A型肉毒神经毒素轻链（BoNT/A LC）是一种金属蛋白酶，可进入运动神经元，切割其底物SNAP-25，破坏神经递质传递，从而导致弛缓性麻痹。利用与高通量筛选兼容的基于荧光共振能量转移（FRET）的检测方法，可对大量小分子化合物库进行筛选，评估其对BoNT/A LC酶活性的影响。
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摘要
摘要
肉毒神经毒素（BoNT）是一种强效且可能致命的细菌毒素，可结合宿主运动神经元，被细胞内化，并切割细胞内对神经递质释放至关重要的蛋白质。BoNT由一条重链（HC）和一条轻链（LC）组成：重链介导宿主细胞的结合与内化，轻链则切割细胞内对乙酰胆碱释放至关重要的宿主蛋白。尽管抑制毒素结合或内化的疗法给药时间窗较窄，但靶向细胞内LC活性的化合物具有更宽的给药时间窗，这一点尤其重要，因为该毒素的半衰期极长。近年来，小分子因其相对于大分子治疗剂（如肽类、适配体、 等等。）。先导化合物的鉴定通常涉及高通量筛选（HTS），即基于大量小分子化合物库对治疗靶点功能的调节能力进行筛选。本文描述了一种基于FRET的检测方法，该方法采用商业化的BoNT/A轻链（LC）底物和重组LC蛋白，可实现对潜在BoNT抑制剂的高通量筛选自动化。此外，我们还介绍了一种手动操作的技术，可用于后续的二次筛选，或用于比较多个候选化合物的抑制效力。
引言
肉毒杆菌神经毒素A型（BoNT/A）是目前已知最强的毒素（LD50 ~1 ng/kg）1，由细菌Clostridium botulinum产生，是一种强效神经毒素。在受感染的宿主体内，BoNT/A通过结合运动神经元、内化进入细胞质，并最终切割对乙酰胆碱胞吐作用至关重要的神经元蛋白，从而破坏神经肌肉接头处的神经传导。一旦进入神经元，BoNT/A可在体内持续数月之久2。乙酰胆碱释放的长期抑制会阻碍正常的肌肉收缩，导致弛缓性麻痹，在严重情况下，可能引发心脏和/或呼吸衰竭。由于其极高的毒性、易于生产以及在宿主体内的长期作用，美国疾病控制与预防中心（CDC）已将所有BoNT血清型列为高风险生物恐怖主义制剂。
该毒素的作用机制涉及多个步骤，包括与神经元表面受体结合、通过受体介导的内吞作用进入细胞，以及转位至神经元胞质溶胶。BoNT/A 由两条链组成，即重链和轻链，两条链均对毒性至关重要。重链（HC）包含结合域和转位域，而轻链（LC）是一种依赖锌的金属蛋白酶，可从内体转位至细胞质。一旦进入胞质溶胶，LC/A 金属蛋白酶会定位于内侧胞质膜，并切割膜结合的宿主蛋白 SNAP-25。SNAP-25 属于 SNARE（可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）蛋白家族，该家族在乙酰胆碱外排过程中发挥关键作用（参见参考文献3）。LC/A 对 SNAP-25 的切割会损害 SNARE 复合物的功能，从而抑制乙酰胆碱神经递质的释放，并阻碍肌肉收缩。
目前，肉毒中毒的治疗手段有限，通常包括给予马源中和抗体4；然而，由于该毒素会迅速被神经元内化，抗体的给药时间窗口非常狭窄。因此，许多研究人员认为，BoNT/A 轻链（LC）可能是更理想的治疗靶点。由于 LC 是一种依赖锌离子的金属蛋白酶，抑制 LC/A 活性的一种策略是开发能够螯合活性位点锌离子的化合物。例如，羟肟酸类化合物可螯合活性位点的锌离子，并表现出优异的抑制效果 体外 效价（Ki 迄今为止最好的BoNT/A LC小分子抑制剂的IC50为77 nM5然而，许多小分子由于各种问题而未能推进成为治疗药物 离体 或 体内，包括水溶性差、代谢迅速和/或细胞毒性高。因此，需要开发具有更优药理学和药代动力学特性的新化合物。小分子化合物的筛选通常涉及高通量筛选（HTS），以鉴定新颖的骨架结构。早期针对BoNT/A LC活性的筛选方法基于高效液相色谱法（HPLC）检测短肽底物的切割，该方法耗时较长，且不适用于高通量筛选应用6-8随后，Schmidt 及其同事9 开发了一种高通量的BoNT/A LC活性检测方法，该方法利用共价连接到微孔板上的荧光素标记肽底物。BoNT/A LC可切割该底物并释放荧光素，释放的荧光素可通过荧光计进行定量。该检测方法的微孔板形式可实现对大量化合物的同步筛选；然而，该方法需要对合成肽进行荧光素标记，并将衍生化的底物分子包被至检测板上，这些步骤较为繁琐。随后，Schmidt报道了一种更为简便的方法，可用于在低浓度下检测BoNT/A LC的活性 等，其中使用一系列荧光底物实时监测 BoNT LC 活性10文献中描述的其他技术包括基于共振能量转移的去极化检测法，用于检测和定量粗提物中肉毒神经毒素（BoNT）的活性；该方法适用于高通量应用。10,11，尽管该方法需要复杂的设备来检测荧光共振能量转移（FRET）和偏振信号。最后，已有多种基于细胞的肉毒神经毒素（BoNT）中毒模型被报道（详见参考文献）11）使研究人员能够研究前述化合物常具有的限制性特性，包括细胞毒性、细胞通透性和稳定性。然而，大多数现有的基于细胞的检测方法并不适用于高通量筛选（HTS），且耗时耗力。
本文介绍了一种高通量筛选（HTS）方法的详细实验方案，该方法利用 commercially available 的基于荧光共振能量转移（FRET）的肉毒神经毒素A型轻链（BoNT/A LC）底物。该底物基于SNAP-25的切割序列，是一种合成的13聚肽，其末端带有荧光团和淬灭基团。BoNT/A对底物的切割会使荧光团与淬灭基团分离，从而消除FRET效应，并导致检测到的荧光信号增强，该信号可在荧光酶标仪中持续测定。本实验方法已被我们实验室及其他多个实验室常规用于发现新型BoNT/A LC抑制剂，或评估已知化合物的相对抑制活性5,12-15。由于该方法操作简便、易于自动化、试剂成本低，并可同时筛选大量化合物，因此适用于高通量筛选（参见参考文献16；Caglič et al.，已投稿；Bompiani et al.，正在准备中）。除用于高通量筛选外，本实验还可通过测定化合物的IC50值（即抑制50% BoNT/A LC活性所需的浓度）来比较不同化合物的相对活性。该实验既可在96孔板中手动操作（见《实验方案》中的“手动筛选”部分），也可在384孔板中实现自动化操作以进行高通量筛选（见《实验方案》中的“自动化操作”部分）。
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方案
手动筛选或 IC50 测定
本方案可用于通过配制化合物的系列稀释液来测定其相对效价（IC50值），或在单一浓度下手动筛选小分子抑制剂。
1. 缓冲液与试剂的配制 以及所需仪器设备
- 配制50 ml 检测缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.4，含0.01% Tween-20），过滤除菌。该缓冲液可在室温（RT）下保存数月。
- 用检测缓冲液配制70 nM的工作浓度重组肉毒杆菌神经毒素/A轻链（LC/A (1-425)）17溶液，轻轻涡旋混匀后置于冰上保存。每种化合物的测试至少需要120 μl的LC/A工作液。
- 在检测缓冲液中配制含10% DMSO的7 μM基于FRET的BoNT/A LC底物工作液。先将底物的5 mM储备液用适量100% DMSO稀释，然后在轻柔搅拌下缓慢（逐滴）加入检测缓冲液。用铝箔包裹后置于冰上保存。每种化合物的测试至少需要130 μl的底物工作液。
- 将荧光酶标仪设置为在室温下以中等速度振板10秒，随后每隔5分钟监测一次荧光信号（动力学模式），激发波长和发射波长分别为490 nm和523 nm，持续90分钟。请注意，在此期间产物生成（即 荧光信号的增加）呈线性关系（图1A）。
2. 化合物稀释系列的制备
- 确定化合物浓度范围（即 稀释系列中的稀释次数和稀释倍数；浓度范围根据预期的IC50 值，以确保获得最佳的曲线拟合。对于抑制浓度未知的化合物50使用未稀释的化合物原液作为最高浓度。
- 用相应的化合物名称和浓度标记试管。
- 将100% DMSO分装至所有试管中，以备进行化合物系列稀释。每管至少2 μl 建议的终末稀释体积为每孔加入1 μl各浓度样品。例如，标准1:3稀释系列需在每管中加入2 μl化合物与4 μl DMSO混合。
- 配制化合物的系列稀释液，每次稀释之间需充分涡旋或手动混匀，并在每次稀释时更换移液器吸头。对于标准的1:3稀释系列，取2 μl未稀释的化合物加入至稀释系列第一管中含4 μl DMSO的溶液，充分混匀。使用新的移液器吸头，吸取2 μl第一稀释液加入至第二管含4 μl DMSO的溶液中，充分混匀。重复上述步骤完成后续各稀释液的配制。务必充分混匀各化合物稀释液，以确保化合物浓度准确。
- 盖上化合物管，室温放置。
3. 培养板制备与点样（表1）
- 取一个平底、不透明的黑色96孔板。参见表1中推荐的板式设置，其中每种化合物的稀释系列在96孔板中按行排列。手动将相应化合物稀释液各1 μl直接加入对应孔的底部（第1–9孔）。将待测化合物的最高浓度溶液1 μl加入第11孔（化合物本底荧光对照）。
- 手动向第12孔加入1 μl已知的强效抑制剂（阳性对照），向第10孔加入1 μl 100% DMSO（阴性对照）。
- 使用自动移液器，向第1–10孔和第12孔（化合物稀释孔和阳性对照孔）的孔壁侧面各加入79 μl检测缓冲液，向第11孔（化合物本底荧光对照孔）的孔壁侧面加入89 μl。注意不要让吸头接触孔底已加有化合物的位置 ，以免造成孔间交叉污染。
- 涡旋混匀LC/A工作稀释液，使用自动移液器向除第11孔（化合物本底荧光对照孔）外的每个孔的孔壁侧面加入10 μl。轻轻敲击板子，确保所有加入的酶液均流至孔底。
- 轻轻 混匀，盖上盖板， 室温孵育5分钟。此孵育步骤可使化合物在加入底物前与LC/A充分结合，达到预平衡状态。
4. 底物添加与荧光检测
- 轻轻涡旋混匀 BoNT/A LC 底物，使用自动移液器将 10 μl 底物加入每个孔的另一侧。注意将底物加至之前加入酶的孔壁对侧。
- 轻敲酶标板以混匀试剂，立即放入酶标仪中，并按照步骤 1.4 中先前设定的参数开始荧光检测。
- 酶反应速率通过绘制反应线性期内相对荧光单位（RFU）随时间变化曲线的斜率计算得出。
表1. 推荐的检测板布局。
| 孔号 | 孔描述 | 化合物 | 检测缓冲液 | 底物 | LC | DMSO |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 1 | 化合物剂量 1 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 2 | 化合物剂量 2 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 3 | 化合物剂量 3 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 4 | 化合物剂量 4 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 5 | 化合物剂量 5 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 6 | 化合物剂量 6 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 7 | 化合物剂量 7 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 8 | 化合物剂量 8 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 9 | 化合物剂量 9 | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
| 10 | 阴性对照 （100% LC 活性） | --- | 79 μl | 10 μl | 10 μl | 1 μl |
| 11 | 化合物自身荧光对照 | 1 μl | 89 μl | 10 μl | --- | --- |
| 12 | 阳性对照 （0% LC 活性） | 1 μl | 79 μl | 10 μl | 10 μl | --- |
高通量筛选的自动化操作
5. 缓冲液、试剂、化合物板、条形码及所需仪器的准备
- 将密封的化合物储备板在室温下解冻至少 1 小时。
- 配制 500 ml（或根据待筛选化合物数量配制更多）检测缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.4，含 0.01% Tween-20），过滤除菌。过滤后的检测缓冲液可在室温下保存数月。
- 用检测缓冲液配制 8.75 nM 的重组 BoNT/A LC（1-425）工作稀释液，涡旋混匀后置于冰上保存。每块低容量 384 孔板的每个孔需要 8 μl。每块低容量 384 孔板需额外准备 10–15% 的量，约 3.7 ml。
- 用含 10% DMSO 的检测缓冲液配制 3.5 μM 的基于 FRET 的 BoNT/A LC 底物工作稀释液。首先将底物的 5 mM 储备液直接溶于适量 100% DMSO 中，然后在轻柔搅拌下缓慢（逐滴）加入检测缓冲液。用铝箔包裹后置于冰上保存。每块低容量 384 孔板的每个孔需要 2 μl。每块低容量 384 孔板需额外准备 10–15% 的量，约 1 ml。
- 为每块黑色低容量 384 孔微孔板（检测板）准备条形码，并将标签直接粘贴在条形码扫描仪可读取的板侧；确保标签不 超出板边缘，以免影响自动化操作中的板处理和堆叠。将微孔板按编号顺序堆叠并放置一旁，顶部微孔板需加盖保护。请注意，此步骤为可选，但在使用多块板时有助于将检测结果与相应化合物对应。
- 将已解冻的密封化合物储备板在室温下以 200 × g 离心 30 秒。小心移除密封膜，确保清除所有残留胶粘物，并用干净的塑料盖盖住微孔板以防止蒸发。请注意，若板表面残留胶粘物，可能干扰自动化移盖和板堆叠操作。将盖好的微孔板放入连接至液体处理系统的孵育位中。切勿使微孔板长时间暴露，以免发生蒸发。
- 设置堆叠式荧光微孔板读板仪，在室温下以每 30 分钟一次的频率（动力学模式）连续读取每块检测板的荧光信号，激发波长为 490 nm，发射波长为 523 nm，共读取 3–6 个循环。
6. 针具的制备
- 目视检查384头针工具是否存在任何异常，包括变形、开裂或大块残留物。
- 准备三个独立的托盘，分别加入约1英寸深的100%甲醇（HPLC级）、100%异丙醇（HPLC级）以及用超纯水稀释的针具清洗液。
- 将液体处理设备上的清洗站加入100% DMSO。
- 在托盘中叠放2至3张洁净、全新的吸水纸。重要的是要在Z轴方向校准机器人，使针头能够接触到吸水纸但不刺穿。
- 在工作区域安装风扇附件，用于清洗后干燥针头。
- 将针具安装至液体处理设备的机械臂上，并通过以下步骤进行预清洗：浸入DMSO中，于吸水纸上干燥，再在清洗液中浸泡2分钟 ，于吸水纸上干燥，浸入异丙醇中，于吸水纸上干燥，浸入甲醇中，于吸水纸上干燥，最后通过风扇吹干。
7. 低体积液体分配器的制备
- 将低体积（1-10 μl）加样盒连接至液体分配仪，并将废液管连接至适当的废液容器。
- 目视检查加样盒的分配喷嘴，确认其无变形、撕裂或堵塞。保持通道和喷嘴清洁至关重要，因为沉淀物或碎屑会影响液体分配。
- 通过向废液容器中依次加入30 ml超纯水、30 ml 70%乙醇，再加入30 ml超纯水，对通道进行预冲洗。
- 将低体积384孔检测板放入液体分配仪中，并向每孔加入已知体积的水。目视检查以确保每孔均接收到正确体积的液体，且孔间无液体溢出或错加现象。
- 用空气对管路吹扫约5秒，以去除残留水分并干燥通道。
8. 将BoNT/A轻链分配至检测板
- 将液体分配器的吸液管浸入BoNT/A LC工作溶液中，进行引液以排除空气，然后向384孔低体积检测板的每孔中分配8 μl。注意：可手动将板放置在液体处理系统的操作区域，也可使用连接的板架实现自动定位和重叠堆叠。
- 用干净的塑料盖盖好每块板，并将其堆叠在连接于液体处理系统上的板架的不同列中。切勿使板未密封放置，否则会导致蒸发。
- 通过将30 ml 超纯水、30 ml 70%乙醇以及再次30 ml 超纯水直接排入废液容器，清洗液体分配器。
- 用空气对管路进行约5秒的引液，以干燥通道。
9. 将化合物 Stamp 至检测板
- 在液体处理平台指定区域放置化合物板、检测板以及盛有清洗液的容器。
- 编程液体处理设备，将化合物板和检测板放置于指定位置，并在点样前移除板盖。
- 将50 nl 化合物直接点样至含有8 μl BoNT/A LC的检测板中。校准点样程序时，确保点样针浸入液体，但不刮擦检测板底部。需注意，以100% DMSO加入化合物可能会在扩散过程中形成局部酶变性区域。因此，应通过比较仅含DMSO的对照组与未处理对照组（i.e. 未添加DMSO的酶）来评估酶变性程度。
- 每处理一块板后，依次将点样针浸入DMSO、在吸水纸上干燥、浸入异丙醇、在吸水纸上干燥、浸入甲醇、在吸水纸上再次干燥，最后通过风扇吹干。
- 化合物点样至含酶的检测板后，分别叠放母液化合物板和检测板。用盖子覆盖堆叠的最上层检测板以防止蒸发，并置于一旁。确保LC与化合物在室温下孵育至少5分钟；若需处理大量板，可适当延长孵育时间。
10. 将底物加入检测板
- 将液体处理仪的进液管浸入肉毒杆菌神经毒素A型轻链（BoNT/A LC）底物工作液中，并避光保存。检查分配喷嘴，确保其干燥且无堵塞。对通道进行预冲洗，以去除所有气泡。
- 将检测板拆开，向每孔中加入2 μl底物工作稀释液。检查底物是否准确分配至各孔中。加样后将检测板叠放，并在最上层检测板上方和最下层检测板下方各放置一个空的检测板，以防止在酶标仪读数及重新堆叠过程中发生蒸发。
11. 荧光测量
- 立即将检测板堆叠放入荧光酶标仪中。
- 按照步骤5.7中预先设定的参数开始荧光测定。每种化合物的检测速率由以下图形计算得出： 随时间变化的相对荧光单位（RFU）。需要注意的是，应包含阴性对照（DMSO）以获得未受抑制的反应速率；也可在每块板中加入已知抑制剂作为阳性对照。下图显示的是单个时间点的代表性结果。 图2.
12. 清理工作
- 使用压辊将每块化合物储备板用铝箔密封，并在 -80 °C 下保存。
- 每次检测板读数完成后，将检测板以及任何剩余的LC/A或底物稀释液作为生物危害废物丢弃。
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结果
基于FRET的BoNT/A轻链（LC）检测可手动以低通量方式进行，用于表征已知抑制剂或筛选小型化合物库；或者，该方案也可缩小规模并实现自动化，以便利用大型化合物库进行高通量筛选（HTS），旨在发现新的BoNT/A LC抑制剂。无论采用何种方法，当BoNT/A LC与底物共同孵育时，随时间推移应观察到荧光信号的增加（图1A展示了荧光随时间变化的代表性曲线）。若对化合物进行系列稀释测试，则通常会得到一系列斜率不同的曲线（图1B）。本实验板布局中的第10孔作为阴性对照，仅加入溶剂（DMSO）；该反应速率被定义为“100%酶活性”（即未抑制活性），其他含化合物孔的反应速率可据此进行归一化处理，以获得相对速率或抑制百分比。第11孔（化合物自身荧光对照）和第12孔（阳性对照）应呈现水平曲线（即斜率接近于0）。
当使用化合物的系列稀释液进行测定时，可通过绘制反应速率（测定斜率）与抑制剂浓度的关系图来确定IC50 (图1C）。稀释范围应选择得当，以使曲线呈现...
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讨论
本文所述基于FRET的BoNT/A轻链（LC）检测方法是一种用于发现和表征可调节BoNT/A LC活性小分子的优良手段。该检测方法基于溶液体系，因此适用于本实验方案“自动化操作”部分所述的高通量筛选（HTS）。Z因子常用于评估一种检测方法是否适用于HTS项目18。Z因子的计算公式为 Z = 1 – 3 (σp + σn)/(μp - μn)，其中Z值为1时最为理想，0.5至1之间为优秀，低于0.5则为勉强可用。本文所述HTS方案的Z因子为0.89（阳性与阴性对照的标准差分别为 σp = 6.67 RFU/min 和 σn = 0.788 RFU/min；阴性与阳性对照的平均反应速率分别为 μp = 196.1 RFU/min 和 μn = -7.67 RFU/min），表明该检测方法非常适用于高通量筛选。
该检测在最终体积中可耐受高达2%的DMSO，不会显著降低检测信号或影响酶的功能。先...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助（项目编号：AI082190，授予 T.J.D.）以及加州再生医学研究所（项目编号：TB1-01186 和 CL1-00502）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| HEPES | Teknova | H1021 | |
| 吐温-20 | 菲舍尔科技 | BP337-100 | |
| 甲醇（HPLC级） | 西格玛-奥德里奇 | 34860 | |
| 异丙醇（HPLC级） | 西格玛-奥德里奇 | 650447 | |
| 96孔黑色检测板 | 康宁 | 3915 | |
| 384孔低体积黑色检测板 | 格瑞纳 | 788076 | |
| SNAPtide FITC/Dabcyl 底物 | List 生物实验室 | 521 | 基于FRET的肉毒杆菌神经毒素A型轻链底物 |
| 针头清洁液 | V&P 科学公司 | VP 110 | |
| 无尘擦拭纸 | V&P 科学公司 | VP 540DB | |
| Biomek 密封盖和样品用铝箔盖 | 贝克曼库尔特 | 538619 |
参考文献
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