性神经系统疾病密切相关，且神经母细胞具有向脑损伤部位迁移的能力，因此在治疗方面具有潜在应用价值4-6。
室下区（SVZ）最近被确认为一个关键的神经发生微环境。SVZ来源的成神经细胞通过吻侧迁移流（RMS）迁移到嗅球（OB），这是出生后大脑中最长的迁移过程1,7,8。哺乳动物的SVZ/RMS/OB系统已成为研究神经发生不同阶段（如增殖、迁移和分化）的有用模型1,8。许多生长因子和细胞外信号调控SVZ的神经发生及沿RMS的细胞迁移，但其细胞内分子机制仍远未完全阐明1,9。沿RMS的正常迁移对新生神经元的后续成熟至关重要10。此外，一些研究表明，SVZ来源的成神经细胞可从RMS迁出，到达脑损伤部位4-6,11-13。因此，研究调控成神经细胞迁移的信号机制，不仅对理解神经发生具有重要意义，也为潜在的治疗应用奠定了基础。
在此，我们描述了一种通过标记SVZ神经前体细胞的详细方案 体内 出生后电穿孔并....
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方案
本实验程序遵循英国国内事务部法规（《动物科学实验法案》1986年）。科研人员应遵守其所在机构及国家动物管理机构制定并批准的指导原则。
1. 出生后电穿孔
1.1. 玻璃毛细管、DNA 溶液和电穿孔仪的准备
- 准备用于 DNA 注射的拉制玻璃毛细管（外径：1.5 mm，内径：0.86 mm）。（Sutter P-97 毛细管拉制仪的参考设置为：加热温度 283；拉力 50；速度 90；时间 50）。在毛细管上标记出对应体积约为 2 µl 的位置。
- 将电穿孔仪的电压设置为 5 次方波脉冲，每次脉冲持续 50 毫秒，电压 100 V，脉冲间隔 850 毫秒（100 V，脉冲开启 50 毫秒，关闭 850 毫秒，共 5 次脉冲）。
- 使用无内毒素的 Tris-EDTA 缓冲液或 PBS 将高纯度（OD 260/280 > 1.80）、无内毒素的质粒 DNA 稀释至终浓度为 1–2 µg/µl。建议在 DNA 溶液中加入 0.1% 快绿染料（成功注射后，染料应在脑室中扩散）。
- 准备 5–7 mm 的电极、电极凝胶，并预热加热板。
1.2. 电穿孔
- 从笼中取出一只出生后第2天的小鼠幼崽，通过吸入异氟烷（流量约为0.6 L/min）进行麻醉。
- ....
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结果
在成功电穿孔后通常4-8天，可沿嗅鞘通路（RMS）观察到SVZ来源的迁移性成神经细胞的标记（图1B）。也可选择更长的时间点，但由于大多数细胞已进入嗅球（OB），RMS中可观察到的细胞数量会减少。成神经细胞在电穿孔后约2-3周开始在嗅球中获得成熟颗粒细胞的典型形态和特征（未显示）。电穿孔后的小鼠幼崽脑切片在培养约1小时后，可稳定成像长达3-4小时。如先前报道23,26，成神经细胞可表现出复杂的迁移动力学行为（图3 和 视频1），可通过细胞追踪进行定量分析（图4）。
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讨论
神经前体细胞沿吻侧迁移流的高效迁移可确保其后续成熟为功能性神经元10。在人类婴儿期，可观察到大量朝向嗅球的神经前体细胞迁移流，这些细胞可能在人类出生后的早期脑发育中发挥重要作用27。此外，这些细胞能够靶向脑内受损及发生神经退行性变的区域4,28。因此，实时监测基因操作对成神经细胞动态的影响，对于全面理解成神经细胞迁移的引导与调控机制至关重要。
本文介绍了一种通过将体内出生后电穿孔技术与急性脑切片培养的延时共聚焦转盘显微镜成像相结合，以监测SVZ来源的成神经细胞迁移的实验方案。具体而言，我们展示了如何通过在SVZ区域电穿孔导入编码GFP的质粒，对迁移中的神经前体细胞进行标记。根据研究目的的不同，可使用多种类型的质粒（例如，表达其他荧光蛋白，或与感兴趣的野生型/突变型蛋白、CRE重组酶或shRNA共同表达的质粒）。我们强烈推荐使用含有鸡β-肌动蛋白CAG启动子29的质粒用于体内表达。对电穿孔动物获取的脑切片进行成像，还可用于在电穿孔后较长时间点（.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
M.S. 和 Y.Z. 获得伦敦国王学院（KCL）及 KCL-中国博士生奖学金的支持。M.O. 获得英国生物技术和生物科学研究生理事会博士生奖学金的资助。我们感谢 Masaru Okabe 和 Jun-ichi Miyazaki 提供 pCX-EGFP 质粒，以及 Alain Chedotal 和 Athena Ypsilanti 在电穿孔实验方面提供的宝贵建议。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Millipore 细胞培养插件 | Millipore | PICM0RG50 | |
| 35 mm 玻底培养皿 | MatTek | P35G-0-14-C | |
| Gey's 平衡培养基 | Sigma | G9779-500ML | |
| 葡萄糖，45% | Sigma | G8769-100ML | |
| HEPES | Sigma | H3375-25G | |
| 青霉素-链霉素溶液（Pen/Strep） | GIBCO | 15140-122 | |
| 胎牛血清（FCS） | GIBCO | 10109-163 | |
| B27 添加剂 | Invitrogen Life Technologies | 17504044 | |
| L-谷氨酰胺（L-Glutamine） | Invitrogen Life Technologies | 25030-081 | |
| DMEM（无酚红） | GIBCO | 31053-028 | |
| 快绿染料（Fast Green） | Sigma | F7252-5G | |
| 注射用玻璃毛细管 | Harvard Apparatus | 30-0057 | |
| 吸液管 | Sigma | A5177 | |
| Sutter P-97 毛细管拉制仪 | Sutter Instrument | P-97 | |
| ECM830 方波电穿孔仪 | Harvard Apparatus | 45-0052 | |
| 7 mm 铂金镊式电极（Platinum Tweezertrodes） | Harvard Apparatus | 45-0488 | |
| 脚踏开关 Model 1250F | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| 电极导电凝胶 | Cefar Compex | 6602048 | |
| 异氟烷（Isoflurane） | Merial | AP/DRUGS/220/96 | |
| 振动切片机（Vibratome） | Leica | VT1000S | |
| 胶水 | Roti coll | Roti coll 1 | |
| UltraViEW VoX 转盘共聚焦显微系统 | Perkin Elmer | 定制系统（可使用多激光光源），配备 Hamamatsu ORCA R2 C10600-10B CCD 相机 | |
| Volocity 软件 | Perkin Elmer | 图像采集、定量与可视化模块 | |
| 显微镜用环境培养室 | Solent Scientific | 定制 | |
| Ti-E 倒置显微镜 | Nikon | 建议使用 CFI Super Plan Fluor ELWD 20X/0.45 NA 物镜，适用于本文所述应用 |
参考文献
- Ming, G. L., Song, H. Adult neurogenesis in the mammalian brain: significant answers and significant questions. Neuron. 70, 687-702 (2011).
- Deng, W., Aimone, J. B., Gage, F. H. New neurons and new memories: how does adult hippocampal neurogenesis affect ....
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重印与许可
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