用于鉴定和表征肉毒杆菌神经毒素轻链调节剂的高通量兼容 FRET 平台

Summary

肉毒杆菌神经毒素 A 型轻链 （BoNT/A LC） 是一种金属蛋白酶，可进入运动神经元，裂解其底物 SNAP-25，并破坏神经传递，从而导致弛缓性麻痹。利用高通量兼容的基于 FRET 的分析，可以筛选大样本库对 BoNT/A LC 酶活性的影响。

Abstract

肉毒杆菌神经毒素 （BoNT） 是一种强效且可能致命的细菌毒素，它与宿主运动神经元结合，内化到细胞中，并裂解对神经递质释放至关重要的细胞内蛋白质。BoNT 由介导宿主细胞结合和内化的重链 （HC） 和轻链 （LC） 组成，轻链 （LC） 裂解乙酰胆碱释放所必需的细胞内宿主蛋白。虽然抑制毒素结合/内化的疗法的给药时间窗口较短，但靶向细胞内 LC 活性的化合物的给药时间窗口要大得多，鉴于毒素的半衰期极长，这一点尤其重要。近年来，小分子药物作为潜在的液相色谱抑制剂被大量分析，因为相对于大型治疗药物（肽、适配体等），小分子的细胞通透性更高。先导化合物鉴定通常涉及高通量筛选 （HTS），其中根据小分子调节治疗靶点功能的能力筛选大型小分子文库。在这里，我们描述了一种基于 FRET 的分析方法，该方法使用市售 BoNT/A LC 底物和重组 LC，可以自动处理潜在 BoNT 抑制剂的 HTS。此外，我们描述了一种可用于后续二次筛选或比较几种候选化合物效力的手动技术。

Introduction

肉毒杆菌神经毒素 A （BoNT/A） 是目前已知的最有效的毒素 （LD₅₀ ~1 ng/kg）¹，是一种由肉毒杆菌产生的强效神经毒素。在受影响的宿主体内，BoNT/A 通过结合运动神经元、内化到胞质溶胶中并最终裂解乙酰胆碱胞吐作用所必需的神经元蛋白来破坏神经肌肉接头处的神经传递。一旦进入神经元，BoNT/A 可以持续长达数月²。乙酰胆碱释放的长期抑制会阻碍正常的肌肉收缩，并导致弛缓性麻痹，在严重的情况下，可能导致心脏和/或呼吸衰竭。由于其极强的效力、易于产生和在宿主内的长期影响，CDC 已将所有 BoNT 血清型标记为高风险生物恐怖主义剂。

毒素的作用机制涉及许多步骤，包括与神经元表面受体结合、通过受体介导的内吞作用进行细胞摄取以及转位到神经元胞质溶胶中。BoNT/A 由两条链组成，一条重链和轻链，两条链都需要毒性。重链 （HC） 包含结合和易位结构域，而轻链 （LC） 是一种锌依赖性金属蛋白酶，可从内体转位到细胞质。一旦进入胞质溶胶，LC/A 金属蛋白酶定位于细胞质内膜并裂解膜结合的宿主蛋白 SNAP-25。SNAP-25 是 SNARE（可溶性 N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体）蛋白家族的成员，在乙酰胆碱胞吐作用中起关键作用（在参考文献³ 中综述）。SNAP-25 的 LC/A 切割会损害 SNARE 复合物功能，从而抑制乙酰胆碱神经递质的释放并损害肌肉收缩。

目前，肉毒杆菌中毒的治疗是有限的，通常包括给予马中和抗体⁴;然而，由于毒素迅速内化到神经元中，抗体的给药时间窗口很窄。因此，许多研究人员认为 BoNT/A LC 可能是更好的治疗靶点。由于 LC 是一种锌依赖性金属蛋白酶，因此抑制 LC/A 活性的一种方法是开发螯合活性位点锌离子的化合物。例如，异羟肟酸盐化合物可螯合活性位点锌，并具有出色的体外效力（迄今为止最好的 BoNT/A LC 小分子抑制剂的 K_i 为 77 nM）⁵。然而，由于体外或体内的各种问题，包括水溶性差、代谢快速和/或细胞毒性高，许多小分子药物未能作为治疗药物取得进展。因此，需要具有改进药理学和药代动力学特性的新化合物。小分子化合物鉴定通常涉及高通量筛选 （HTS） 以鉴定新型支架。BoNT/A LC 活性筛查的初始方法基于短肽底物裂解的 HPLC 检测，该方法非常耗时且不适合 HTS 应用^6-8。随后，Schmidt 及其同事⁹ 开发了一种高通量 BoNT/A 液相色谱活性测定法，该方法利用共价连接到微量滴定板上的荧光素标记的肽底物。BoNT/A LC 裂解底物并释放荧光素，可以用荧光计定量。该测定的板形式允许同时筛选多种化合物;然而，该检测需要用荧光素标记合成肽，并用衍生的底物分子包被检测板，这些都是繁琐的技术。Schmidt 等人后来描述了一种更简单的低浓度 BoNT/A LC 活性检测方法，其中利用一系列荧光底物实时监测 BoNT LC 活性¹⁰。文献中描述的其他技术包括基于共振能量转移的测定后去极化，用于检测和量化粗提取物中的 BoNT 活性;该方法可用于高通量应用^10,11，尽管它需要复杂的设备来测量荧光共振能量转移 （FRET） 和偏振信号。最后，已经报道了几种基于细胞的 BoNT 中毒模型（在参考文献¹¹ 中综述），这将使研究人员能够研究前面提到的化合物的通常限制性特性，包括细胞毒性、细胞通透性和稳定性。然而，大多数现有的基于细胞的检测方法都不适合 HTS，并且需要大量人力和时间。

在本文中，我们描述了一种利用市售基于 FRET 的 BoNT/A LC 底物的 HTS 方法的详细方案。底物基于 SNAP-25 切割序列，是一种合成的 13 聚体肽，包含末端荧光团和淬灭基团。BoNT/A 切割分离了荧光基团和淬灭基团，消除了 FRET 并增加了测得的荧光，可以在荧光计读板器中连续测量。该检测试剂盒在我们实验室和其他实验室中常规用于鉴定新类别的 BoNT/A LC 抑制剂或确定先前鉴定的化合物的相对效力^5,12-15。该测定法适用于 HTS，因为它简单、自动化潜力大、材料成本低，并且能够同时筛选多种化合物（参见参考文献¹⁶;Caglič et al.，提交;Bompiani 等人，正在准备中）。除 HTS 外，该测定还可用于通过测定化合物的 IC₅₀ 值（抑制 50% BoNT/A LC 活性所需的浓度）来比较化合物的相对效力。该分析可以以 96 孔格式（方案文本的手动筛选部分）手动进行，也可以以 384 孔格式进行 HTS（方案文本的自动作部分）自动进行。

Protocol

手动筛查或 IC₅₀ 测定

该方案可用于通过制备化合物的稀释系列来确定化合物的相对效力（IC₅₀ 值），或手动筛选单一浓度的小分子抑制剂。

1. 缓冲液、试剂和所需仪器的制备

1. 准备 50 ml 测定缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.4 和 0.01% Tween-20）并过滤灭菌。缓冲液可在室温 （RT） 下储存数月。
2. 在检测缓冲液中制备 70 nM 重组肉毒杆菌神经毒素/A 轻链 （LC/A （1-425））¹⁷ 的工作稀释液，轻轻涡旋并储存在冰上。每种化合物的检测需要至少 120 μl LC/A 工作稀释液。
3. 在含有 10% DMSO 的测定缓冲液中制备 7 μM 基于 FRET 的 BoNT/A LC 底物工作稀释液。最初，在适当体积的 100% DMSO 中稀释 5 mM 底物储备液，然后缓慢（逐滴）加入检测缓冲液，同时轻轻混合。用箔纸包裹并储存在冰上。每种化合物的测试需要至少 130 μl 底物工作稀释液。
4. 配置荧光微量滴定读板器以中速摇动板 10 秒，然后在室温下每 5 分钟（动力学模式）监测 490 nm 和 523 nm 激发和发射波长的荧光，持续 90 分钟。请注意，产物形成（即荧光的增加）在这段时间内是线性的（图 1A）。

2. 化合物稀释系列的制备

1. 确定化合物浓度范围（即稀释系列中的稀释次数和稀释因子）;根据预期的 IC₅₀ 值选择浓度范围，以确保最佳曲线拟合。对于 IC₅₀ 未知的化合物，使用未稀释的化合物储备液作为最高化合物浓度。
2. 用适当的化合物名称和浓度标记试管。
3. 将 100% DMSO 分装到所有试管中，以准备用于化合物连续稀释。建议至少使用 2 μl 的最终稀释体积，其中检测板中每孔使用每种浓度 1 μl。例如，标准的 1：3 稀释系列需要每管混合 2 μl 化合物和 4 μl DMSO。
4. 制备化合物的连续稀释液，并涡旋或在每次稀释之间手动充分混合;在每次稀释之间更换移液器吸头。对于标准的 1：3 稀释系列，将 2 μl 未稀释的化合物加入稀释系列的第一管中的 4 μl DMSO 中并充分混合。使用新的移液器吸头，去除 2 μl 第一种稀释液，并在第二管中加入 4 μl DMSO;搅拌均匀。对剩余的稀释液重复上述步骤。确保化合物稀释液充分混合，以确保化合物浓度准确。
5. 盖上化合物管并在 RT 下放置。

3. 板制备和点样（表 1）

1. 获得平底、不透明的黑色 96 孔板。请参阅表 1 中推荐的板设置，其中每个化合物稀释系列都以 96 孔板的行为单位。手动将 1 μl 相应的化合物稀释液直接分配到每个相应孔（孔 1-9）的底部。分配 1 μl 最高浓度的待测化合物至第 11 孔（化合物内在荧光对照）。
2. 手动将 1 μl 已知有效的抑制剂分配到 12 孔（阳性对照）中，将 1 μl 100% DMSO 分配到 10 孔（阴性对照）中。
3. 使用自动移液器，将 79 μl 测定缓冲液分配到孔 1-10 和 12 的一侧（化合物稀释和阳性对照），将 89 μl 分配到孔 11 的一侧（化合物内在荧光对照）。确保不要将尖端接触存在化合物的孔底部，以免交叉污染孔。
4. 涡旋 LC/A 工作稀释液，并使用自动移液器向每个孔的一侧添加 10 μl，但 11 孔（化合物本征荧光对照）除外。轻轻敲击板，确保所有添加的酶都进入孔底部。
5. 轻轻混合、盖上并在室温下孵育板 5 分钟。该孵育为化合物在添加底物之前与 LC/A 结合提供了一个预平衡步骤。

4. 底物添加和荧光测量

1. 轻轻涡旋 BoNT/A LC 底物，并使用自动移液器将 10 μl 底物添加到每个孔的另一侧。确保将底物添加到与之前添加酶的位置相反的孔侧。
2. 轻轻敲击板以混合试剂，立即放入读板器中，并使用先前在步骤 1.4 中指定的设置开始荧光测量。
3. 酶速度是根据反应线性期间相对荧光单位 （RFU） 与时间的关系图生成的线的斜率计算得出的。

表 1.建议的检测板布局。

<表 border="1"> 井 # 井描述 复合 检测缓冲液 酶作用物 立法会 DMSO 1 复方剂量 1 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 阿拉伯数字 复方剂量 2 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 3 复方剂量 3 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 4 复方剂量 4 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 5 复方剂量 5 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 6 复方剂量 6 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 7 复方剂量 7 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 8 复方剂量 8 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 9 复方剂量 9 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 --- 10 阴性对照
（100% LC 活性） --- 79 微升 10 微升 10 微升 1 微升 11 化合物本征荧光对照 1 微升 89 微升 10 微升 --- --- 12 阳性对照
（0% LC 活性） 1 微升 79 微升 10 微升 10 微升 ---

用于高通量筛选的自动化作

5. 缓冲液、试剂、化合物板、条形码和所需仪器的制备

1. 在室温下解冻密封的复合储备板至少 1 小时。
2. 准备 500 ml（或更多，取决于要筛选的化合物数量）的测定缓冲液（40 mM HEPES，pH 7.4 和 0.01% Tween-20）并过滤灭菌。过滤后的检测缓冲液可在 RT 中储存数月。
3. 在检测缓冲液中制备 8.75 nM 重组 BoNT/A LC （1-425） 工作稀释液，涡旋并储存在冰上。小体积 384 孔板中的每个孔需要 8 μl。准备 10-15% 的过量，或大约 3.7 ml 或每个低容量 384 孔板。
4. 在含有 10% DMSO 的测定缓冲液中制备 3.5 μM 基于 FRET 的 BoNT/A LC 底物工作稀释液。最初，在适当体积的 100% DMSO 中直接稀释 5 mM 底物储备液，然后在轻轻混合的同时缓慢（逐滴）添加检测缓冲液。用箔纸包裹并储存在冰上。小体积 384 孔板中的每个孔需要 2 μl。为每个低容量 384 孔板准备 10-15% 的过量或大约 1 ml。
5. 为每个黑色、384 孔、小容量微量滴定板 [检测板] 准备条形码，并将标签直接贴在条形码扫描仪可以读取的板一侧;确保标签没有延伸到板侧，否则可能会干扰板的处理和堆叠。按数字顺序堆叠板并放在一边。盖上顶板。请注意，此步骤是可选的，但当使用多个板时，有助于将结果追踪到相应的化合物。
6. 在 RT 下以 200 x g 的速度离心解冻的密封储备复合板 30 秒。小心地取下板密封件，确保去除任何残留的粘合剂，并用干净的塑料盖住板以防止蒸发。请注意，如果板表面存在任何粘合剂，则可能会干扰自动盖子转移和板堆叠。将带盖的板放在连接到液体处理器的酒店中。不要让板不加盖，否则会发生蒸发。
7. 配置堆叠荧光微量滴定板读数器，以分别在 490 nm 和 523 nm 的激发和发射波长下读取每个检测板的荧光，每 30 分钟（动力学模式）在 RT 下进行 3-6 个循环。

6. Pin 工具的准备

1. 目视检查 384 头销工具是否有任何异常，包括翘曲、碎裂或大碎屑。
2. 在三个单独的托盘中加入大约 1 in 的 100% 甲醇（HPLC 级）、100% 异丙醇（HPLC 级）和用超纯水稀释的针式工具清洁溶液。
3. 用 100% DMSO 填充液体处理器上的清洁站。
4. 将 2-3 张干净的新吸墨纸堆叠在一个托盘中。在 z 轴上校准机器人非常重要，这样引脚就会接触到吸墨纸，但不会刺穿吸墨纸。
5. 将风扇附件固定到工作区域，以便在清洗后干燥销钉。
6. 将针工具连接到液体处理器的机械臂上，并通过浸入 DMSO 进行预清洁，在吸墨纸上干燥，在清洁溶液中浸泡 2 分钟，在吸油纸上干燥，浸入异丙醇中，在吸墨纸上干燥，浸入甲醇中，在吸墨纸上干燥，最后在风扇上干燥。

7. 小容量液体分配器的制备

1. 将小容量 （1-10 μl） 盒连接到液体分配器上，并将废液管线连接到适当的容器。
2. 目视检查盒的分液喷嘴，检查它们是否翘曲、撕裂或堵塞。保持通道和喷嘴清洁很重要，因为降水和碎屑会影响液体分布。
3. 通过将 30 ml 超纯水、30 ml 70% 乙醇，然后再次将 30 ml 超纯水直接倒入废液容器中来灌注通道。
4. 将小体积 384 孔检测板放入液体分配器中，并向每个孔中加入已知体积的水。目视检查以确保每个孔的体积正确，并且孔之间没有溢出或分配溶液。
5. 用空气灌注试管约 5 秒钟，以去除水分并干燥通道。

8. 将 BoNT/A 轻链分配到检测板中

1. 将液体分配器进气管浸入 BoNT/A LC 工作溶液中，灌注以去除任何空气，然后将 8 μl 分配到小体积 384 孔分析板的每个孔中。请注意，板可以手动定位在液体处理器的工作区域，也可以使用连接的板组自动定位和重新堆叠。
2. 用干净的塑料盖盖住每个板，并堆叠在连接到液体处理器的板架的不同列中。不要保持板未密封，否则会发生蒸发。
3. 将 30 ml 超纯水、30 ml 70% 乙醇、30 ml 超纯水直接倒入废液容器中，清洁液体分配器。
4. 用空气灌注试管约 5 秒钟以干燥通道。

9. 将化合物冲压到检测板中

1. 在液体处理器平台上为化合物板、分析板和装有清洁溶液的容器分配区域。
2. 对液体处理器进行编程，将化合物板和检测板放置在指定位置，并在冲压前取下板盖。
3. 将 50 nl 化合物直接印入含有 8 μl BoNT/A LC 的测定板中。校准冲压程序时，确保针脚浸没，但不要划伤检测板的底部。请注意，在 100% DMSO 中添加化合物可能会在分散时产生酶变性的局部区域。因此，应注意通过将仅 DMSO 对照与未处理的对照（即未添加 DMSO 的酶）进行比较来评估酶变性水平。
4. 每块板后，通过浸入 DMSO 清洁针脚，在吸墨纸上干燥，在吸墨纸上晾干，在甲醇中浸入，在吸油纸上干燥，最后在风扇上干燥。
5. 用酶在测定板中印记化合物后，将储备化合物板和测定板分别堆叠。盖上堆栈中的顶部分析板以防止蒸发并放在一边。确保在 RT 下将 LC 与化合物孵育至少 5 分钟;在冲压大量板时，可以使用更长的孵育时间。

10. 将底物分配到检测板中

1. 将液体处理器的进气管浸入 BoNT/A LC 底物工作溶液中，避光保存。检查分配喷嘴以确保它们干燥且没有堵塞。灌注通道以去除所有气泡。
2. 解开检测板，将 2 μl 底物的工作稀释液分配到每个孔中。检查底物是否直接分配到每个孔中。堆叠板，将一个空检测板放在第一个板的顶部，将一个空板放在堆栈中的底板下方，以防止在读板器中读取和重新堆叠过程中蒸发。

11. 荧光测量

1. 立即将检测板堆栈加载到荧光读板器中。
2. 使用先前在步骤 5.7 中指定的设置开始荧光测量。每种化合物的测定速率是根据相对荧光单位 （RFU） 随时间变化的图表计算的。请注意，重要的是要包括阴性对照 （DMSO） 以获得未抑制的速率;也可以向每个板中添加具有已知抑制剂的阳性对照。来自单个时间点的代表性输出如图 2 所示。

12. 清理

1. 使用滚筒用铝箔密封密封每个复合储备板，并储存在 -80 °C。
2. 读取每个检测板后，丢弃板、生物危害废物中任何剩余的 LC/A 或底物稀释液。

Results

基于 FRET 的 BoNT/A LC 分析可以以低通量方式手动进行，以表征已知的抑制剂或筛选小文库;或者，该方案可以按比例缩小并自动化，用于大文库的高通量筛选 （HTS），以鉴定新型 BoNT/A LC 抑制剂。无论采用哪种方法，当 BoNT/A LC 与底物一起孵育时，应观察到荧光随时间增加（图 1A 显示了荧光随时间变化的代表性图）。如果测试化合物的连续稀释度，则通常会获得一系列具有不同斜率的谱线（图 1B）。此处描述的板布局中的孔 10 用作阴性对照，因为仅添加了载体 （DMSO）;该反应的速率定义为"100% 酶活性"（或未抑制活性），并且在化合物存在的情况下，可以将速率标准化为该速率以获得相对速率或抑制百分比。孔 11（化合物内源荧光对照）和 12（阳性对照）应显示水平曲线（即斜率接近 0）。

当使用化合物的连续稀释液进行测定时，反应速率（测定斜率）与抑制剂浓度的关系图可用于确定 IC₅₀（图 1C）。应选择稀释范围，使图呈 S ...

Discussion

本文描述的基于FRET的BoNT/A LC测定代表了一种有吸引力的方法，用于识别和表征调节BoNT/A LC活性的小分子。该测定基于溶液的性质使该协议适用于协议文本的“自动作”部分中描述的高通量筛选。Z因子通常用于确定测定对HTS活动的适用性¹⁸。确定为 Z = 1 – 3 （σ_p + σ_n）/（μ_p - μ_n），Z 因子为 1 是理想的，0.5-1 之间是极好的，小于 0.5 是边际的。此处描述的HTS方案的Z因子为0.89（阳性和阴性对照的标准偏差分别为σ_{p =} 6.67 RFU / min和σ_n = 0.788 RFU / min;阴性和阳性对照的平均速度分别为μ_p = 196.1 RFU / min和μ_n = -7.67 RFU / min），这表明该测定非常适合HTS。

该测定在最终体积中耐受高达 2% 的 DMSO，而不会显着降低测定信号或影响酶功能。先前的研究还表明，0.0...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
HEPES	Teknova	H1021
Tween-20	Fisher Scientific	BP337-100
甲醇（HPLC 级）	Sigma-Aldrich	34860
异丙醇（HPLC 级）	Sigma-Aldrich	650447
96 孔黑色检测板	Costar	3915
384 孔低容量黑色检测板	Greiner	788076
SNAPtide FITC/Dabcyl 底物	列表 生物实验室	521	基于 FRET 的 BoNT/A LC 底物
针式清洁溶液	V&P Scientific	VP 110
无绒吸墨纸	V&P Scientific	VP 540DB
Biomek 密封和样品铝箔盖	Beckman Coulter	538619