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方法文章

小鼠右心的超声心动图评估

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DOI：

10.3791/50912

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2013年11月27日

 ,  ,  , 
1Division of Cardiovascular Medicine, Vanderbilt University Medical Center, 2Pulmonary and Critical Care Medicine, Vanderbilt University Medical Center

本文内容

摘要

本文提供了一种用于评估小鼠右心室大小和肺动脉高压的超声心动图检查方案。应用范围包括心肌病和肺血管疾病转基因及毒素诱导小鼠模型的表型确定以及系列评估。

摘要

肺动脉高压（PAH）的转基因模型和毒性模型被广泛用于研究PAH的病理生理机制并探索潜在治疗方法。鉴于构建疾病动物模型所需的成本和时间较高，研究人员必须具备能够准确评估疾病表型表达的工具。右心室功能障碍是肺动脉高压的主要表现。超声心动图是评估啮齿类动物模型右心室功能的主要无创手段，其优势在于可直接转化为临床应用，因为在人类患者中也使用相同的检测工具。目前尚缺乏针对PAH小鼠模型的已发表超声心动图操作方案。

本文介绍了一种用于评估携带显性负性BMPRII突变的肺动脉高压（PAH）小鼠模型中右心室及肺血管功能的实验方案；然而，该方案同样适用于任何影响肺血管系统或右心功能的疾病。我们详细描述了动物准备、图像采集，以及每搏输出量、心输出量和肺动脉压力估算值的血流动力学计算方法。

引言

肺动脉高压（PAH）动物模型及人类患者中，肺动脉压力升高和右心室（RV）功能障碍是肺血管疾病的典型特征。转基因模型以及毒性诱导模型（例如野百合碱或低氧模型）被广泛用于研究PAH的病理生理机制，并探索潜在治疗方法。鉴于构建疾病动物模型所需的成本和时间较高，研究人员必须具备能够准确评估疾病表型表达的工具。

超声心动图是评估啮齿类动物模型心室功能的主要无创方法1,2。超声心动图的优势在于其向人类临床的转化具有高度一致性，因在人类中也使用相同的检测工具。此外，某些基因模型存在不完全外显率3；通过无创手段识别出受影响的动物个体，可节省宝贵的时间和资源。在不处死动物的情况下对疾病严重程度进行无创评估，还使研究人员能够连续追踪研究探索性治疗的效果。鉴于转化治疗手段向人类临床试验推进的速度较快，这一点尤为重要4,5。

在人类中，由于右心室位于胸骨后方且形状不规则，通过超声心动图评估右心室大小和肺动脉高压尤为困难6。啮齿类动物模型还面临体积小和心率极快（300-700 次/分钟）的额外挑战。近年来，随着帧率的提高和探头尺寸的减小，图像质量得到显著改善，部分实验方案甚至实现了清醒状态下的成像，尽管大多数啮齿类动物成像仍在麻醉下进行7,8。已有研究详细描述并验证了肺动脉高压大鼠模型中的优质超声心动图实验方案，其结果与磁共振成像（MRI）及有创血流动力学测量均具有良好一致性1,9。然而，目前尚缺乏关于肺动脉高压小鼠模型的已发表超声心动图操作方案。

本文介绍了一种用于评估肺动脉高压（PAH）小鼠模型中右心室（RV）及肺血管功能的实验方案，该模型携带显性负性BMPRII突变，同时介绍了一种通过肺动脉缩窄建立孤立性右心室后负荷模型的方法；然而，本方案同样适用于任何影响肺血管系统或右心功能的疾病研究。我们将描述动物准备过程，以及对右心室大小和功能、主肺动脉（PA）大小的详细评估方法。此外，本文还展示了估算每搏输出量和心输出量所需的技术与计算方法。由于技术限制，无法通过多普勒方法准确估测肺动脉压力，但我们采用了经过充分验证的人类替代指标——肺动脉加速时间，用于估测肺动脉压力。

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方案

1. 仪器准备 

  1. 检查超声探头是否存在缺陷。根据所用设备的不同，此步骤可能无需执行。
    1. 若观察到气泡，请拧下位于传感器头部右侧的螺丝，使用26 G针头通过孔洞加入无菌水。传感器头部内部出现气泡较为常见，气泡会妨碍高质量图像的获取。
    2. 检查探针上的膜是否有泄漏或孔洞，必要时进行更换。
  2. 打开软件并初始化探头。
    1. 从下拉菜单中选择心脏检测程序包及相应的探头。单击 "初始化"使用20-60 MHz探头检测体重小于35 g的小鼠，使用15-45 MHz探头检测体重大于35 g的小鼠。
    2. 选择操作人员、动物 & 在人口统计信息页面输入日期，并选择 "开始".

2. 小鼠准备，包括麻醉、脱毛和体位固定 

  1. 麻醉：将小鼠放入诱导室中，使用便携式台式麻醉机进行麻醉，该麻醉机配备异氟烷蒸发器和废气收集装置。
    1. 将蒸发器设置为3%，氧气流速为3 L/min。这种相对较高的麻醉浓度可实现快速麻醉效果，从而最大限度地减少可能影响心脏功能的应激反应。 由于本方案持续时间较短，因此可将对动物的潜在风险降至最低。 必须始终维持相同的麻醉浓度，这一点极为重要。本方案已针对仅使用异氟烷作为麻醉剂的条件进行了优化，因此其他麻醉剂的最佳条件可能与此不同。可根据实验需求选择较浅的麻醉深度，但一旦确定麻醉方案，便不得更改。麻醉会影响心率及其他血流动力学参数，因此若在实验过程中改变麻醉深度，所得数据可能无法用于分析。若需在同一天对多只小鼠进行成像，应分别对每只小鼠实施麻醉。
    2. 监测室温，确保各实验组之间保持一致。即使小鼠置于加热台上，室温仍可能影响血管反应性，因此在需要相互比较的实验组之间，应监测并维持相同的室温。 尽管本方案不直接测量动物体温，但恒定的环境温度和加热台温度可确保各实验组之间的体温差异极小。
  2. 脱毛：在小鼠麻醉后，使用脱毛膏去除胸部毛发。使用棉签从锁骨处开始涂抹，并向下延伸至膈肌稍下方。
    1. 将小鼠放回麻醉诱导室1分钟，使脱毛膏充分作用。为判断麻醉是否有效，可用指甲用力按压小鼠的一只脚掌。若无回缩反应，则表明麻醉充分；若肢体出现回缩，应将小鼠再次放回麻醉诱导室1分钟。
    2. 在小鼠眼睛上涂抹少量润滑眼膏，以防止角膜受损。
    3. 使用一块2英寸×2英寸的纱布擦除胸部毛发。脱毛膏中的化学成分具有腐蚀性，若停留皮肤时间过长会损伤皮肤，因此需仔细彻底清除皮肤上残留的脱毛膏。
    4. 脱毛后涂抹皮肤保湿剂。
  3. 体位固定：将小鼠仰卧置于设定为37 °C的加热台上。正确的体位对于获取高质量图像至关重要。应使用能够监测体温、呼吸和心率的加热台。采用集成导轨系统有助于实现精确定位，进而优化图像质量。
    1. 轻轻用胶带固定小鼠四肢，并在胸部涂抹约硬币大小的超声耦合凝胶。

3. 图像采集：胸骨旁长轴切面成像 

  1. 将超声探头锁紧在导轨系统支架内，并逆时针旋转10°，使探头的金属部分正对心脏。更具体地说，探头应位于胸部左侧，第2或第3肋间隙，且位于胸骨外侧。
    1. 调节导轨系统上的x- 轴和y-轴，直至获得正确的图像视野。
    2. 选择"B模式"，该选项位于系统控制台的右上区域，用于显示二维实时图像。
    3. 在显示器上观察以下解剖结构：
      1. 从心尖到主动脉的整个心脏——心尖位于屏幕最左侧，主动脉位于最右侧。
      2. 左心室（LV）腔
      3. 左心室后壁（LPW）
      4. 室间隔（IVS）
      5. 右心室（RV）腔
      6. 前、后二尖瓣瓣叶（AML & PML）
      7. 升主动脉（AO）
      8. 左心房（LA）
  2. 在此视野下，按下扫描/冻结按钮"冻结"图像，获取主动脉的一条径线测量值。然后使用鼠标向后拖动图像底部的视频循环，直至左心室处于收缩期，主动脉达到最大直径。
    1. 点击屏幕左上角的测量工具，选择形似斜线的图标。按鼠标左键，从主动脉前壁至后壁画一条与其长轴垂直的直线。按下"图像存储"按钮保存测量结果。
    2. 按下"动态图像存储"按钮创建视频循环。

4. 图像采集：胸骨旁短轴切面成像 视图

  1. 将换能器重新定位至3点和 9点钟位置（横向）。通过调整探头架，轻微向尾侧倾斜，以获得主动脉和左心室腔的最佳视野。金属探头将水平放置，并直接位于胸骨上方。
    1. 操纵 x- 并调整轨道系统上的x轴和y轴，直至获得正确的视野。此时可见左心室腔，以及在显示器右侧可见的前外侧和后内侧乳头肌。此为短轴切面的标准参考位置，指示左心室的中段，此处用于进行容积测量。轻微偏离该参考点的x轴 根据上述视图进行定位说明，必要时可通过调整 x 轴和 y 轴以观察不同的解剖结构。
  2. 在短轴切面中获取以下测量值：
    1. B模式
      1. 主动脉的另外两个径向测量。
      2. 肺动脉流出道的三次测量
    2. 脉冲波多普勒模式（PW）
      1. 主动脉血流速度-时间积分测量三次（VTI）
      2. 肺动脉在肺动脉瓣近端处测量的三次VTI值。
      3. 通过追踪从血流开始至峰值速度的VTI曲线，测量肺动脉加速时间。
    3. M模式
      1. 舒张期左心室腔内径（LVIDd）的三次测量
      2. 左心室收缩期内径（LVIDs）的三次测量
      3. 右心室内径（RVID）的三次测量。仅当右心室扩张时，此切面方可显示右心室腔。
      4. 通过M型超声在三个不同心动周期中，测量左心室前壁两个舒张期峰值之间的距离，以此测量心率三次。
  3. B模式测量：
    1. 从乳头肌切面开始，将Y轴向头侧移动，直至主动脉半月瓣清晰对焦。
    2. 在主动脉瓣上方最大直径处获取主动脉的测量值。
    3. 单击屏幕左上角的测量工具，然后选择类似对角线的图标。
    4. 左键单击鼠标，从主动脉前壁向后壁画一条直线。
    5. 操纵 x- 直至主肺动脉分叉处。该结构在显示器上位于主动脉前方且偏右侧。
    6. 将y轴向上移动，直至主肺动脉的环状结构显现。其轮廓不如主动脉清晰。
    7. "冷冻" 获取收缩期的图像并进行测量。
    8. 总共采集三个测量值。
  4. 脉冲波（PW）多普勒测量：PW模式主要用于评估动脉和静脉中的血流动力学。在本方案中，将用于获取主动脉和肺动脉的三个速度-时间积分测量值。
    1. 按照步骤4.3.1及第1个要点所述，重新将主动脉置于视野中。
      1. 选择 "PW 模式"位于系统控制台右上角，可获取主动脉血流的多普勒读数。
      2. 将样本体积置于主动脉瓣水平稍上方。x- x轴和y轴可能需要略微调整，以获得足够的多普勒包络。包络应具有白色边框，内部为空心，表示层流血流。
      3. 获得足够视野后， "冷冻" 图像并勾勒多普勒频谱包络的边界，以计算速度时间积分（VTI）。
      4. 旋转 "角度" 将系统控制台上的旋钮顺时针旋转，直至显示器右上方图像中可见的分段黄色线条位于0°位置。该黄色线条代表血管内血流的方向。由于探头本身呈一定角度，以获得心脏的横断面或横向视图，因此必须将该线条调整至0°，以与升主动脉内垂直方向的血流对齐。
    2. 将取样容积置于右心室流出道中央，靠近肺动脉瓣水平处，重复上述 VTI 测量。血流方向在显示器上应显示为反向，即与主动脉血流方向相反。
  5. M型超声测量： M型超声成像可沿单条超声束方向提供组织运动的高时间分辨率，用于量化心腔尺寸，并研究瓣膜、心肌及血管壁的运动。
    1. 简历 "B模式" 并重新定位换能器以获取 "参考视角" （乳头肌水平左心室的横切面视图）。
    2. 按压 "M型超声"这将生成一段连续的视频流，其中以下解剖结构的运动将清晰可见 "带状结构"若扩张，右心室腔在图像顶部呈现为一条极细的黑色条带。室间隔（IVS）位于右心室腔下方，显示为一条不透明的条带。左心室腔位于室间隔正下方，表现为占据图像大部分区域的较大黑色区域。左心室腔下方为左心室后壁（LVPW），呈现为一条不透明的条带。
    3. 冻结图像，如有需要，可倒退视频循环至呼吸未发生的时间点。当小鼠呼吸时，膈肌和胸壁的运动将干扰图像采集，从而导致图像扭曲 "涂抹" 以固定频率出现在信号中的伪影。
    4. 使用对角线图标获取以下测量值：
      1. 左心室舒张末期内径的三次测量值，表现为室间隔（IVS）与左心室后壁（LVPW）之间的最大距离。
      2. 左心室收缩末期内径的三次测量值，表现为室间隔（IVS）与左心室后壁（LVPW）之间的最短距离。
      3. 通过点击心脏图标并测量左室后壁（LVPW）收缩期峰值到收缩期峰值的时间间隔，获取三次心率测量值。
      4. 如果右心室腔扩张，使用对角线图标获取三个测量值。
    5. 记录短轴胸骨旁切面的视频循环 "B模式" 通过按压 "Cine Store" 按钮
    6. 前往 "文件"，选择 "浏览研究" 要回顾您的测量结果，请点击 "结束会话"，然后 "提交会话数据。"
    7. 按照IACUC协议所述恢复小鼠，并进行清理。
    8. 将数据导出为CSV文件至U盘，以供后续分析。
  6. 计算以下心脏功能参数（表1):
    1. 左心室流出道面积
    2. 左心室每搏输出量
    3. 左心室心输出量
    4. 短轴缩短率
    5. 肺动脉面积
    6. 肺动脉加速时间
    7. 右心室每搏输出量
    8. 心指数

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结果

本方案的主要目标是定量评估右心室（RV）的大小和功能，并了解肺血管病变的程度。为获得准确且可重复的结果，必须对小鼠和超声心动图设备进行适当准备。应去除小鼠胸部的毛发，并用胶带将其四肢固定在成像平台上。通过鼻罩给予麻醉剂（本实验中为异氟烷）。应检查探头是否存在缺陷，特别是气泡，因为气泡会降低图像质量。在小鼠中获取高质量的心脏四腔观图像较为困难，因此本方案重点采用胸骨旁短轴和长轴切面进行右心室评估。相关解剖结构见图1A和图1B。

右心室（RV）大小的最佳评估切面是胸骨旁长轴切面，通过M型超声测量右心室游离壁至室间隔的距离（图2）。该测量仅在右心室扩张时可行，因为正常右心室体积很小。在小鼠中，无法准确测量人类常用的右心室功能指标，如面积变化分数和三尖瓣环收缩期位移。这些测量需要高质量的右心室游离壁图像，而在小鼠中极难获得。然而，可通过脉冲多普勒（PW Doppler）测量右心室流出道（RVOT）水平的流速时间积分（VTI）以及肺动脉直径，从而估算右心室每搏输出量（图3

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讨论

疾病的小鼠模型（无论是转基因模型还是毒素诱导模型）都需要进行表型验证，以确认该模型确实能够重现其所模拟的人类疾病。这种验证通常可通过某一特定特征的出现或缺失来完成，例如肿瘤的形成。然而，对于导致血流动力学异常的模型，如左心室肥厚的主动脉缩窄模型，或我们建立的肺动脉高压（PAH）转基因模型，则较难进行验证。这些模型需要通过终末性血流动力学检测，或借助非侵入性手段来评估血流动力学及心脏功能异常。超声心动图在这些模型中至关重要，因为它能够在无需处死患病动物的情况下，实时定量评估血流动力学和心脏功能14。此外，还可以对同一只动物进行系列成像，以追踪疾病的自然进程或对治疗的反应。根据本方案，我们估计在完成约20次检查后，即可掌握右心超声心动图的操作技能。

在处死动物时，通过超声心动图估算心输出量的能力对于计算肺血管阻力（PVR）也至关重要。由于右心室（RV）体积较小，在本模型中使用导管法测量心输出量往往不可靠。在处死动物时，我们采用导管测量肺动脉收缩压，并将其与超声心动图获得的心输出量结合，用于确定PVR（假设肺毛细血管楔压较低，可忽略不计）。这使得我们能够进一步量化本...

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Vevo 770 高分辨率微型超声系统Visualsonics Inc.在 www.visualsonics.com/products 获取更多信息
带封装换能器的 RMV（实时微视成像）704B 40 mH 扫描头Visualsonics Inc.在 www.visualsonics.com/products 获取更多信息
包含生理监测系统的 Vevo 集成导轨系统Visualsonics Inc.在 www.visualsonics.com/products 获取更多信息
用于 Vevo770 的计算机显示器DELL 或其他通用供应商
用于 Vevo770 的计算机鼠标通用供应商
Vevo770 心脏分析软件包Visualsonics Inc.在 www.visualsonics.com/products 获取更多信息
带异氟烷蒸发器的 VetEquip 便携式台式麻醉机VetEquip在 vetequip.com 获取更多信息
活性炭废气收集容器VetEquip/Vaporguard931401在 vetequip.com 获取更多信息
Puralube 眼部软膏Henry Schein在 henryschein.com 获取更多信息
Ecogel 100 超声耦合凝胶EcoMed Pharmaceuticals30GB在 ecomed.com 获取更多信息
3M Transpore 胶带Fisher Scientific1527-0在 fishersci.com 获取更多信息
小型一字螺丝刀通用供应商
无菌 H2O从水龙头获取 DDI H2O，然后进行高压灭菌
6 英寸棉签Fisher Scientific在 fishersci.com 获取更多信息
Nair（脱毛膏）通用供应商
2 英寸 × 2 英寸纱布块Fisher Scientific在 fishersci.com 获取更多信息

参考文献

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